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1、生物傳感器,中國科學院研究生院 姚 鑫,E-mail: ,學習這門課的目的 通過本課程的學習，了解各類生物傳感器的基本原理、特點、技術方法和應用。了解生物傳感器的及發(fā)展趨勢，為以后從事相關領域研究打好基礎. 參考書 張先恩主編，生物傳感器，化學工業(yè)出版社，北京，2006 布萊恩 R. 埃金斯 著，羅瑞賢等譯，化學傳感器與生物傳感器，化學工業(yè)出版社，北京，2005,幾個生物傳感器的例子,DNA-表面等離子激元共振儀(SPR),多肽-電化學,DNA-電化學,PNA/DNA-SPR,,葡糖淀粉酶,支鏈淀粉,酶-石英晶體微天平,Figure 2. (A) Time courses of freque

2、ncy changes of the amylopectinimmobilized QCM, responding to the addition of glucoamylase at (a) 16, (b) 27, (c) 38, and (d) 54 nM. The curve (e) shows the hydrolysis of the pullulan-immobilized QCM at 540 nM glucoamylase (25 C, 20 mM acetate buffer, pH 4.8, 0.1 M NaCl).,傳感器 傳感器:是一種裝置,是檢測或測量一種物理性質并進

3、行記錄,顯示或以其他方式作出響應.,第一章 緒 論,分析生物技術的一個重要領域便是生物傳感器(biosensor),它是一個典型的多學科交叉產物,結合了生命科學、分析化學、物理學和信息科學及其相關技術，能夠對所需要檢測的物質進行快速分析和追蹤。 生物的基本特征之一，是能夠對外界的各種刺激作出反應。其所以能夠如此，首先是由于生物能感受外界的各類刺激信號，并將這些信號轉換成體內信息處理系統(tǒng)所能接收并處理的信號。例如，人能通過眼、耳、鼻、舌、身等感覺器官將外界的光、聲、溫度及其它各種化學和物理信號轉換成人體內神經系統(tǒng)等信息處理系統(tǒng)能夠接收和處理的信號。 生物傳感器的出現(xiàn)，是科學家的興趣和科

4、學技術發(fā)展及社會發(fā)展需求多方面雙驅動的結果，經過30多年的發(fā)展，已經成為一個涉及內容廣泛、多學科介入和交叉、充滿創(chuàng)新活力的領域。,1.1 生物傳感器的發(fā)展歷程,20世紀60年代酶法分析：專一性強、靈敏度高、操作簡便，但是測定周期長。 離子選擇電極( ion selective electrode, ISE)：操作簡單，無需對樣品進行欲處理無試劑分析(non-reagental analysis)，但是只能檢測無機離子 1956 Leland C. Clark Jnr 隔離式氧電極 1962 Leland C. Clark Jnr 酶傳感器( enzyme transducer) 1967 S.

5、 J. Updike 葡萄糖酶電極 1975 Yellow Springs Instrument(YSI) 葡萄糖測定儀 1975 C. Divis 用完整活細胞取代純酶制作傳感器 1977 GA. Rechnitz 用糞便鏈球菌完整活細胞與氨敏電極組合成測精氨酸的微生物電極 1977 Iso Karube和J. Janata 測BOD的微生物傳感器和測抗原的免疫傳感器,隨后出現(xiàn)了細胞器傳感器、細胞傳感器和組織切片傳感器 20世紀70年代中期到80年代，生物技術、生物電子和微電子學不斷地滲透、融合，致使生物傳感器不再局限于生物反應的電化學過程，而是根據生物學反應中產生的各種信息(如光效應、熱效

6、應、場效應和質量變化等)了設計各種精密的探測裝置。 1974 K. Mosbach 熱生物傳感器 1974 Janata 酶場效應晶體管 1980 D. W. Lubbers 和N. Optiz酶光纖傳感器 1983 Giulbault 壓電晶體酶傳感器 1976 A. H. Clemens等報道了以葡萄糖酶電極為基礎的第一個人工腎臟，隨后被Miles公司開發(fā)成生命穩(wěn)定系統(tǒng)Biostator，用于重癥糖尿病人床邊監(jiān)護。 1983 B.Liedberg利用表面等離子激元共振(Surface Plasmon Resonance)方法，能夠適時的對生物親和反應進行檢測，在次基礎上，瑞典Pharmac

7、ia公司在1990年推出商用儀器BIAcore，成為目前研究生物分子之間互相作用最優(yōu)秀的實驗工具。 1984 A.E.G. Cass 首次建立了介體酶電極方法,利用化學介體戊二醛取代分子氧作為氧化還原酶酶促反應的電子受體,促成了1987年美國MediSene 公司開發(fā)成功印刷酶電極.,發(fā)展迅速 文章方面: web of science 中輸入“biosensor”共檢索到10035篇文章，約從1993-2006年。 功能方面：活體( in vivo)測定、多指標測定和聯(lián)機在線(on line)測定。 檢測對象：各種常見的生物化學物質，在臨床、發(fā)酵、食品、化工和環(huán)保等方面均顯示了廣泛的應用

8、前景。,1984 華盛頓召開的國際生物工程年會上將生物傳感器列為當代生物工程的重要領域之一 1985 Elsevier科學出版公司創(chuàng)刊生物傳感器國際學術期刊，1990 更名為生物傳感器和生物電子學(Biosensors 2)凡是酶可以催化的反應,微生物也可以催化; 3)催化速度接近,反應動力學模式近似.,, 微生物反應的特殊性: 1)微生物細胞的膜系統(tǒng)為酶反應提供了天然的適宜環(huán)境,細胞可以在相當長的時 間內保持一定的催化活性; 2)在多底物反應時,微生物顯然比單純酶更適宜作催化劑; 3)細胞本身能提供酶促反應所需要的各種輔助因子和能量; 4)微生物細胞比酶的來源更方便、更便宜. 微

9、生物作為傳感器分子識別元件時不利因素： 1)微生物反應通常伴隨細胞的生長和調亡，不易建立分析標準； 2)細胞是多酶系統(tǒng)，許多代謝途徑并存，難以排除不必要的反應； 3)環(huán)境變化會引起微生物生理狀態(tài)的復雜化,不適當的操作會導致代謝轉換現(xiàn)象, 出現(xiàn)不期望有的反應.,2.3.2微生物反應類型 1)同化與異化 (根據微生物代謝流向) 同化作用(assimilation)或組成代謝: 細胞將底物攝入并通過一系列生化反映轉變成自身的組成物質,并儲存能量. 異化作用(disassimilation)或分解代謝:細胞將自身的組成物質分解以釋放能量或排出體外. 2)自養(yǎng)與異養(yǎng) (根據微生物對營養(yǎng)的要求)

10、 自養(yǎng)(autotrophic):自養(yǎng)微生物的CO2作為主要碳源,無機氮化物作為氮源,通過細菌的光合作用或化能合成作用獲得能量. 異樣(heterotrophic):異養(yǎng)微生物以有機物做碳源,無機物或有機物作氮源,通過氧化有機物獲得能量. 絕大多數微生物種類都屬于異養(yǎng)型.,3) 好氣性與厭氣性 (根據微生物反應對氧的需求與否) 好氧(aerobic)性微生物:在有空氣的環(huán)境中才易生長繁殖的微生物. 厭氧(anaerobic)性微生物:必須在無分子氧的環(huán)境中生長繁殖的微生物. 4)細胞能量的產生與轉移 微生物反應所產生的能量大部分轉移為高能化合物. 高能化合物是指含轉移勢高的基團

11、的化合物,其中以ATP最為重要,它不僅潛能高,而且是生物體能量轉移的關鍵物質,直接參與各種代謝反應的能量轉移. 有兩類反應可以產生ATP.,2.3.3分析微生物學 分析微生物學(analytical microbiology)是利用微生物完成定量分析任務的學科.有些情況下,微生物測定法比化學方法更專一和靈敏,效率亦更高. 細胞增殖和呼吸法最常用.,b,2.4 免疫學反應 免疫指機體對病原生物感染的抵抗能力. 自然免疫是非特異性的,即能抵抗多種病原微生物的損害. 獲得性免疫是特異性的,在微生物等抗原物質刺激后才形成(免疫球蛋白等),并能與該抗原起特異性反應. 2.4.1抗原 1)抗原

12、的定義:抗原(antigen)是能夠刺激動物機體產生免疫反應的物質,但從廣義的生物學觀點看,凡是具有引起免疫反應性能的物質,都可稱為抗原. 抗原有兩種性能: 刺激機體產生免疫應答反應 免疫原性(immunogenicity) 完全抗原(complete antigen,Ag) 與相應免疫反應產物發(fā)生特異性結合反應 反應原性(reactionogenicity),,,,,半抗原(hapten),,2)抗原的種類 按抗原物質的來源,抗原分為三類: (1) 天然抗原 (2) 人工抗原 (3) 合成抗原 3)抗原的理化性質 (1)物理性狀 分子質量對免疫原性的影響: 分子質量越大抗原

13、性越強,原因在于復雜的大分子物質表面抗原決定族較多,化學性質相對穩(wěn)定,在體內存留時間長,降解和排除速率較慢,有利于持續(xù)刺激肌體免疫系統(tǒng),產生免疫應答. 抗原構型對免疫原性的影響:環(huán)壯構型直線構型 聚合態(tài)分子單體分子 (2)化學組成 絕大多數為蛋白質,可為純蛋白質,也可為結合蛋白質,4)抗原決定簇(antigen determinant) 抗原決定簇是抗原分子表面的特殊化學基團，抗原的特異性取決于抗原決定簇的性質、數目和空間排列。 .4.2抗體 抗體(antibody)是由抗原刺激機體產生的具有特異性免疫功能的球蛋白，又稱免疫球蛋白(immunoglobulin,

14、Ig)。人類免疫球蛋白有五類，即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。,圖-免疫球蛋白(Ig)結構模式圖,重鏈(heavy chain,H鏈): 分子質量較大,420- 460個氨基酸組成 輕鏈(light chain,L鏈): 分子質量較小,213- 216個氨基酸組成,2.4.3抗原-抗體反應 抗原抗體的相互作用是所有免疫化學技術的基礎.它們之間的反應是指抗原與抗體之間發(fā)生的特異性結合反應.這種反應可發(fā)生于體內(in vivo),也可發(fā)生在體外(in vitro).體內反應可介導吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用;體外反應則根據抗原的物質性狀、抗體的類型及反應的特點而分為凝聚、沉淀、溶

15、解反應等不同的類型。 抗體與抗原的特異性結合點位于Fab L鏈及H鏈的高變區(qū)(抗體活性中心),其構型取決于抗原決定簇的空間位置,兩者可形成互補性構型. 抗原、抗體結合時準確對位的兩個條件： 結合部位的形成要互補于抗原的形狀 抗體活性中心帶有與抗原決定簇相反的電荷 抗體的特異性是相對的，表現(xiàn)在： 部分抗體不完全與抗原決定簇相對應 即便是針對某一種半抗原的抗體，其化學結構也可能不一樣 抗原抗體結合在一定pH或離子強度下也是可逆的。,,,,基于抗原-抗體反應的檢測技術主要應于以下幾個方面： 1)用已知抗原檢測未知抗體 2)用已知抗體檢測未知抗原 3)定性或定量檢測體內各種大分子物質

16、4)用已知抗體檢測某些藥物、激素等各種半抗原物質 影響抗原-抗體結合反應的因素 1)抗原抗體的性質:抗原-抗體反應的整體強度受3個因素控制:抗體對表位的內在親和力,抗原抗體的結合價以及參與反應成分的立體結構. 2)電解質:抗原抗體發(fā)生特異性結合后,由親水性膠體變?yōu)槭杷阅z體,電極質的存在會使抗原-抗體復合物失去電荷而沉淀或凝集,出現(xiàn)可見反應. 3)酸堿度:蛋白質具有兩性電離的性質,抗原抗體的反應必須在合適的pH環(huán)境中進行. 4)溫度:一般在37,高溫抗原抗體變性,低溫反應太慢.,2.4.4免疫學分析 免疫分析是利用抗體與抗原的特異性結合作用來選擇性識別和測定可以作為抗體或抗原的待測物.抗原-抗

17、體反應的特異性和專一性決定了免疫反應具有很高的選擇性. 1)沉淀法 可溶性抗體與其相應的抗原在液相中相互接觸,可形成不溶性抗原-抗體復合物而發(fā)生沉淀,包括擴散實驗和電泳試驗,此為經典的免疫學實驗,靈敏度水平為g/ml. 2)放射免疫測定法(radiation immunoassay, RIA) 利用放射性同位素示蹤技術和免疫化學技術結合起來的方法,靈敏度高,特異性強,準確度高,重復性好;同位素危害,3)免疫熒光測定法(immuno fluorescent assay) 高度的特異性和敏感性,可定位,serum carcinoembryonic antigen (CEA),4)酶聯(lián)免疫測定法

18、(enzyme linked immunoassay, ELISA) 用酶促反應的放大作用來顯示初級免疫學反應. 靈敏度不高,但是特異性,重現(xiàn)性和準確性很好,成本低,穩(wěn)定性好和操作安全等,應用最廣. 酶免疫分析主要有兩種:夾心法和競爭法. 夾心法要求抗原至少有兩個結合點,不能用于檢測半抗原,多用于測定大分子物質.產生的信號強度與結合在固相上的抗原量成比例關系.,夾心法測抗原示意圖,競爭法產生的信號強度與結合在固相上的酶標抗體量成正比例關系,與樣品中的抗原量成反比關系.主要用于測定小分子抗原.,競爭法測抗原示意圖,5)電化學免疫分析(electrochemistry im

19、munoassay, ECIA) 電化學免疫分析是將免疫技術和電化學檢測相結合的一種標記免疫分析方法. 用作電化學免疫分析的生物酶及反應體系須滿足以下條件: 酶具有高或性,可在短時間內將大量底物分子轉化為產物; 產物具有電化學或性; 酶底物和酶在緩沖溶液中穩(wěn)定; 酶產物的副反應很少; 容易與抗體或抗原結合,且不降低活性; 在測定條件下體系底物非活性.,2.5核酸與核酸反應 2.5.1核酸組成與結構 1)核酸的組成成分 核酸是所有生命體的遺傳信息分子,包括脫氧核糖核酸(DNA, deoxyribonucleic acid)和核糖核酸(RNA, ribonucleic acid).

20、兩類核酸都是由單核苷酸(nucleotide)組成的多聚物.核酸分子中的核苷序列組成密碼,其功能是儲存和傳輸遺傳信息,指導各類型蛋白質的合成. 單核苷酸的組成: 堿基,脫氧核糖或是核糖,磷酸基團,腺嘌呤(adenine,A),鳥嘌呤(guanine,G) 胞嘧啶(cytosine,C), 胸腺嘧啶(thymine,T),DNA的堿基組成 Chargaff規(guī)則的內容 . 所有DNA：A=T、G=C，即A+G=T+C . DNA的堿基組成具有種的特異性， 即不同種的DNA堿基組成不一樣 . 對同一生物物種，DNA的堿基組成 沒有組織和器官的特異性 . DNA的堿基組成不隨年齡、營養(yǎng)狀況及

21、 環(huán)境的改變而改變 Chargaff規(guī)則的意義 該規(guī)則為后來建立DNA雙螺旋結構模型奠定的基礎，并為闡明DNA的生物學功能提供了重要依據。,2) DNA結構 一級結構: 脫氧核苷酸在長鏈上的排列順序 二級結構: 雙螺旋鏈(堿基配對規(guī)則) 氫鍵(最主要的力) 維持雙螺旋鏈穩(wěn)定因素: 堿基堆積力(van der Waals) 分子內部堿基對間的疏水鍵,,Watson和Crick于1953年根據DNA晶體的X-射線衍射 圖譜和Chargaff規(guī)則等數據提出雙螺旋結構。,一級結構,不同構象只是螺距、直徑、 每圈含堿基數目不同,,3) RNA 結

22、構 RNA在細胞中主要以單鏈形式存在,可暫時形成雙螺旋,或自折疊成雙螺旋區(qū)域.,尿嘧啶(uracil,U),2.5.2 DNA變性(denature),核酸的紫外吸收特性 DNA在260nm處有最大的紫外吸收值 因嘌呤堿和嘧啶堿對250280nm的光波有強的吸收作用，對260nm光波的吸收能力最大。 當核苷酸摩爾數相同時，A260的大小有如下關系：單核苷酸 單鏈DNA 雙鏈DNA 從左到右稱為減色效應(hypochromism), 從右到左稱為增色效應(hyperchromic effect)。 DNA的雙螺旋結構比雙螺旋松馳結構對紫外(260nm)的吸收要小，最大可降低約34%。因為DNA

23、雙螺旋結構中的堿基對彼此之間又形成了堿基堆積力，影響了堿基對260nm光的吸收。當DNA雙螺旋松散后，所得的光吸收值幾乎是其組成中所有堿基光吸收值的總和。, DNA的紫外吸收特性的應用 估計核酸樣品的純度 一般：A260/A2801.82.0，DNA純度符合要求 A260/A2802.0,提示DNA樣品中含有RNA 實質 破壞了核酸的空間結構，但不涉及一級結構(共價鍵）的斷裂。 引起變性的因素 加熱（熱變性）、介質中的pH過低或過高、加入有機溶劑、加入尿素等介質中的pH過酸或過堿對DNA雙螺旋結構的影響：過量酸使A、G、C上的氮原子質子化，不利于氫鍵形成；過量堿使G、T上的氮原子去質子化，亦

24、不利于氫鍵形成。 高溫時DNA雙鏈會分離,稱為解鏈(melting).當溫度返回常溫時,DNA或RNA能夠重新回到天然結構,稱為復性(annealing).當光吸收強度增加到最大值的一半時,所對應的溫度稱為解鏈溫度(melting temperature), Tm.,2.5.3核酸分子雜交 定義 應用核酸分子的變性和復性的性質，使來源不同的DNA （或RNA）片斷按堿基互補關系形成雜交雙鏈分子，這一過程 稱為核酸的分子雜交。 雜交的兩條鏈 一條是待測的單鏈的核酸分子，如克隆的基因片斷、PCR產物、基因組DNA或細胞總RNA等。 另一條可以是探針 核酸探針是指特定的已知堿基序列的核酸片斷，可以

25、是DNA、cDNA、mRNA及RNA等。在現(xiàn)代分子生物學實驗中，探針的制備和使用是與分子雜交相輔相成的技術手段。 意義 核酸雜交是核酸研究中一項最基本的實驗技術。該技術在分子生物學研究領域中被廣泛應用，如用于基因組中特定基因序列的定性和定量檢測、基因突變分析以及某些遺傳性疾?。ㄈ绲刂泻Ｘ氀?、血友病、苯丙酮酸尿癥等）的診斷。,2.5.4核酸功能 一、 DNA功能:DNA是遺傳信息的載體,其所攜帶的信息不僅是安全可靠的,還可以讀取和利用,并代代穩(wěn)定相傳.DNA通過三個反應實現(xiàn)上述功能: 自我復制(self application)、自我修復(sefl- repair)和轉錄(transcript

26、ion) 成mRNA并隨后被翻譯(translation)成蛋白質。 DNA 自我復制發(fā)生在細胞分裂之前,分三個步驟: 1)在螺旋酶(helicase)的作用下,一部分雙鏈被打開; 2) DNA聚合酶與DNA的一條鏈結合,并沿3端到5端移動,利用該鏈為模板,合成一段核酸引鏈(leading strand),該鏈重新形成雙螺旋鏈. 3)由于DNA合成只能按5端至3端方向進行,另一個DNA聚合酶也同時與另一條單鏈結合并進行DNA片段的合成,并有連接酶將這些片段連接起來,形成滯后鏈(lagging strand).,,上面的過程形成兩個完全一樣的DNA分子，稱為復制(replication)

27、.復制的DNA分子被均等的分配到兩個子細胞，使它們具有完全相同的遺傳學信息。 DNA分子的每一條鏈都是一個模板，所合成的鏈稱為互補(complementary)鏈。 如果復制過程中發(fā)生堿基錯配(mismatch)，將發(fā)生基因點突變。細胞主要有兩道防線防止突變的發(fā)生，一個是DNA聚合酶的校正(proof reading)功能，當發(fā)生一個堿基錯配后， DNA聚合酶的一個亞基將識別并將以切除，以重新進行正確合成；另一個是DNA錯配修復系統(tǒng)，有多種模式。它們在DNA復制完成以后，能夠對DNA繼續(xù)進行檢查，識別出錯配堿基，并將之切除修復。這樣就保證了生物遺傳的穩(wěn)定性。,,轉錄過程是將DNA所攜帶的遺傳

28、信息拷貝到短壽命的信使RNA (mRNA)上。步驟如下： 1)DNA被轉錄部分解螺旋,RNA聚合酶與一條DNA的一條單鏈結合,該結合部位稱為啟動子區(qū)域(promoter region). 2)RNA聚合酶以所結合的DNA鏈為模板,合成延伸一段序列互補的RNA鏈. 3)完全合成的RNA脫離RNA聚合酶/ DNA復合物,并進入細胞質開始參與翻譯.,,2) RNA功能 RNA有信使RNA(mRNA)、轉移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)三類，以及新近發(fā)現(xiàn)的小分子核內RNA(snRNA).分別有自己的功能。 mRNA將DNA所含有的信息轉錄下來并來到蛋白質翻譯機器(核糖體),在此它

29、將直接指導蛋白質的合成. rRNA是蛋白質合成機器核糖體結構的一部分.真核生物含有4種rRNA,在蛋白質合成中有幾種作用:28s rRNA具有催化作用,它構成核糖體60s亞基胎基轉移酶活性; 18s rRNA通過識別作用,校正mRNA和肽基化rRNA的位置; rRNA的三維空間結構形成裝配整個核糖體的骨架. tRNA直接將mRNA所轉錄的DNA信息解碼成蛋白質的氨基酸序列.,2.6催化抗體( catalytic antibody) 催化抗體也稱抗體酶(abzymes),是抗體(antibody)和酶(enzyme)的復合詞,是具有催化活性的單克隆抗體.它通常是人工合成物,但也存在于正常人體

30、內和病患者體內. 2.7催化性核酸 2.7.1 催化性RNA 類型與結構,,都能切斷磷酸二酯鍵,2.7.2催化性DNA(catalytic DNA) 催化性RNA的主要缺點是比較脆弱,容易受核酸酶的攻擊而水解.如在雙螺旋形成超二級結構域和催化域的某些特殊部位用DNA取代后能改善生物學穩(wěn)定性. 為了獲得能夠剪切RNA的DNA序列,一般用體外篩選方法. 無天然存在的催化性DNA,人工合成的催化性DNA是潛在的生物傳感器的分子識別元件. 2.8生物學反應中的物理量變化 1)生物反應的熱力學：自發(fā)反應總伴隨著自由能(free energy)的降低,生物學反應過程都伴隨熱力學變化:分子相轉換、分子間相互作用、酶催化反應、微生物細胞反應。,2)生物發(fā)光(bioluminescence):是由于某些生物體內一些特殊物質(如熒光素)的氧化而產生的現(xiàn)象. 3)顏色反應和光吸收:生物反應中的顏色變化包括生物體內產生色素和生物體或酶與底物作用后產生顏色物質兩個方面. 4)阻抗變化:微生物反應可使培養(yǎng)基中的電惰性物質代謝為電活性產物.當微生物生長和代謝旺盛時,培養(yǎng)基中生成的電活性分子和離子增多,使培養(yǎng)液的導電性增大,阻抗降低;反之,則阻抗升高.,