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1、 1、細胞凋亡的一般概念 細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用，它并不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。 其實從嚴格的詞學意義上來說，細胞程序性死亡與細胞凋亡是有很大區(qū)別的。細胞程序性死亡的概念是1956年提出的，PCD是個功能性概念，描述在一個多細 胞生物體中某些細胞死亡是個體發(fā)育中的一個預定的，并受到嚴格程序控制的正常組成部分。例如蝌蚪變成青蛙，其變態(tài)過程中尾部的消失伴隨大量細胞死亡，高等 哺乳類動物指間

2、蹼的消失、顎融合、視網(wǎng)膜發(fā)育以及免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育都必須有細胞死亡的參與。 動物發(fā)育過程中存在的細胞程序性死亡是一個發(fā)育學概念，而細胞凋亡則是一個形態(tài)學的概念，描述一件有著一整套形態(tài)學特征的與壞死完全不同的細胞死亡形式。但是一般認為凋亡和程序性死亡兩個概念可以 交互使用，具有同等意義。 雖然凋亡與壞死的最終結果極為相似，但它們的過程與表現(xiàn)卻有很大差別。 壞死（necrosis）：壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細胞 脹大，胞膜破裂，細胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴重的炎癥反應。 凋亡是細胞對環(huán)境的生理性病理性刺激信號，環(huán)境條件的變化

3、或緩和性損傷產(chǎn)生的應答有序變化的死亡過程。其細胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。 形態(tài)學觀察細胞凋亡的變化是多階段的，細胞凋亡往往涉及單個細胞，即便是一小部分細胞也是非同步發(fā)生的。首先出現(xiàn)的是細胞體積縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離，然后是細胞質密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細胞色素C到胞漿，核質濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約180bp-200bp片段；胞膜有小泡狀形成，膜內(nèi)側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，胞膜結構仍然完整，最終可將凋亡細胞遺骸分割包裹為幾個凋亡小體，無內(nèi)容物外溢，因此不引起周圍的炎癥反應，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細胞吞噬。 細胞凋亡的一個顯著特點是

4、細胞染色體的DNA降解，這是一個較普遍的現(xiàn)象。這種降解非常特異并 有規(guī)律，所產(chǎn)生的不同長度的DNA片段約為180-200bp的整倍數(shù)，而這正好是纏繞組蛋白寡聚體的長度，提示染色體DNA恰好是在核小體與核小體的連 接部位被切斷，產(chǎn)生不同長度的寡聚核小體片段。 實驗證明，這種DNA的有控降解是一種內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用的結果，該酶在核小體連接部位切斷染色體 DNA，這種降解表現(xiàn)在瓊脂糖凝膠電泳中就呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜，而壞死呈彌漫的連續(xù)圖譜。 細胞凋亡的生化改變不僅僅是DNA的有控降解，在細胞凋亡的過程中往往還有新的基因的表達和某些生物大分子的合成作為調控因子。如發(fā)現(xiàn)的TFAR-19就是在

5、細胞凋亡時高表達一種分子，再如在糖皮質激素誘導鼠胸腺細胞凋亡過程中，加入RNA合成抑制劑或蛋白質合成抑制劑即能抑制細胞凋亡的發(fā)生。 細胞凋亡受到嚴格調控，在正常細胞Caspase （半胱天冬蛋白酶）處于非活化的酶原狀態(tài)，凋亡程序一旦開始，Caspase被活經(jīng)隨后發(fā)生凋亡蛋白酶的層疊級聯(lián)反應，發(fā)生不可逆的凋亡。細胞是如何準確而又精確調節(jié)細胞凋亡呢？ 1凋亡抑制分子：迄今為止，已發(fā)現(xiàn)多種凋亡抑制分子，包括P35，CrmA，IAPs，F(xiàn)LIPs以及Bcl-2家族的凋亡抑制分子。 （1）P35是廣譜凋亡抑制劑，體外研究結果表明P35以競爭性結合方式與靶分子形成 穩(wěn)定的具有空間位阻效應的復合體并且抑制C

6、aspases活性，同時P35在位點DMQD！G被靶Caspases特異切割，切割后的P35與 caspase的結合更強，CrmA（Cytokine response modfer A）是血清蛋白酶抑制劑，能夠直接抑制多種蛋白酶的活性，但目前還未發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)P35和CrmA的同源分子。（2）FLIPs(FLICE-imhibirory proterins)能抑制Fas/TNFR1介導的細胞凋亡。它有多種變異體，但其N-端功能前區(qū)（Prodomain）完全相同，C端長短不一。 FLIPs通過DED功能區(qū)，與FADD和Caspase-8，10結合，拮抗它們之間的相互作用，從而抑制Caspa

7、se8，10募集到死亡受體復合體 和它們的起始化。 （3）凋亡抑制蛋白（IAPs,inhibitors of Apoptosis protien）為一組具有抑制凋亡作用的蛋白質，首先是從桿狀病毒基因組克隆到，發(fā)現(xiàn)能夠抑制由病毒感染引起的宿主細胞死亡應答。其特性是有大約20氨基酸組成的功能區(qū)，這對IAPs抑制凋亡是必需要的，它們主要抑制Caspase3,-7，而不結合它的酶原，對Caspase則即可以結合活化的，又可結合酶原，進而抑制細胞凋亡。 （4）Bcl-2家族： 這一家族有眾多成員，根據(jù)功能和結構可將Bcl-2基因家族分為兩類，一類是抗凋亡的，如：Bcl-2、Bcl-xl、 Bcl-w、

8、Mcl-1；一類是促進凋亡的，如：Bax、 Bak、 Bad、 Bid、 Bim，在促凋亡蛋白中還有一類僅含BH3結構，如Bid、 Bad。 Bcl-2家族成員都含有1-4個Bcl-2同源結構域（BH1-4） ，并且通常有一個羧端跨膜結構域。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的結構域，BH3是與促進凋亡有關的結構域。這些同源結構域在介導成員之間的二聚體化過程中起重要作用。Bcl-2成員之間的二聚體化是成員之間功能實現(xiàn)或功能調節(jié)的重要形式。 2凋亡的執(zhí)行階段 盡管凋亡過程的詳細機制尚不完全清楚，但是已經(jīng)確定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用，細胞凋亡的過程實際上是Caspa

9、se不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應過程，到目前為止，至少已有14種 Caspase被發(fā)現(xiàn)，Caspase分子間的同源性很高，結構相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶。 根據(jù)功能可把Caspase基本分為二類：一類參與細胞的加工，如Pro-IL-1和Pro-IL-1，形成有活性的IL-1和IL-1；第二類參與細胞凋亡，包括 caspase2,3,6,7,8,9.10。 參與誘導凋亡的Caspase分成兩大類： 啟動酶（inititaor）和效應酶（effector）它們分別在死亡信號轉導的上游和下游發(fā)揮作用。 細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段：接受凋亡信號凋亡調控分子間的相互作用蛋白水解酶的活化（

10、Caspase）進入連續(xù)反應過程細胞凋亡的啟動是細胞在感受到相應的信號刺激后胞內(nèi)一系列控制開關的開啟或關閉，不同的外界因素啟動凋亡的方式不同，所引起的信號轉導也不相同，客觀上說對細胞凋亡過程中信號傳遞系統(tǒng)的認識還是不全面的，目前比較清楚的通路主要有： 1、死亡受體通路受體Fas、TRAILR、TNFR1及ILlR與其相應的配體FasL、TRAIL、TNFa及IL一1結合后，相對濃度迅速升高，同時與這些受體相關的接頭分子(adaptor)FADD、TRADDFADD的相對濃度也隨之升高，從而導致下游信號級聯(lián)分子caspase一8、easpase一10以及caspase一3、caspase一6和c

11、aspase一7的相繼活化(表現(xiàn)為活性濃度相繼升高)，活化的caspase一3和caspase一7對DFF45的切割導致核酸酶DFF40的活化，活性濃度增加，從而完成對DNA的剪切引發(fā)細胞凋亡。 2、線粒體通路 線粒體是細胞生命活動控制中心，它不僅是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細胞凋亡調控中心。（1）不依賴于胱解酶的途徑 一旦受到應激信號刺激，核酸內(nèi)切酶ENDOG便從線粒體膜間區(qū)釋放，它可誘導DNA片段化，而AIF可以從線粒體轉位進入細胞核，一方面直接導致染色質凝集和大片段DNA降解，另一方面促進細胞色素C（CytC）的釋放。 （2）依賴于胱解酶的途徑 凋亡信號需要借助線粒體通路來放大

12、，而Bid(bcl-2 inhibitory BH3-domain-containing protein)是將凋亡信號從caspase-8向線粒體轉導的信使。 在正常細胞中，Bid位于細胞質中。當細胞表面的凋亡受體被活化后，活化的caspase-8通過剪切Bid，形成有活性的羧基端片段tBid，tBid遷移到線粒體內(nèi)，促使包括Cyt C在內(nèi)的線粒體蛋白的釋放。被釋放的Cyt C再與Apaf-1、proCaspase-9和dATP形成一種被稱之為凋亡體(Apoptosome)的復合體，該復合體二聚化后再激活caspase-9，后者回饋于非線粒體途徑，激活caspase-3和caspase-7誘導

13、細胞的凋亡。 3 內(nèi)質網(wǎng)通路 許多細胞在凋亡早期會出現(xiàn)胞質內(nèi)游離鈣離子濃度(Ca2+)迅速持續(xù)的升高，從而導致鈣依賴磷酸酶Cn(calcineurin)對Bad去磷酸化誘導細胞凋亡；另外還會激活胞質中的鈣依賴性蛋白酶calpain，calpain的過量積累會導致caspase-12的表達，激活的caspase-12可進一步剪切caspase-3而引發(fā)細胞凋亡。 4、生存因子抗凋亡通路（1）神經(jīng)生長因子NGF 近年研究發(fā)現(xiàn)NGF通過其受體TrkA轉導NGF的抗凋亡信號，促進神經(jīng)再生。NGF與TrkA的結合可激活PI-3激酶(PI-3K)，表現(xiàn)為PI-3K活性濃度的升高。PI-3K以胞漿絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶AktPKB為底物，活化的AktPKB活性濃度上調可使Bad的Ser136Ser112殘基磷酸化使之與Bcl-2解離，而游離的Bel-2起抗凋亡作用；同時活化的AktPKB還可磷酸化IKK，進而激活核因子B （NF- B）引發(fā)的生存因子抗凋亡途徑。 （2 ）白細胞介素3（IL-3 ） IL-3R與IL-3結合后，(1)通過激活PI-3K，走與NGF重疊的抗凋亡信號路徑；(2)激活cAMP以及cAMP依賴的蛋白激酶A(PKA)，PKA使Bad磷酸化，從而促使細胞生存。