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1、 第一節(jié) 概 述一 、 蛋 白 質(zhì) 的 定 義 蛋 白 質(zhì) ： 是 一 切 生 物 體 中 普 遍 存 在 的 ， 由 天 然 氨 基 酸 通 過 肽 鍵 連 接 而 成的 生 物 大 分 子 ； 其 種 類 繁 多 ， 各 具 有 一 定 的 相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 ， 復(fù) 雜 的 分 子 結(jié) 構(gòu)和 特 定 的 生 物 功 能 ； 是 表 達(dá) 生 物 遺 傳 性 狀 的 一 類 主 要 物 質(zhì) 。二 、 蛋 白 質(zhì) 在 生 命 中 的 重 要 性 早 在 1878年 ， 恩 格 斯 就 在 反 杜 林 論 中 指 出 ： “ 生 命 是 蛋 白 體 的 存 在方 式 ， 這 種 存 在 方

2、式 本 質(zhì) 上 就 在 于 這 些 蛋 白 體 的 化 學(xué) 組 成 部 分 的 不 斷 的 自我 更 新 。 ” 具 體 生 物 學(xué) 意 義 ：1. 生 物 體 的 組 成 成 分2. 酶3. 運(yùn) 輸 ：4. 運(yùn) 動(dòng) ：5. 抗 體6. 干 擾 素7. 遺 傳 信 息 的 控 制8. 細(xì) 胞 膜 的 通 透 性9. 高 等 生 物 的 記 憶 、 識(shí) 別 機(jī) 構(gòu)Na-K泵 、驅(qū) 動(dòng) 蛋 白 介 導(dǎo) 的 轉(zhuǎn) 運(yùn) 活 動(dòng)離 子 轉(zhuǎn) 運(yùn) 三 、 蛋 白 質(zhì) 的 組 成1.元 素 組 成 蛋 白 質(zhì) 是 一 類 含 氮 有 機(jī) 化 合 物 ， 除 含 有 碳 、 氫 、 氧 外 ， 還 有 氮 和 少

3、 量 的 硫 。 某 些 蛋 白 質(zhì) 還 含 有 其 他 一些 元 素 ， 主 要 是 磷 、 鐵 、 碘 、 碘 、 鋅 和 銅 等 。 這 些 元 素 在 蛋 白 質(zhì) 中 的 組 成 百 分 比 約 為 ： 碳 50 氫 7 氧 23 氮 16% 硫 03 其 他 微 量 氮 占 生 物 組 織 中 所 有 含 氮 物 質(zhì) 的 絕 大 部 分 。 因 此 ， 可 以 將 生 物 組 織 的 含 氮 量近 似 地 看 作 蛋 白 質(zhì) 的 含 氮 量 。 由 于 大 多 數(shù) 蛋 白 質(zhì) 的 含 氮 量 接 近 于 16%， 所 以 ， 可 以根 據(jù) 生 物 樣 品 中 的 含 氮 量 來 計(jì)

4、算 蛋 白 質(zhì) 的 大 概 含 量 蛋 白 質(zhì) 含 量 的 測(cè) 定 ： 凱 氏 定 氮 法 (測(cè) 定 氮 的 經(jīng) 典 方 法 ) 優(yōu) 點(diǎn) ： 對(duì) 原 料 無 選 擇 性 ， 儀 器 簡(jiǎn) 單 ， 方 法 也 簡(jiǎn) 單 ； 缺 點(diǎn) ： 易 將 非 蛋 白 氮 (如 核 酸 中 的 氮 )都 歸 入 蛋 白 質(zhì) 中 , 不 精 確 。 一 般 ， 樣 品 含 氮 量 平 均 在 16%， 取 其 倒 數(shù) 100/16=6.25， 即 為 蛋 白 質(zhì) 換 算 系 數(shù) ， 其 含 義 是 樣 品 中 每 存 在 1g元 素 氮 ， 就 說 明 含 有 6.25g 蛋 白 質(zhì) ； 故 ： 蛋 白 質(zhì) 含 量

5、 =氮 的 量 100/16或 6.25 除 了 上 法 外 ， 還 有 紫 外 比 色 法 雙 縮 脲 法 Folin酚 考 馬 斯 亮 蘭 G250比 色 法 （ 條 件 ： 蛋 白 質(zhì) 必 須 是 可 溶 的 ） 2.化 學(xué) 組 成 （ 兩 種 類 型 ） 單 純 蛋 白 質(zhì) ： 水 解 （ 三 種 方 法 ） 為 -氨 基 酸 綴 合 蛋 白 質(zhì) =單 純 蛋 白 質(zhì) +輔 基 第 二 節(jié) 氨 基 酸 化 學(xué)一 、 氨 基 酸 的 結(jié) 構(gòu) 與 分 類1.氨 基 酸 的 結(jié) 構(gòu)氨 基 酸 是 蛋 白 質(zhì) 水 解 的 最 終 產(chǎn) 物 ， 是 組 成 蛋 白 質(zhì) 的 基 本 單 位 。 從

6、所 有 蛋 白 質(zhì) 水 解 物 中 分 離 出來 的 氨 基 酸 有 二 十 種 （ 標(biāo) 準(zhǔn) 氨 基 酸 ， standard amino acids) ， 除 脯 氨 酸 和 羥 脯 氨 酸 外 ， 這 些天 然 氨 基 酸 在 結(jié) 構(gòu) 上 的 共 同 特 點(diǎn) 為 ：(1) 與 羧 基 相 鄰 的 -碳 原 子 上 都 有 一 個(gè) 氨 基 ， 因 而 稱 為 -氨 基 酸 COOHH2N CH -碳原子基團(tuán) R R基團(tuán)-氨 基 酸 基 本 結(jié) 構(gòu) 通 式 不 帶 電 形 式 H2NCHCOOHR +H3NCHCOO-R兩 性 離 子 形 式 (中 性PH)(2) C如 是 不 對(duì) 稱 C（

7、除 Gly） ， 則 ： 具 有 兩 種 立 體 異 構(gòu) 體 D-型 和 L-型 （ 蛋 白 質(zhì) 中 的 AA都 是 L 型 ） . 具 有 旋 光 性 （ 手 性 ） 左 旋 （ -） 或 右 旋 （ +） BA. 2.構(gòu) 成 蛋 白 質(zhì) 的 20種 氨 基 酸 3、 常 見 蛋 白 質(zhì) 氨 基 酸 的 分 類1） 按 照 R基 的 化 學(xué) 結(jié) 構(gòu)（ 1） 脂 肪 簇 氨 基 酸 中 性 氨 基 酸 ： Gly、 Ala、 Val、 Leu、 Ile 含 羥 基 或 硫 氨 基 酸 ： Ser、 Thr、 Cys、 Met 酸 性 氨 基 酸 及 其 酰 胺 ： Asp、 Glu、 Asn、

8、 Gln 堿 性 氨 基 酸 ： Lys、 Arg（ 2） 芳 香 簇 氨 基 酸 Phe、 Tyr、 Trp（ 3） 雜 環(huán) 簇 氨 基 酸 His、 Pro (G ln, Q)(Asn, N) 2） 按 R的 極 性 性 質(zhì)（ 1） 非 極 性 R基 氨 基 酸Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Phe、 Trp、 Met（ 2） 不 帶 電 荷 的 極 性 R基 氨 基 酸Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn、 Gln（ 3） 帶 正 電 荷 的 R基 氨 基 酸（ 4） 帶 負(fù) 電 荷 的 R基 氨 基 酸 Lys、 Arg、 HisAsp、 Glu

9、注 ： 二 十 種 氨 基 酸 的 結(jié) 構(gòu) 特 點(diǎn)支 鏈 氨 基 酸 ： 纈 氨 酸 、 亮 氨 酸 ， 異 亮 氨 酸含 羥 基 的 氨 基 酸 ： 絲 氨 酸 、 蘇 氨 酸含 硫 的 氨 基 酸 ： 半 胱 氨 酸 （ 含 巰 基 ） 、 甲 硫 氨 酸 （ 含 硫 甲 基 ）含 苯 環(huán) 的 氨 基 酸 ： 苯 丙 氨 酸 、 色 氨 酸 、 酪 氨 酸含 胍 基 的 氨 基 酸 ： 精 氨 酸含 咪 唑 基 的 氨 基 酸 ： 組 氨 酸亞 氨 基 酸 ： 脯 氨 酸含 酰 胺 的 氨 基 酸 ： 天 冬 酰 胺 、 谷 氨 酰 胺含 吲 哚 基 的 氨 基 酸 ： 色 氨 酸含 -氨

10、 基 的 氨 基 酸 ： 賴 氨 酸 膠 原 蛋 白 中 的 Lys側(cè) 鏈 氧 化 時(shí) 能 形 成 很 強(qiáng) 的 分 子 間 (內(nèi) )交 聯(lián) 。Arg的 胍 基 堿 性 很 強(qiáng) ， 與 NaOH相 當(dāng) 。His是 一 個(gè) 弱 堿 ， 是 天 然 的 緩 沖 劑 ， 它 往 往 存 在 于 許 多 酶 的 活 性 中 心 。非 極 性 aa一 般 形 成 蛋 白 質(zhì) 的 疏 水 核 心 ， 帶 電 荷 的 aa和 極 性 aa位 于 表 面 。酶 的 活 性 中 心 ： His、 Ser、 Cys 4.人 體 所 需 的 八 種 必 需 氨 基 酸 纈 氨 酸 (Val) 亮 氨 酸 (Leu)

11、異 亮 氨 酸 (Ile) 蘇 氨 酸 (Thr) 賴 氨 酸 (Lys) 蛋 氨 酸 (Met) 苯 丙 氨 酸 (Phe) 色 氨 酸 (Trp) 嬰 兒 時(shí) 期 所 需 : 精 氨 酸 (Arg)、 組 氨 酸 (His) 早 產(chǎn) 兒 所 需 ： 色 氨 酸 (Try)、 半 胱 氨 酸 (Cys) . 在 少 數(shù) 蛋 白 質(zhì) 中 分 離 出 一 些 不 常 見 的 氨 基 酸 ， 通 常 稱 為 不 常 見 蛋 白 質(zhì) 氨 基 酸 。 這 些 氨 基 酸 都是 由 相 應(yīng) 的 基 本 氨 基 酸 衍 生 而 來 的 。 其 中 重 要 的 有 4-羥 基 脯 氨 酸 、 5-羥 基 賴

12、 氨 酸 (存 在 于 膠 原 pro)、N-甲 基 賴 氨 酸 、 和 3,5-二 碘 酪 氨 酸 等 。 這 些 不 常 見 蛋 白 質(zhì) 氨 基 酸 的 結(jié) 構(gòu) 如 下 ： NHHO COOH4-羥基脯氨酸 H2NCH2CHCH2CH2CHCOOHOH NH25-羥基賴氨酸NH 2CH3NHCH2CHCH2CH2CHCOOH6-N-甲基賴氨酸 HO II CH2CHCOOHNH23,5-二碘酪氨酸 除 參 與 蛋 白 質(zhì) 組 成 的 20多 種 氨 基 酸 外 ， 生 物 體 內(nèi) 存 在 大 量 的 氨 基 酸 中 間 代 謝 產(chǎn) 物 ，它 們 不 是 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 單 元 ，

13、但 在 生 物 體 內(nèi) 具 有 很 多 生 物 學(xué) 功 能 。 （ 1） L-型 氨 基 酸 的 衍 生 物 ： L-瓜 氨 酸 和 L-鳥 氨 酸 （ 2） D-型 氨 基 酸 ： D-Glu、 D-Ala（ 肽 聚 糖 中 ） 、 D-Phe（ 短 桿 菌 肽 S） （ 3） -、 -、 -氨 基 酸 ： -Ala（ 泛 素 的 前 體 ） 、 -氨 基 丁 酸 （ 神 經(jīng) 遞質(zhì) ） 。 二 .氨 基 酸 的 重 要 理 化 性 質(zhì)1.一 般 物 理 性 質(zhì) 常 見 氨 基 酸 均 為 無 色 結(jié) 晶 ， 其 形 狀 因 構(gòu) 型 而 異(1)溶 解 性 ： 各 種 氨 基 酸 在 水 中

14、的 溶 解 度 差 別 很 大 ， 并 能 使 水 的 介 電 常 數(shù) 增 加 ， 能 溶 解 于 稀 酸 或 稀 堿 中 ， 但 不 能 溶解 于 有 機(jī) 溶 劑 。 通 常 酒 精 能 把 氨 基 酸 從 其 溶 液 中 沉 淀 析 出 。 (2)熔 點(diǎn) ： 氨 基 酸 的 熔 點(diǎn) 極 高 ， 一 般 在 200 以 上 。(3)味 感 ： 其 味 隨 不 同 氨 基 酸 有 所 不 同 ， 有 的 無 味 、 有 的 為 甜 、 有 的 味 苦 (必需氨基酸都具有苦味，以苯丙氨酸和色氨酸的苦味最強(qiáng))， 谷 氨 酸 的 單 鈉 鹽 有 鮮 味 ， 是 味 精 的 主 要 成 分 。(4)旋

15、 光 性 ： 除 甘 氨 酸 外 ， 氨 基 酸 都 具 有 旋 光 性 ， 能 使 偏 振 光 平 面 向 左 或 向 右 旋 轉(zhuǎn) ， 左 旋 者 通 常 用 （ -） 表 示 ， 右 旋者 用 （ +） 表 示 。(5)光 吸 收 ： 構(gòu) 成 蛋 白 質(zhì) 的 20種 氨 基 酸 在 可 見 光 區(qū) 都 沒 有 光 吸 收 ， 但 在 遠(yuǎn) 紫 外 區(qū) (3.5， -羧 基 以 -COO-形 式 存 在 。 -氨 基 pK2在 9.4左 右 ， 當(dāng) pH8.0時(shí) ， -氨 基 以 -NH3+形 式 存 在 。 在pH3.5-8.0時(shí) ， 帶 有 相 反 電 荷 ， 因 此 氨 基 酸 在 水

16、溶 液 中 是 以 兩 性 離 子離 子 形 式 存 在 。 在 pH2.34和 pH9.60處 ， Gly具 有 緩 沖 能 力 。 起 點(diǎn) ： 100% Gly+ 凈 電 荷 ： +1第 一 拐 點(diǎn) ： 50%Gly + ， 50%Gly 平 均 凈 電 荷 ： +0.5 pH=pK+lgGly /Gly+ = pK1 = 2.34第 二 拐 點(diǎn) ： 100%Gly 凈 電 荷 ： 0 等 電 點(diǎn) pI第 三 拐 點(diǎn) ： 50%Gly ， 50%Gly- 平 均 凈 電 荷 ： -0.5 pH=pK2+lgGly-/Gly =pK2=9.6終 點(diǎn) ： 100% Gly- 凈 電 荷 ： -

17、1His咪 唑 基 的 pK a值 為 6.0， 在 pH7附 近 有 明 顯 的 緩 沖 作 用 。 在 生 理 條 件 下 ， 只 有His有 緩 沖 能 力 。 血 紅 蛋 白 中 His含 量 高 ， 在 血 液 中 具 很 強(qiáng) 的 緩 沖 能 力 。 甘氨酸滴定曲線 甘 氨 酸 鹽 酸 鹽 （ A+） 等 電 點(diǎn) 甘 氨 酸 （ A） 甘 氨 酸 鈉 （ A-）一 氨 基 一 羧 基 AA的 等 電 點(diǎn)計(jì) 算 ：pI= 2pK 1+pK2 一 氨 基 二 羧 基 AA的 等 電 點(diǎn)計(jì) 算 ：pI= 2pK1+pK2二 氨 基 一 羧 基 AA的 等 電 點(diǎn)計(jì) 算 ：pI= 2pK 2

18、+pK3 3.氨 基 酸 的 等 電 點(diǎn) 當(dāng) 溶 液 濃 度 為 某 一 pH值 時(shí) ， 氨 基 酸 分 子 中 所 含 的 -NH3+和 -COO-數(shù) 目 正 好 相 等 ， 凈 電 荷 為 0。 這 一 pH值即 為 氨 基 酸 的 等 電 點(diǎn) ， 簡(jiǎn) 稱 pI。 在 等 電 點(diǎn) 時(shí) ， 氨 基 酸 既 不 向 正 極 也 不 向 負(fù) 極 移 動(dòng) ， 即 氨 基 酸 處 于 兩 性 離子 狀 態(tài) 。 側(cè) 鏈 不 含 解 離 基 團(tuán) 的 中 性 氨 基 酸 ， 其 等 電 點(diǎn) 是 它 的 pK1和 pK2的 算 術(shù) 平 均 值 ： pI = (pK1 + pK2 )/2 同 樣 ， 對(duì) 于

19、側(cè) 鏈 含 有 可 解 離 基 團(tuán) 的 氨 基 酸 ， 其 pI值 也 決 定 于 兩 性 離 子 兩 邊 的 pK值 的 算 術(shù) 平 均 值 。 酸 性 氨 基 酸 ： pI = (pK 1 + pKR-COO- )/2 堿 性 氨 基 酸 ： pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 結(jié)論：（1）當(dāng)PHPI，AA帶電性？在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)性？（2）當(dāng)PHPI，AA帶電性？在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)性？（3）PI與濃度的關(guān)系？ 氨基酸與水合茚三酮共熱，發(fā)生氧化脫氨反應(yīng)，生成NH3與酮酸。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。加熱過程中酮酸裂解，放出CO2，自身變?yōu)樯僖粋€(gè)碳的醛。NH3與水合茚三酮及還原型茚三酮脫

20、水縮合，生成藍(lán)紫色化合物。 4.氨 基 酸 的 化 學(xué) 性 質(zhì)(1)與 茚 三 酮 的 反 應(yīng) （ 顏 色 反 應(yīng) ） OH OH 反 應(yīng) 要 點(diǎn)A.該 反 應(yīng) 由 NH2與 COOH共 同 參 與B.茚 三 酮 是 強(qiáng) 氧 化 劑C.該 反 應(yīng) 非 常 靈 敏 ， 可 在 570nm測(cè) 定 吸 光 值D. 測(cè) 定 范 圍 ： 0.550g/ml E.脯 氨 酸 （ 或 羥 脯 氨 酸 ） 與 茚 三 酮 直 接 生 成 黃 色 物 質(zhì) （ 不 釋 放 NH3） 應(yīng) 用 ：A.氨 基 酸 定 量 分 析 （ 先 用 層 析 法 分 離 ， 再 測(cè) 定 CO2的 量 ）B.氨 基 酸 自 動(dòng) 分

21、 析 儀 ： 用 陽(yáng) 離 子 交 換 樹 脂 ， 將 樣 品 中 的 氨 基 酸 分 離 ， 自 動(dòng) 定 性 定 量 ， 記 錄 結(jié) 果 。 反 應(yīng) 特 點(diǎn)A.為 - NH 2的 反 應(yīng)B.在 常 溫 ， 中 性 條 件 ， 甲 醛 與 - NH2很 快 反 應(yīng) ， 生 成 羥 甲 基 衍 生 物 ， 釋 放 氫 離 子 。 應(yīng) 用 ： 氨 基 酸 定 量 分 析 甲 醛 滴 定 法 （ 間 接 滴 定 ）(2)與甲醛反應(yīng) 氨 基 酸 的 甲 醛 滴 定 氨 基 酸 兩 性 離 子 的 NH3+是 弱 酸 ， 其 pKa為 9.7左 右 ， 完 全 解離 時(shí) 溶 液 的 pH約 為 10 ，

22、超 出 酸 堿 滴 定 指 示 劑 的 顯 色 范 圍 ，不 能 用 一 般 指 示 劑 ， 例 如 酚 酞 ， 作 酸 堿 滴 定 。 但 當(dāng) 氨 基 酸的 氨 基 與 中 性 甲 醛 結(jié) 合 成 氨 基 酸 二 羥 甲 基 衍 生 物 后 ， 其 氨基 的 堿 性 即 大 大 減 少 ， 反 應(yīng) 向 右 進(jìn) 行 ， 兩 性 離 子 中 NH3+基的 離 解 度 增 加 ， 釋 出 H+質(zhì) 子 ， NH3+的 pKa值 降 低 到 6.5左 右 ，溶 液 的 pH降 至 6.7左 右 ， 此 時(shí) NH3+離 解 釋 出 的 H+即 可 以 酚 酞作 指 示 劑 用 標(biāo) 準(zhǔn) NaOH溶 液 加

23、 以 滴 定 。 每 釋 出 的 一 個(gè) H+就 相當(dāng) 于 一 個(gè) 氨 基 酸 。 甲 醛 滴 定 可 用 來 測(cè) 定 蛋 白 質(zhì) 的 水 解 程 度 。當(dāng) 氨 基 酸 溶 液 中 存 在 1mol/L甲 醛 時(shí) ， 滴 定 終 點(diǎn) 由 pHl2左 右移 至 9附 近 ， 亦 即 酚 酞 指 示 劑 的 變 色 區(qū) 域 。 這 就 是 甲 醛 滴定 法 的 基 礎(chǔ) 。 小 結(jié) ：A.直 接 滴 定 ， 終 點(diǎn) pH過 高 （ 12） ， 沒 有 適 當(dāng) 指 示 劑 。B.與 甲 醛 反 應(yīng) ， 滴 定 終 點(diǎn) 在 9左 右 ， 可 用 酚 酞 作 指 示 劑 。C.釋 放 一 個(gè) 氫 離 子

24、， 相 當(dāng) 于 一 個(gè) 氨 基 （ 摩 爾 比 1： 1）D.簡(jiǎn) 單 快 速 ， 一 般 用 于 測(cè) 定 蛋 白 質(zhì) 的 水 解 速 度 。 (3) 與 2,4-二 硝 基 氟 苯 （ DNFB） 反 應(yīng) 反 應(yīng) 特 點(diǎn)A.為 - NH 2的 反 應(yīng)B.氨 基 酸 - NH2的 一 個(gè) H原 子 可 被 烴 基 取 代 (鹵 代 烴 )C.在 弱 堿 性 條 件 下 ， 與 DNFB發(fā) 生 芳 環(huán) 取 代 ， 生 成 二 硝 基 苯 氨 基 酸 應(yīng) 用 ： 鑒 定 多 肽 或 蛋 白 質(zhì) 的 N-末 端 氨 基 酸A.雖 然 多 肽 側(cè) 鏈 上 的 - NH2、 酚 羥 基 也 能 與 DNF

25、B反 應(yīng) ， 但 其 生 成 物 ， 容 易與 - DNP氨 基 酸 區(qū) 分 和 分 離 （ - DNP氨 基 酸 可 溶 于 有 機(jī) 溶 劑 ， 而 R基 的DNP衍 生 物 則 不 能 ， 因 此 ， 可 用 有 機(jī) 溶 劑 抽 提 ） 黃 色 首 先 由 Sanger應(yīng) 用 ， 確 定 了 胰 島 素 的 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu)A.B.用 酸 水 解 DNP-肽 ， 得 DNP-N端 氨 基 酸 及 其 他 游 離 氨 基 酸C.分 離 DNP-氨 基 酸D. 肽 分 子 與 DNFB反 應(yīng) ， 得 DNP-肽層 析 法 定 性 DNP-氨 基 酸 ， 得 出 N端 氨 基 酸 的 種 類 、

26、數(shù) 目 Sanger降 解 法 的 改 進(jìn) 方 法 - DNS-Edman降 解 法 用 DNS(二 甲 基 氨 基 萘 磺 酰 氯 )測(cè) 定 N端 氨 基 酸 原 理 DNFB法 相 同 但 水 解 后 的 DNS-氨 基 酸 不 需 分 離 ， 可 直 接 用 電 泳 或 層 析 法 鑒 定 由 于 DNS有 強(qiáng) 烈 熒 光 ， 靈 敏 度 比 DNFB法 高 100倍 ， 比 Sanger法 高 幾 到 十 幾 倍 可 用 于 微 量 氨 基 酸 的 定 量 由 Edman于 1950年 首 先 提 出為 - NH2的 反 應(yīng)用 于 N末 端 分 析 ， 又 稱 Edman降 解 法Ed

27、man （苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實(shí)際上也是一種N-端分析法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。 N C S NH CH COR 2N CH COR 1HHNH S:C CH CO R 1H N NH CH COR 2 SNH CNH OCR 1CH NH 2 CH COR 2NCO CH NH SCR 1 (4)與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應(yīng) 苯 氨 基 硫 甲 酰 肽 噻 唑 啉 酮 苯 胺 苯 乙 內(nèi) 酰 硫 脲 AA 肽 鏈 （ N端 氨 基 酸 ） 與 PITC偶 聯(lián) ， 生 成 PTC-肽 環(huán) 化 斷 裂 ： 最 靠 近 PTC基 的

28、 肽 鍵 斷 裂 ， 生 成 PTC-氨 基 酸 和 少 一 殘 基 的 肽 鏈 ， 同 時(shí) PTC-氨 基 酸 環(huán) 化 生 成 PTH-氨 基 酸 分 離 PTH-氨 基 酸 層 析 法 和 HPLC等 鑒 定用 Edman降 解 法 提 供 逐 次 減 少 一 個(gè) 殘 基 的 肽 鏈 靈 敏 度 提 高 ， 能 連 續(xù) 測(cè) 定 。 多 肽 順 序 自 動(dòng) 分 析 儀 樣 品 最 低 用 量 可 在 5pmol （ 5） 側(cè) 鏈 R基 參 加 的 反 應(yīng)氨 基 酸 的 側(cè) 鏈 基 團(tuán) R有 下 列 幾 種 ： 苯 環(huán) (苯 丙 氨 酸 及 酪 氨 酸 )酚 基 (酪 氨 酸 )-OH基 (絲

29、 氨 酸 、 蘇 氨 酸 )-SH基 及 SS鍵 (半 胱 氨 酸 及 胱 氨 酸 )吲 哚 基 (色 氨 酸 )胍 基 (精 氨 酸 )咪 唑 基 (組 氨 酸 ) 重 要 反 應(yīng) ：A. 與 酰 化 試 劑 反 應(yīng) ： 如 丹 磺 酰 氯 ； 為 - NH2的 反 應(yīng)B. 精 氨 酸 的 反 應(yīng) ： 胍 基 與 1， 2 環(huán) 已 二 酮 ； 防 止 胰 pro酶 對(duì) Arg的 COOH所 生 成 的 肽 鍵 的 水 解C. Cys與 乙 撐 亞 胺 的 反 應(yīng) ： SH的 反 應(yīng) ； 為 胰 pro酶 提 供 了 新 的 水 解 位 點(diǎn)D. 胱 氨 酸 的 氧 化 與 還 原 反 應(yīng) ：

30、二 硫 鍵 的 反 應(yīng) E. 其 他 反 應(yīng)成 鹽 、 成 酯 、 成 肽 、 脫 羧 反 應(yīng) 酪 氨 酸 的 酚 基 在 3和 5位 上 容 易 發(fā) 生 親 電 取 代 反 應(yīng) ， 例 如 發(fā) 生 碘 化 或 硝 化 ， 分別 生 成 一 碘 酪 氨 酸 和 二 碘 酪 氨 酸 或 一 硝 基 酪 氨 酸 和 二 硝 基 酪 氨 酸 ： 與 重 氮 鹽 結(jié) 合 生 成 桔 黃 色 的 化 合 物 ：這 就 是 Pauly反 應(yīng) ， 可 用 于 檢 測(cè) 酪 氨 酸 。 組 氨 酸 的 側(cè) 鏈 咪 唑 基 與 重 氮 苯 磺 酸 也 能 形 成 相 似 的 化 合 物 ， 但 顏色 稍 有 差

31、異 ， 是 棕 紅 色 。精 氨 酸 的 側(cè) 鏈 胍 基 在 硼 酸 鈉 緩 沖 液 (pH 89， 25 35 ） 中 ， 與 1， 2環(huán)己 二 酮 反 應(yīng) ， 生 成 縮 合 物 ： 在 胰 蛋 白 酶 水 解 肽 段 時(shí) ， 用 于 保 護(hù) Arg的 NH2， 減 少 作 用 位 點(diǎn) 。 色 氨 酸 的 側(cè) 鏈 吲 哚 基 在 溫 和 條 件 下 可 被 N溴 代 琥 珀 酰 亞 胺 氧 化 。 此 反應(yīng) 可 用 于 分 光 光 度 法 測(cè) 定 蛋 白 質(zhì) 中 色 氨 酸 的 含 量 ， 并 能 在 色 氨 酸 和 酪 氨酸 殘 基 處 選 擇 性 化 學(xué) 斷 裂 肽 鍵 。蛋 氨 酸

32、側(cè) 鏈 上 的 甲 硫 基 是 一 個(gè) 很 強(qiáng) 的 親 核 基 團(tuán) ， 與 烴 化 試 劑 如 甲 基 碘 容 易 形 成锍 鹽 。 生 成 的 側(cè) 鏈 帶 有 正 電 荷 ( +NH3)， 它 為 胰 蛋 白 酶 水 解 肽 鏈 提供 了 一 個(gè) 新 位 點(diǎn) ， 這 對(duì) 氨 基 酸 順 序 測(cè) 定 是 很 有 用 的 。 同 時(shí) 此 反應(yīng) 也 可 用 來 保 護(hù) 肽 鏈 上 的 SH基 、 以 防 止 被 重 新 氧 化 為 二 硫鍵 。 半 胱 氨 酸 可 與 二 硫 硝 基 苯 甲 酸 (縮 寫 為 DTNB)或 稱 Ellman氏 試 劑 發(fā) 生硫 醇 二 硫 化 物 交 換 反 應(yīng)

33、：反 應(yīng) 中 1分 子 的 半 胱 氨 酸 引 起 1分 子 的 硫 硝 基 苯 甲 酸 的 釋 放 ， 它 在 pH 8.0時(shí) ，在 412nm波 長(zhǎng) 處 有 強(qiáng) 烈 的 光 吸 收 ， 因 此 可 利 用 比 色 法 定 量 測(cè) 定 一 SH基 。 硫 基 很 容 易 受 空 氣 或 其 他 氧 化 劑 氧 化 。硫 醇 一 般 遇 到 的 只 有 兩 種 氧 化 衍 生 物 ： 二 硫 化 物 和 磺 酸 。2R-SH 1/2O2 R-S-S-R + H2O2半 胱 氨 酸 的 SH基 可 與 另 一 個(gè) SH基 結(jié) 合 成 二 硫 鍵 (SS)。 SH與 SS成一 氧 化 還 原 體

34、系 ， 在 機(jī) 體 氧 化 還 原 作 用 中 有 一 定 作 用 。 二 硫 鍵 存 在 于 多 種 肽 和 蛋白 質(zhì) 分 子 中 ， 胰 島 素 分 子 中 有 3個(gè) 二 硫 鍵 ， 核 糖 核 酸 酶 分 子 中 有 4個(gè) 二 硫 鍵 。 二 硫鍵 對(duì) 蛋 白 質(zhì) 和 多 肽 分 子 的 立 體 結(jié) 構(gòu) 有 維 系 穩(wěn) 定 的 作 用 。 二 硫 鍵 可 被 還 原 劑 破 壞 產(chǎn)生 SH基 。 SH基 可 被 氧 化 成 磺 酸 基 (HSO 3基 )。 這 兩 種 反 應(yīng) 在 研 究 胰 島 素 和 含 二硫 鍵 肽 的 結(jié) 構(gòu) 工 作 中 都 有 用 處 。 絲氨酸、蘇氨酸和羥脯氨

35、酸的OH基能與酸結(jié)合成酯。在生物體蛋白質(zhì)中，絲氨酸常與磷酸結(jié)合，酪蛋白中含有大量的絲氨酸磷酸酯。 NHHO COOH4-羥基脯氨酸 H2NCH2CHCH2CH2CHCOOHOH NH25-羥基賴氨酸NH 2CH3NHCH2CHCH2CH2CHCOOH6-N-甲基賴氨酸 HO II CH2CHCOOHNH23,5-二碘酪氨酸 一 氨 基 二 羧 基 AA的 等 電 點(diǎn)計(jì) 算 ：pI= 2pK1+pK2二 氨 基 一 羧 基 AA的 等 電 點(diǎn)計(jì) 算 ：pI= 2pK 2+pK3 小 結(jié) ：A.直 接 滴 定 ， 終 點(diǎn) pH過 高 （ 12） ， 沒 有 適 當(dāng) 指 示 劑 。B.與 甲 醛 反

36、 應(yīng) ， 滴 定 終 點(diǎn) 在 9左 右 ， 可 用 酚 酞 作 指 示 劑 。C.釋 放 一 個(gè) 氫 離 子 ， 相 當(dāng) 于 一 個(gè) 氨 基 （ 摩 爾 比 1： 1）D.簡(jiǎn) 單 快 速 ， 一 般 用 于 測(cè) 定 蛋 白 質(zhì) 的 水 解 速 度 。 重 要 反 應(yīng) ：A. 與 酰 化 試 劑 反 應(yīng) ： 如 丹 磺 酰 氯 ； 為 - NH2的 反 應(yīng)B. 精 氨 酸 的 反 應(yīng) ： 胍 基 與 1， 2 環(huán) 已 二 酮 ； 防 止 胰 pro酶 對(duì) Arg的 COOH所 生 成 的 肽 鍵 的 水 解C. Cys與 乙 撐 亞 胺 的 反 應(yīng) ： SH的 反 應(yīng) ； 為 胰 pro酶 提 供 了 新 的 水 解 位 點(diǎn)D. 胱 氨 酸 的 氧 化 與 還 原 反 應(yīng) ： 二 硫 鍵 的 反 應(yīng) E. 其 他 反 應(yīng)成 鹽 、 成 酯 、 成 肽 、 脫 羧 反 應(yīng) 酪 氨 酸 的 酚 基 在 3和 5位 上 容 易 發(fā) 生 親 電 取 代 反 應(yīng) ， 例 如 發(fā) 生 碘 化 或 硝 化 ， 分別 生 成 一 碘 酪 氨 酸 和 二 碘 酪 氨 酸 或 一 硝 基 酪 氨 酸 和 二 硝 基 酪 氨 酸 ：