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2019-2020年高考生物二輪復習 1.2.1《動物細胞培養(yǎng)》教案 中圖版選修3 【教學目標】 1.能夠簡述動物細胞培養(yǎng)的過程、條件及應用。 2.運用材料，使學生進一步了解動物細胞培養(yǎng)中的研究熱點、發(fā)展趨勢和應用前景，以開拓視野，增強科技意識。 【教學方法】 運用講授、自學以及討論相結合的方法 【教學重點】 細胞培養(yǎng)的過程、條件及應用 【教學難點】 細胞培養(yǎng)中的相關名詞、動物細胞培養(yǎng)的應用前景 【教學過程】 1.創(chuàng)設情景，導入新課 應用目前人類面臨的一些困惑或難題，如皮膚燒傷的植皮等問題，引出進行動物細胞培養(yǎng)的目的，解決兩個問題：（1）為什么要進行動物細胞培養(yǎng)？（2）什么是動物細胞培養(yǎng)？ 2.利用材料，引導自學與討論 （1）運用錄像資料，引導學生自學動物細胞培養(yǎng)的過程，并通過相互討論，嘗試解決動物細胞中的有關名詞，如接觸抑制、貼壁生長、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等； （2）聯(lián)系已有的知識，引導學生嘗試解決第三個問題：如何進行動物細胞培養(yǎng)？包括動物細胞培養(yǎng)的過程、條件等。 3.歸納總結，聯(lián)系實際，聯(lián)系實際，拓展延伸 通過對上述三個問題的解決，學生初步了解動物細胞培養(yǎng)技術，在此基礎上，以實例為抓手，聯(lián)系實際，進一步了解動物細胞培養(yǎng)中的研究熱點、發(fā)展趨勢和應用前景，以開拓視野，增強科技意識。 實驗一 動物細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)是用無菌操作的方法將動物體內的組織(或器官)取出，模擬動物體內的生理條件，在體外進行培養(yǎng)．使其不斷地生長、繁殖，人們借以觀察細胞的生長、繁殖、細胞分化以及細胞衰老等過程的生命現(xiàn)象。 細胞培養(yǎng)的突出優(yōu)點，一是便于研究各種物理、化學等外界因素對細胞生長發(fā)育和分化等的影響；二是細胞培養(yǎng)便于人們對細胞內結構(如細胞骨架等)、細胞生長及發(fā)育等過程的觀察。因而細胞培養(yǎng)是探索和指示細胞生命活動規(guī)律的—種簡便易行的實驗技術，同時我們也不可忽略的另一個因素，那就是它脫離樂生物機體后的—些變化。 細胞培養(yǎng)技術目前已廣泛地被應用于生物學的各個領域。如分子生物學、細胞生物學、遺傳學、免疫學、腫痛學及病毒學等 為此有必要使學生在細胞培養(yǎng)方面得到一些初步的感性知識，了解動物細胞培養(yǎng)的基本操作過程，觀察體外培養(yǎng)細胞的生長特征，對原代細胞與傳代細胞有一個基本概念。 本實驗分兩次進行．即清洗與消毒和傳代細胞的培養(yǎng)與觀察。 Ⅰ清洗與滅菌 一、實驗目的 能獨立地進行用于細胞培養(yǎng)的各種器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學消毒法的使用方法。 二、實驗原理 清洗與消毒是組織培養(yǎng)實驗的第一步，是組織培養(yǎng)中工作量最大，也是最基本的步驟。體外培養(yǎng)細胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌的要求程度很高。細胞養(yǎng)不好與清洗不徹底有很大關系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無油跡，而且不能殘留任何物質。如有毒的化學物質，哪怕殘留0．1個，也可能影響細胞生長。滅菌手段的選擇十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，即使達到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養(yǎng)價值、生物學特性或其他使用價值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。 三、實驗材料、用品 材料：無臭氧型紫外燈，微孔濾膜(直徑25)：孔徑為0．22μm，微孔濾膜(直徑90)：孔徑為0．22 μm，過濾器(直徑25)。 藥品：70％或75％酒精，0．1％新潔爾滅，煤酚皂溶液(來蘇兒水)，0．5％過氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高錳酸鉀，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸(工業(yè))，DEPC水[體積分數(shù)0．1％的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。 儀器：超凈臺，干燥箱，高壓鍋，過濾器，過濾泵。 四、實驗步驟 (一)清洗 1．新玻璃器皿的清洗先用自來水刷洗，再浸泡5％稀鹽酸以中和玻璃表面的堿性物質和其他有害物質。 2．使用過的玻璃器皿的清洗 (1)使用過的培養(yǎng)用品應立即浸入清水，避免干涸難洗。 (2)用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥。 (3)浸酸性洗液過夜。 (4)從酸性洗液撈出后自來水沖洗10．15次去除殘余酸液，蒸餾水涮洗3次，倒置烘干。 (5)包裝(牛皮紙或一般紙)。 (6)高壓(15磅20 min)或干熱(170℃2 h)滅菌。 (7)貯存?zhèn)溆谩? 3．膠塞的處理 (1)新膠塞應先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸l(wèi)O-20 min。 (2)自來水清洗10次。 (3)再用1％稀鹽酸浸泡30 min。 (4)自來水清洗10次，蒸餾水涮洗3次。晾干，高壓滅菌(見(二)消毒與滅菌)。舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸和清洗數(shù)次，過蒸餾水，晾干，包裝并高壓滅菌后，便可使用。 （二）消毒 1．物理消毒法 (1)紫外線消毒 用于消毒空氣、操作臺面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。這是常使用的消毒方法之一。 (2)干熱滅菌 主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細胞培養(yǎng)的器皿放人干燥箱內，加熱至160℃，保溫90－120 min。用于RNA提取實驗的用品則需180℃，保溫5－8 h。 (3)濕熱滅菌 此方法也稱為高壓蒸汽滅菌，是最有效的一種滅菌方法。主要應用范圍是布類、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不發(fā)生沉淀的無機溶液(如Hanks液、PBS、20SSC等)。手動高壓滅菌鍋操作如下： ①首先查看高壓鍋內的水是否充足，放人物品蓋好蓋。 ②加熱高壓鍋。將放氣閥打開，放氣5—10 min，以排除鍋內的冷空氣。 ③待鍋內水沸騰后，落下放氣閥繼續(xù)升溫升壓，玻璃器皿等用15磅(121℃)30 min，膠塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115 ℃)20 min。調節(jié)火力大小保持該壓力。 ④停止加熱，待壓力自然下降至0再打開放氣閥排汽，開蓋，取出高壓滅菌的物品烘干。 電熱自動滅菌鍋使用說明(型號：SANYO Autoclave MLS-3020)： ①放氣筒加水至LOW水平線處，將與高壓鍋相連的導氣管插入放氣筒里，然后將放氣筒歸于原位。 ②打開高壓鍋蓋，加入蒸餾水至高壓鍋底的水位線，水位線位于V型凹槽的1／3－2／3處。 ③打開電源。 ④設定高壓溫度及時間，高壓鍋的溫度范圍為105－121℃，高壓滅菌一般采用121℃20—30 min。 ⑤把待高壓的物品置于高壓鍋內，順時針方向將exhaust鈕旋至close位置。 ⑥關閉高壓鍋蓋，旋至顯示屏上左上角的紅亮點剛出現(xiàn)為止。 ⑦按start鈕，開始高壓，在溫度達80℃時顯示器開始顯示溫度，當溫度達到所需的設定溫度時，在顯示屏的左下角有一長形的指示燈閃亮，直到高壓時間結束后指示燈滅，此時蜂鳴器報警一聲。當壓力降至0 MPa時，蜂鳴器再報警一聲。溫度降至80℃時，蜂鳴器報警10次。顯示屏溫度指示消失，此時才可打開鍋蓋。 ⑧關電源，開高壓鍋蓋，取出已滅菌的物品，烘干。 (4)濾過除菌 用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，極大地方便了操作。濾器型號按直徑大小劃分。如過濾量大的培養(yǎng)用液常用較大型號的金屬濾器(直徑90 mm、100 mm、142 mm……等)，配以過濾泵使用。過濾量較小的液體常用注射器推動的塑料小濾器(直徑20 mm、25 mm等)。濾膜孔徑有0．60 μm、0．45 μm、0．35 μm、0．22 μm、0．10μm等，以0．22 μm除菌最為保險，但對于較粘稠難濾過的液體，仍需選用孔徑較大的濾膜。 ①在過濾器上裝上微孔濾膜，孔徑為0．22μm。 ②用布包好，濕熱滅菌后使用。 2．化學消毒法 常用的消毒液有如下幾種： (1)70％(或75％)酒精：超凈臺里常備70％酒精棉球(衛(wèi)生級酒精)，用于手和一些金屬器械或工作臺面的消毒。 (2)0．1％新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺面的清潔。超凈臺旁應常備盛有0．1％新潔爾滅溶液的容器及紗布。 (3)來蘇兒水(煤酚皂溶液)：主要用于無菌室桌椅、墻壁、地面的消毒和清洗，以及空氣噴撒消毒，特別是污染細胞的消毒處理。使用濃度請按瓶上說明。 (4)0．5％過氧乙酸：是強效消毒劑，10 min即可將芽孢菌殺死。用于各種物品的表面消毒，用噴撒和擦拭方式進行。 (5)乳酸蒸氣：將乳酸放入坩鍋內用酒精燈或電爐加熱至沸騰為止。將門窗緊閉1—3 d。可將空氣中漂浮的微生物殺死。 (6)37％甲醛加高錳酸鉀：使用前先緊閉門窗。將37％甲醛用酒精燈或電爐加熱至沸騰后斷電或滅火。用一張紙盛好適量的高錳酸鉀，迅速放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣。1—3 d后方可達到消毒空氣的目的。 3．煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。 五、注意事項 1．清洗玻璃制品時，浸酸之后一定要用自來水沖洗10—15次。因為殘存的洗液對細胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬不要用硬毛刷，否則損害塑料表面后細胞不易貼壁。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個清洗。如沒有洗凈會影響下一次使用的效果。 2．干熱滅菌時，應在白天使用烤箱，并不斷觀察，以免發(fā)生意外。當溫度超過100℃時，不能再打開烤箱門。器皿烤完后，待溫度降至100℃之下才能開烤箱門。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。． 3．高壓滅菌后器皿務必晾干或烘干，以防包裝紙潮濕發(fā)霉。 4．牛血清、大部分培養(yǎng)基、胰酶和一些生物制劑是有機溶液，均不能高壓(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，異硫氰酸胍，MOPS等)。 5．濾過除菌時，濾器在使用前先裝好濾膜(有時可在上面加一層定性濾紙)，包好，經(jīng)高壓滅菌后才能使用。濾過酶類制劑時應待濾器溫度降至室溫下再進行。過濾時壓力不宜過大，壓力數(shù)字以2為宜。壓力太大時微孔濾膜可能破裂，或使某些微生物變形而通過濾膜。裝濾膜時位置要準確。另外濾器包裝時，螺釘不要擰得太緊，以防高壓蒸汽不能進入，待高壓滅菌之后，再擰緊使用。 6．使用化學消毒法時，配制75％酒精應用衛(wèi)生級，不要用化學純、分析純和優(yōu)質純酒精。來蘇兒水不能用于皮膚消毒，它對皮膚有刺激性。空氣消毒時，所有的物品要事先準備齊全并使消毒者有較方便的退出途徑。因為甲醛或乳酸加熱后放出的蒸氣對人的角膜和呼吸道上皮有嚴重的刺激和傷害作用。 六、思考題 1．哪些物品適合于高壓滅菌，并說明理由。 2．紫外線消毒的適用范圍和目的是什么? II、傳代細胞培養(yǎng)與觀察 一、實驗目的 了解傳代細胞的傳代方法及操作過程，學習觀察體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)及生長狀況 二、實驗原理 傳代培養(yǎng)是指細胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。 這種培養(yǎng)，第一步也是制備細胞懸液，當細胞長成致密單層時，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破壞。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸鹽)的混合物，做為消化液。 細胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹?shù)膶嶒灱夹g。要使細胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細胞存活所必需的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調節(jié)。二是嚴格控制無菌條件。 三、實驗用品 1、器材 解剖剪、解剖鑷、眼科剪(尖頭、彎頭)、眼科鑷(尖頭、彎頭)、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，9．9xl04Pa(15磅)滅菌30min備用。 此外，還有顯微鏡、血細胞計數(shù)器、血細胞計數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標記筆、解剖板等。 2、試劑 L磷酸鹽緩沖液(PBs) 無鈣、鎂溶液 細胞消化液：o．5％胰蛋白酶和o．4%EDTA EMEM液 3%谷氨酰胺 o．5％臺盤藍染液等 3、材料 喉癌細胞 四、實驗方法 在做傳代細胞培養(yǎng)之前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，觀察培養(yǎng)瓶中細胞是否已長成致密單層，如已長成單層，即可進行細胞的傳代培養(yǎng)。 1.營養(yǎng)液配制: EMEM液 90% 犢牛血清 10% 雙抗(1萬單位／m1) 加至約100單位／m1 3％谷氛酞胺 1m1 7．4％NaHCO3 調pH至6．8—7．0 2．換液: 在酒精燈旁打開瓶塞，倒去瓶中的細胞營養(yǎng)液。 3.消化與分裝 在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，輕輕搖動，將溶液倒出。重復上述動作。加入適量消化液（0.02%EDTA或0.04％EDTA1ml十o．5％胰蛋白酶液0.2ml）以蓋滿細胞為宜，置于室溫，停留1—2min后，翻轉培養(yǎng)瓶，肉眼觀察細胞單層是否出現(xiàn)縫隙(針孔大小的空隙)，如出現(xiàn)縫隙，即可倒去消化液；如末出現(xiàn)縫隙，則可將瓶翻回，繼續(xù)進行消化，直到出現(xiàn)縫隙為讓。此時，可倒去消化液，加入新配制的營養(yǎng)液20m1。然后用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的營養(yǎng)液，反復吹打瓶壁上的細胞層至瓶壁細胞全部脫落下來為止。此時，可繼續(xù)輕輕地吹打細胞懸液，以使細胞散開。隨之進行分裝。 4．培養(yǎng) 分裝好的細胞瓶上，做好標志，注明細胞代號、日期。置于培養(yǎng)架上，輕搖使細胞均勻分布，以免堆積成團。然后置于37℃培養(yǎng)。 5.觀察 (1)觀察體外培養(yǎng)細胞的幾個問題； 細胞培養(yǎng)24h后，即可進行觀察，觀察的重點如下： A.首先要觀察培養(yǎng)細胞是否污染。主要觀察培養(yǎng)液顏色的變化及混濁度 B.觀察培養(yǎng)姬顏色變化及細胞是否生長。 C.如細胞已生長，則要觀察細胞的形態(tài)特征并判斷其所處的生長階段。觀察時可參照(2)的描述進行。 D．觀察完畢，可用臺盤藍染液對細胞進行染色。以確定死、活細胞的比例。 (2)細胞的生長階段及其形態(tài)特征 傳代培養(yǎng)的細胞需逐日進行觀察，注意細胞有無污染，培養(yǎng)液顏色的變化及細胞生長的情況。—般中層培養(yǎng)的細胞，從培養(yǎng)開始，經(jīng)過生長、繁殖、衰老及死亡的全過程。它是一個連續(xù)的生長過程，但為了觀察及描述，人為地將具分為5個時期，但各期間無明顯絕對界限。現(xiàn)分別描述如下： A．游離期：當細胞經(jīng)消化分散成單個細胞后，由于細胞原生質的收縮相表面張力以及細胞膜的彈性。所以，此時細胞多為圓形，折光率高，此期可延續(xù)數(shù)h。 B．吸附期(貼壁)：由于細胞的附壁持性，細胞懸液靜置培養(yǎng)一段時間(約7—8h)后，便附著在瓶壁上(此期不同細胞所需時間不同)。在顯微鏡下觀察時可見瓶壁上有各種形態(tài)的細胞，如圓形、扁形、短菱形。細胞的特點，大多立體感強，細胞內顆粒少，透明。 C.繁殖期：培養(yǎng)l2h以后直到72h，細胞進入繁殖期，加速了細胞生長和分裂。此期包括由幾個細胞形成的細胞島(即由少數(shù)細胞緊密聚集而呈現(xiàn)的孤立細胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到細胞鋪滿整個瓶壁(即所謂形成細胞單層)的過程。此期細胞形態(tài)為多角形(呈現(xiàn)上皮樣細胞的特征)。細胞特點：透明，顆粒較少，細胞間界限清楚，并可隱約見到細胞核。根據(jù)細胞所占瓶壁有效面積的百分率，又可將其生長狀況分為四級。以“十”的多少表示如下： 十：細胞占瓶壁有效面積(也就是細胞能生長的瓶壁面積)的25％以內有新生細胞。一般要觀察3—5個視野內的細胞生長狀況，然后加以綜合分析判斷。 十十：細胞占瓶壁有效面積的25—75％以內具新生細胞。 十十十：細胞占瓶壁有效面積的75—95％具新生細胞。細胞排列致密。但仍有空隙。 十十十十：細胞占瓶壁95％以上，細胞已長滿或接近長滿單層，細胞致密，透明度好。 從十十一十十十十為細胞的對數(shù)增長期(或稱為指數(shù)增長期)。 D．維持期：當細胞形成良好單層后，細胞的生長與分裂都減緩，并逐漸停止生長，這種現(xiàn)象被稱為細胞生長的接觸抑制。此時細胞界限逐漸模糊，細胞內顆粒逐漸增多，且透明度降低，立體感較差。由于代謝產(chǎn)物的不斷積累，維持液逐漸變酸。此時營養(yǎng)液已變?yōu)槌赛S色或黃色。 E．衰退期：由于溶液中營養(yǎng)的減少和日齡的增長，以及代謝產(chǎn)物的累積等因素，此時細胞間可出現(xiàn)空隙，細胞中顆粒進一步增多，透明度更低，立體感很差。若將細胞經(jīng)固定染色處理后，可見細胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，細胞皺縮，逐漸死亡，從瓶壁上脫落下來。 五、思 考 題 1．簡述細胞傳代培養(yǎng)的操作程序及注意鄉(xiāng)項。 3．細胞培養(yǎng)獲得成功的關鍵要素是什么? 3．簡述體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)特征及其生長階段。