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2019-2020年高中生物 實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離輔導(dǎo)教案 浙科版 導(dǎo)學(xué)誘思 一、大腸桿菌 1．大腸桿菌屬于革蘭氏________性菌，為_(kāi)_______型的腸道桿菌。 2．結(jié)構(gòu)：屬于________生物。 3．用途：是在________技術(shù)中被廣泛采用的工具。 4．與人類(lèi)的關(guān)系：它生活在人類(lèi)的________中，一般對(duì)人________(“有”還是“無(wú)”)害。有一些菌株對(duì)人體能產(chǎn)生危害，因?yàn)樗鼈兛梢郧治g________并產(chǎn)生________。任何大腸桿菌如果進(jìn)入人的________系統(tǒng)，都會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。 答案：1.陰　兼性厭氧 2．原核 3．基因工程 4．腸道　無(wú)　腸黏膜　毒素　泌尿 二、細(xì)菌的培養(yǎng)和分離 1．細(xì)菌的培養(yǎng)： (1)細(xì)菌的繁殖：細(xì)菌以________的方式繁殖，分裂速度很快，約________分裂一次。 (2)培養(yǎng)細(xì)菌的方法：培養(yǎng)細(xì)菌，需要將________________________________________________________________________ 轉(zhuǎn)移到________中，一般用________來(lái)轉(zhuǎn)移帶菌的培養(yǎng)物。 (3)用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌的差別： 接種后，培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基類(lèi)型 接種方法 接種后培養(yǎng)的時(shí)間(單位：小時(shí)) 培養(yǎng)結(jié)果 液體培養(yǎng)基 接種環(huán)直接接種 培養(yǎng)8 h后 每毫升培養(yǎng)基中有________個(gè)細(xì)菌 固體培養(yǎng)基 用接種環(huán)在培養(yǎng)基上用________________________________________________________________________的方式接種(該法還可以用于______) 培養(yǎng)10～20 h后 一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞會(huì)繁殖成許多個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，這些細(xì)胞________________________________________________________________________________，形成____________________________________________________________ 2.細(xì)菌的分離： (1)分離的方法與特點(diǎn)：分離細(xì)菌有________和________2種。前者方法簡(jiǎn)單，后者操作復(fù)雜，但是______________________________________________________________更易分開(kāi)。 (2)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行大腸桿菌分離，是用________法，就是在________培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)菌的________。 答案：1.(1)分裂　20 min　(2)已有細(xì)菌的培養(yǎng)物　新的培養(yǎng)基　接種環(huán)　(3)幾億　劃線　分離細(xì)菌　緊緊聚集在一起 菌落 2.(1)劃線分離法　涂布分離法　單菌落　(2)劃線分離 固體平面　劃線培養(yǎng) 三、滅菌操作 1．滅菌操作的原因：為了獲得________的培養(yǎng)物，其關(guān)鍵是防止外來(lái)________的入侵污染。因此，在培養(yǎng)微生物時(shí)必須進(jìn)行________操作。 2．無(wú)菌操作的條件： (1)首要條件是________必須是無(wú)菌的； (2)________必須是無(wú)菌的； (3)________的過(guò)程必須是無(wú)菌的等。 答案：1.純凈　雜菌　無(wú)菌 2．(1)各種器皿　(2)各種培養(yǎng)基　(3)菌轉(zhuǎn)移操作 四、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn) 1．實(shí)驗(yàn)?zāi)康模? (1)進(jìn)行大腸桿菌的________，利用________培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作； (2)進(jìn)行大腸桿菌的________，用________培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的________培養(yǎng)； (3)說(shuō)明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和操作要求的原理。 2．實(shí)驗(yàn)步驟 (1)滅菌：用________在________壓力下對(duì)LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進(jìn)行滅菌________min。 (2)自________向________中轉(zhuǎn)移并分裝固體培養(yǎng)基： 待冷卻至______左右，將三角錐形瓶中的______培養(yǎng)基，在______上分裝至幾個(gè)______中，制成______培養(yǎng)基。 (3)將大腸桿菌自________轉(zhuǎn)移到________中的________培養(yǎng)基中培養(yǎng)： 將大腸桿菌用________在無(wú)菌操作下接種至三角錐形瓶中的________培養(yǎng)基中，在________搖床振蕩培養(yǎng)________，完成大腸桿菌的培養(yǎng)。 (4)將菌液在________培養(yǎng)基上進(jìn)行________分離： 從前一步培養(yǎng)得到的菌液中獲取菌種，用________以__________法接種至第二步所制得的__________培養(yǎng)基中，在________℃恒溫箱中培養(yǎng)________h后觀察菌落。 (5)菌種保存： 在無(wú)菌操作下將________用________取出，再用________法接種在________上，________培養(yǎng)________后，________冰箱保存。 3．分離實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及相應(yīng)結(jié)論： 觀察中若看到在________的末端出現(xiàn)________，則表明菌已被分離了。 4．大腸桿菌分離的用途：________的通用方法，也是用于________的最簡(jiǎn)便方法之一。 答案：1.(1)擴(kuò)增　液體　(2)分離　固體平面　劃線 2．(1)高壓鍋　1 kg　15　(2)三角瓶　培養(yǎng)皿　60 ℃ 固體　超凈臺(tái)　培養(yǎng)皿　固體平面　(3)斜面　三角瓶　液體 接種環(huán)　液體　37 ℃　12 h　(4)固體平面　劃線　接種環(huán) 劃線　固體平面　37　12～24　(5)單菌落　接種環(huán)　劃線　斜面　37 ℃　24 h　4 ℃ 3．劃線　不連續(xù)的單個(gè)菌落 4．消除污染雜菌　篩選高表達(dá)量菌株 核心解讀HEXINJIEDU 1．微生物、細(xì)菌與大腸桿菌之間有怎樣的關(guān)系？ (1)概念內(nèi)涵：其關(guān)系圖解見(jiàn)下 (2)結(jié)構(gòu)上：三者都是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，形體微小的生物，但是從細(xì)胞角度看其結(jié)構(gòu)是不同的，具體如下： 2．培養(yǎng)大腸桿菌的LB培養(yǎng)基中有各種物質(zhì)，為什么選擇這些物質(zhì)，這些物質(zhì)有什么作用呢？ (1)人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出了供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)——培養(yǎng)基。雖然各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都含有五大營(yíng)養(yǎng)要素，即水、無(wú)機(jī)鹽、碳源(提供碳元素)、氮源(提供氮元素)和生長(zhǎng)因子(不同的細(xì)菌需要的各不相同，有物種差異，它主要補(bǔ)充自身不能合成的或合成能力較弱的，但卻是生長(zhǎng)繁殖必需的物質(zhì))。見(jiàn)下表： 微生物的營(yíng)養(yǎng)要素 定義 功能 類(lèi)型 化合物類(lèi)型 常用物質(zhì) 碳源 凡可構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳架來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)稱(chēng)為碳源 構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)，供給微生物生長(zhǎng)發(fā)育所需要的能量 無(wú)機(jī)碳(自養(yǎng)型微生物用) 無(wú)機(jī)物 CO2、NaHCO3、CaCO3等 有機(jī)碳(異養(yǎng)型微生物用) 蛋白質(zhì)、核酸類(lèi) 牛肉膏、蛋白胨、花生粉餅、明膠、氨基酸等 糖類(lèi)脂質(zhì)等 葡萄糖、蔗糖、淀粉等 氮源 凡是構(gòu)成微生物的細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮素來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)稱(chēng)為氮源 主要是提供合成原生質(zhì)和細(xì)胞其他結(jié)構(gòu)的原料，一般不作能源 無(wú)機(jī)氮 銨鹽 NH3、(NH4)2SO4 硝酸鹽 KNO3 N2 空氣 有機(jī)氮 牛肉膏、蛋白胨、醇母膏、尿素、明膠等 生長(zhǎng)因子 一類(lèi)對(duì)微生物正常代謝必不可少且又不能從簡(jiǎn)單的碳、氮源自行合成的所需極微量的有機(jī)物 一般是酶和核酸的組成成分 酵母膏、玉米漿、黃豆餅粉、動(dòng)植物組織液、麥芽汁等，復(fù)合維生素 水 作用：組成成分；反應(yīng)介質(zhì)；物質(zhì)運(yùn)輸媒體；熱的良導(dǎo)體 無(wú)機(jī)鹽 作用：維持滲透壓、pH等 (2)大腸桿菌的LB培養(yǎng)基 微生物的營(yíng)養(yǎng)要素 本實(shí)驗(yàn)中大腸桿菌LB培養(yǎng)基配方 培養(yǎng)基配方與微生物營(yíng)養(yǎng)要素的對(duì)應(yīng)關(guān)系 LB液體培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基 氮源、 碳源、 無(wú)機(jī)鹽、 生長(zhǎng)因子、 水 瓊脂1 g 蛋白胨0.5 g 主要提供大腸桿菌的氮源、碳源需求 酵母提取物0.25 g 主要提供生長(zhǎng)因子 NaCl　0.5 g 提供無(wú)機(jī)鹽 水　50 mL 提供水 (3)此外配方中還要注意pH等。 3．該實(shí)驗(yàn)中這些操作的原因 (1)三角錐形瓶中的LB固體培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60 ℃左右時(shí)，才用來(lái)轉(zhuǎn)移和分裝，制成固體平面培養(yǎng)基，為什么？你用什么簡(jiǎn)易方法快速估計(jì)該溫度？ 因?yàn)槿清F形瓶中的LB固體培養(yǎng)基中有瓊脂，它在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，當(dāng)冷卻到60 ℃左右時(shí)，不會(huì)因溫度過(guò)高燙手而不易操作；也不會(huì)因?yàn)闇囟冗^(guò)低而使三角錐形瓶中的培養(yǎng)基凝固，最終無(wú)法轉(zhuǎn)移分裝制成新的平面培養(yǎng)基。 簡(jiǎn)易估計(jì)溫度的方法：可以用手觸摸滅菌后的三角錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶由燙手轉(zhuǎn)為剛剛不燙手時(shí)，則說(shuō)明已經(jīng)冷卻到60 ℃左右了。 (2)進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí)，為什么要將培養(yǎng)皿倒置？ 恒溫培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中的水分會(huì)以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會(huì)使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋子上；如果正放培養(yǎng)皿，則水分形成的水滴會(huì)落入培養(yǎng)基表面并且擴(kuò)散開(kāi)。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則菌落中的菌會(huì)隨水?dāng)U散，菌落間相互影響，很難再分成單菌落，達(dá)不到分離的目的，培養(yǎng)皿中的菌落還有可能被蓋子上掉落的水給污染。 (3)將大腸桿菌用接種環(huán)自斜面轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，為什么接種環(huán)必須先深入到斜面冷卻后，才能再取斜面上的菌體？ 接種環(huán)在取菌體前曾在酒精燈火焰上灼燒滅菌，一直灼燒至紅，溫度很高，若不冷卻就直接用其取斜面上的菌體，菌體可能因?yàn)榻佑|高溫接種環(huán)而死亡，導(dǎo)致大腸桿菌的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)失敗。 (4)用劃線法分離大腸桿菌中，第一次和隨后的幾次劃線前都要灼燒接種環(huán)，它們的原因一樣嗎？在劃線結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán)這又是為什么呢？ 雖然每次灼燒都是為了滅菌，但所滅的菌種和原因卻不一樣。 灼燒接種環(huán)的時(shí)間 消滅的菌體 原因 第一次劃線前 其他雜菌 防止其他雜菌的侵入而造成污染 隨后的幾次劃線前 上次劃線結(jié)束后殘留在接種環(huán)上的實(shí)驗(yàn)菌(本實(shí)驗(yàn)為：大腸桿菌) 為了使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌來(lái)自上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，最終獲得單個(gè)菌落，實(shí)現(xiàn)菌的分離 最后一次劃線結(jié)束后 為了防止實(shí)驗(yàn)菌殘留于接種環(huán)而污染環(huán)境和感染實(shí)驗(yàn)人員 (5)用劃線法分離大腸桿菌時(shí)，每次的劃線是怎么樣的？對(duì)隨后的劃線的起點(diǎn)有什么要求？為什么這樣要求呢？ 每一次的劃線 依次的2次劃線之間的關(guān)系 各次劃線的分布 圖形輔助理解 劃線的要求 不能出現(xiàn)線條的重疊 第二次以及隨后的劃線操作，總是從上一次劃線的末端開(kāi)始 不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連 這樣要求的原因 使線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少 因?yàn)閯澗€后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終得到有單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的單菌落 若相連，則可能最后一次劃線末端處的細(xì)菌與第一次的疊加，細(xì)菌的數(shù)目不是最少的，不能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終將很難獲得單菌落 4．消毒與滅菌一樣嗎？ 概念 常用方法 應(yīng)用的范圍 消毒 使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法：在100 ℃煮沸5～6 min 一般物品 巴氏消毒法：70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min 對(duì)于一些不耐高溫的液體，如牛奶 化學(xué)藥劑消毒法 如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等 滅菌 使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物(包括芽孢和孢子) 灼燒滅菌：酒精燈火焰 接種工具的滅菌 干熱滅菌：160～170 ℃下滅菌1～2 h 玻璃器皿、金屬工具的滅菌 高壓蒸汽滅菌：121 ℃條件下，滅菌15～30 min 培養(yǎng)基及容器的滅菌 5.本實(shí)驗(yàn)中還需要了解哪些基礎(chǔ)知識(shí)才更便于掌握和理解呢？ (1)牛肉膏蛋白胨的知識(shí) 牛肉膏和蛋白胨來(lái)源于動(dòng)物原料，含有糖、維生素和有機(jī)氮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 1 000 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成 培養(yǎng)基組分 提供的主要營(yíng)養(yǎng) 牛肉膏　5 g 碳源、磷酸鹽和維生素 蛋白胨　10 g 氮源和維生素 NaCl　5 g 無(wú)機(jī)鹽 H2O　定容至1 000 mL 氫元素、氧元素 　　(2)巴氏消毒法的知識(shí) 巴氏消毒法也稱(chēng)做低溫消毒法。 日常生活中經(jīng)常用到煮沸消毒法。在100 ℃煮沸 5～6 min 可以殺死微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和一部分芽孢。對(duì)于一些不耐高溫的液體，如牛奶，則使用巴氏消毒法，在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min，可以殺死牛奶中的微生物，并且使牛奶的營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞。 題例領(lǐng)悟TILILINGWU 【例題1】 下列操作屬于滅菌的是(　　) A．用酒精擦拭實(shí)驗(yàn)人員的雙手 B．用氯氣處理水源 C．將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒至紅 D．殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物 解析：此題考查對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)中滅菌的理解。對(duì)微生物培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，滅菌操作十分重要，其目的就是為了獲得純凈的培養(yǎng)物，其關(guān)鍵是防止外來(lái)一切雜菌的入侵，不僅僅是對(duì)人體有害的微生物。滅菌操作一般使用強(qiáng)烈的物化因素(如：灼燒滅菌、高壓蒸汽滅菌等)。而不是使用較為溫和的物化方法。 答案：C 消毒與滅菌是不同的。兩者除了在物化手段上是否強(qiáng)烈外，所消滅的微生物內(nèi)容也是不同的。滅菌是消除一切雜菌，而消毒僅僅殺死對(duì)人體有害的微生物。消毒往往無(wú)法消滅微生物的芽孢和孢子。 【例題2】 下列關(guān)于平板劃線的操作及敘述，正確的是 … (　　) A．灼燒接種環(huán)之后，為避免其他雜菌的干擾，應(yīng)立即伸入菌液取菌種 B．劃線結(jié)束后，為避免實(shí)驗(yàn)菌污染環(huán)境和感染操作者，所以必須再次灼燒接種環(huán) C．在第一次劃線前灼燒接種環(huán)和每次劃線前灼燒接種環(huán)的目的相同 D．劃線時(shí)最后一區(qū)域一定要與第一區(qū)域相連，達(dá)到首尾相接 解析：此題考查對(duì)劃線法分離大腸桿菌的掌握。這是本實(shí)驗(yàn)的一大重點(diǎn)和難點(diǎn)。A的操作是錯(cuò)誤的，灼燒接種環(huán)之后，要冷卻后方能取菌種，以免溫度太高殺死菌種。B的操作完全正確。C的敘述是錯(cuò)誤的，它們的灼燒目的完全不同，第一次劃線前的灼燒是為了殺死其他雜菌，保證實(shí)驗(yàn)菌的純凈，而隨后的灼燒卻是為了殺死殘留于接種環(huán)上的實(shí)驗(yàn)菌，保證實(shí)驗(yàn)菌隨劃線次數(shù)的增加而減少，每次劃線的菌種來(lái)自上一次劃線的末端。D的操作也是不正確的，不應(yīng)該相連，這樣才能使最后一次劃線不受第一次劃線的干擾。 答案：B 大腸桿菌的分離所采用的就是劃線分離法。這一方法十分重要。我們不僅要知其每一步具體的操作，還要知其所以然，還要關(guān)注注意事項(xiàng)，避免踏入誤區(qū)。 隨堂訓(xùn)練SUITANGXUNLIAN 1細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中分別采用了高壓蒸汽、酒精、火焰灼燒等幾種不同的處理，這些方法依次用于殺滅哪些部位的雜菌(　　) A．接種針、手、培養(yǎng)基　　B．高壓鍋、手、接種針 C．培養(yǎng)基、手、接種針 D．接種針、手、高壓鍋 答案：C　解析：滅菌是微生物培養(yǎng)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。其中高壓蒸汽是為了殺滅培養(yǎng)基中的雜菌；酒精擦拭雙手，是滅手上的雜菌；而接種針在火焰上灼燒，就是為了滅接種針上的菌。故C選項(xiàng)是正確的。 2下列關(guān)于倒平板的操作姿勢(shì)的敘述中，正確的是(　　) A．右手無(wú)名指及小指夾持含有固體培養(yǎng)基的三角瓶封口膜 B．右手大拇指、食指拿著三角瓶 C．左手拿著培養(yǎng)皿，蓋子放于桌子上 D．倒平板時(shí)，為防止溫度過(guò)高，暫時(shí)熄滅酒精燈 答案：A　解析：倒平板技術(shù)是微生物技術(shù)中的基本技術(shù)。只有A是正確的。B中手指姿勢(shì)錯(cuò)誤。C錯(cuò)在培養(yǎng)皿蓋放在桌上了。D中熄滅酒精燈不對(duì)，整個(gè)過(guò)程都需在酒精燈火焰旁完成。