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第十二章：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),第一節(jié) 體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生物學(xué)特征 第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù) 第三節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查和特性鑒定 第四節(jié) 細(xì)胞同步化 第五節(jié) 器官培養(yǎng),動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是用無(wú)菌操作的方法將動(dòng)物體內(nèi)的組織或器官取出，模擬動(dòng)物體內(nèi)的生理?xiàng)l件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)育及衰老等生命現(xiàn)象的技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)有很多優(yōu)越性，但也有不足之處。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)，免疫學(xué)，遺傳學(xué)，腫瘤學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，毒理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)生產(chǎn)出了多種生物制品，如狂犬病疫苗，干擾素，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素。,第一節(jié)體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生物學(xué)特征,一、體外培養(yǎng)物的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn) （一）生物學(xué)特征的兩重性 1、基本生物學(xué)特征與體內(nèi)細(xì)胞相似 體外培養(yǎng)的細(xì)胞不僅存在細(xì)胞和基質(zhì)的相互關(guān)系， 而且細(xì)胞和細(xì)胞之間在形態(tài)和機(jī)能上還存在著相互關(guān)系 2、差異性 細(xì)胞離體后，失去神經(jīng)和體液調(diào)節(jié)以及細(xì)胞間的相互影響，在體外培養(yǎng)條件下可能會(huì)出現(xiàn)分化現(xiàn)象減弱，形態(tài)功能單一化，生存一定時(shí)間后衰退死亡，出現(xiàn)連續(xù)生長(zhǎng)的細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系等。因此體外培養(yǎng)的細(xì)胞可視為一種在特定條件下的細(xì)胞群體，它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本機(jī)構(gòu)和功能，也有不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。,（二）培養(yǎng)細(xì)胞分化狀態(tài)的改變,1、分化 在個(gè)體發(fā)育的過程中，細(xì)胞后代的形態(tài)和功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異過程稱為細(xì)胞分化。細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，其原有的功能可能會(huì)迅速改變或消失，但其分化能力并未完全喪失。細(xì)胞是否分化，關(guān)鍵是在于是否存在使細(xì)胞分化的條件，把表皮細(xì)胞放在企業(yè)界面上培養(yǎng)，可分化成含大量角蛋白絲的膠質(zhì)細(xì)胞，但這種能力會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸喪失。 2、去分化 去分化也叫脫分化是指各種分化細(xì)胞，逐漸失去各自的形態(tài)與功能個(gè)性，表現(xiàn)出某種趨同性的過程。,二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài),當(dāng)細(xì)胞初一較好的培養(yǎng)條件時(shí)，形態(tài)上有相對(duì)的一致性。在一定程度上能反映細(xì)胞的起源以及正常和異常的區(qū)別，故可作為細(xì)胞形態(tài)學(xué)的一個(gè)指標(biāo)或依據(jù)。但它可受很多因素的影響而發(fā)生改變。 （一）貼附型細(xì)胞和懸浮型細(xì)胞 1、貼附型細(xì)胞（見下圖） 1） 成纖維細(xì)胞型 2 ）上皮細(xì)胞型 3 ）游走細(xì)胞型 4 ）多形細(xì)胞型 2、懸浮性細(xì)胞,懸浮性細(xì)胞,,（二）細(xì)胞帖壁過程,對(duì)于貼壁型細(xì)胞，在液體環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，基本呈圓形，當(dāng)附于支持物表面后，開始仍為圓形，但很快會(huì)發(fā)生形態(tài)上的改變，轉(zhuǎn)變?yōu)閳A餅形即放射延展細(xì)胞。在1/2至2小時(shí)后，過渡為極性細(xì)胞，可呈紡錘形，三角形或不規(guī)則多角形等各種形態(tài)。 支持物能影響貼附，底物表面不潔不利于貼附，底物表面帶有陽(yáng)性電荷利于貼附，一些特殊物質(zhì)如LETS，細(xì)胞表面蛋白等也參與貼附過程。,（三）接觸抑制和密度抑制,細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中，細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長(zhǎng)空間漸趨減少，最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如果培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制 當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。,三、培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力,體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)處于動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或其他容器。生存空間和營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)增殖到一定密度時(shí)，則需分離出一部分細(xì)胞并跟新營(yíng)養(yǎng)液，否則將會(huì)影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程稱傳代 （一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期、 培養(yǎng)細(xì)胞生命期是指細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。正常細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，不論細(xì)胞的種類和供體的年齡如何，在細(xì)胞生存全過程中，基本經(jīng)歷以下三個(gè)階段。,,1、原代培養(yǎng)基 原代培養(yǎng)基也稱初代培養(yǎng)基，即從動(dòng)物機(jī)體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)一到四周。此期的細(xì)胞移動(dòng)活躍，可見細(xì)胞活躍，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。原代培養(yǎng)的細(xì)胞于體內(nèi)相應(yīng)的細(xì)胞性狀相似，更能代表其來(lái)源組織的細(xì)胞類型及組織特異性。 2、傳代期 初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱為細(xì)胞系。此期最長(zhǎng)，細(xì)胞增殖旺盛，能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期冷凍。如不冷凍則要反復(fù)傳代。一般，傳代十至五十次左右，細(xì)胞增殖逐漸減慢，甚至停止，進(jìn)入衰退期。 3、衰退期 衰退期的細(xì)胞雖然能存活，但增殖很慢并逐漸停止，進(jìn)而發(fā)生衰退死亡,,傳代細(xì)胞由于目中因素的影響，可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化，其標(biāo)志是細(xì)胞獲得永生性或惡性性。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲得永久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無(wú)限細(xì)胞系。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。轉(zhuǎn)化細(xì)胞除了比正常細(xì)胞能分裂更多的代數(shù)之外，還具有不受細(xì)胞密度的影響，不具有接觸抑制現(xiàn)象和細(xì)胞形狀不規(guī)則，出現(xiàn)異常染色體的特性。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。 （二）培養(yǎng)細(xì)胞“一代”生存期 體外培養(yǎng)的細(xì)胞當(dāng)生長(zhǎng)達(dá)到一定密度后，都需要做傳代處理。 所謂細(xì)胞“一代”是指從細(xì)胞接種到分離在培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間。它與細(xì)胞世代和倍增不同，在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增三至六次。每一代的細(xì)胞群體都會(huì)經(jīng)歷以下四個(gè)階段：1、潛伏期 2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 3、穩(wěn)定期 4、衰亡期,,1、潛伏期：細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個(gè)在培養(yǎng)液中懸浮狀態(tài)的懸浮期，此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于第五表面上的過程，稱為貼壁，懸浮期結(jié)束。 細(xì)胞貼附于支持物后，要經(jīng)過一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。細(xì)胞處于潛伏期可有運(yùn)動(dòng)行為，基本無(wú)增殖，少見分裂相。細(xì)胞潛伏期和細(xì)胞密度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，24至96h或更長(zhǎng)，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅6～24h；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。 2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。這是細(xì)胞增長(zhǎng)最旺盛的階段。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)MI表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。 MI=（分裂相個(gè)數(shù)/1000個(gè)細(xì)胞）×100% 3、穩(wěn)定期 細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞逐漸停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)逐漸耗盡，代謝產(chǎn)物積累，ph降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，甚至從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。 4、衰亡期 一個(gè)達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期的細(xì)胞群體，由于生長(zhǎng)環(huán)境的繼續(xù)惡化和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的短缺，群體中細(xì)胞死亡率則逐漸上升，以致細(xì)胞死亡數(shù)逐漸超過新生細(xì)胞數(shù)，群體中活細(xì)胞數(shù)下降。,,,,（二）原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng),1、原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)即第一次培養(yǎng)，是指將培養(yǎng)物放置在體外生長(zhǎng)環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。由于原代細(xì)胞離體時(shí)間短，其原有的生物學(xué)特征仍然保持。一般在原代培養(yǎng)時(shí)期合適于作藥物測(cè)試，細(xì)胞分化等方面的研究。 （1）組織塊培養(yǎng)法 1）薄層培養(yǎng)法 2）翻轉(zhuǎn)干涸法,,1、取材修剪沖洗 2、剪切成1mm^3 小塊 3、移入培養(yǎng)瓶 4、分布組織小塊間距5mm 5翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶并加培養(yǎng)液37*c靜止1~2h 6、翻正培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng) 7、原代細(xì)胞培養(yǎng),（2）分散細(xì)胞培養(yǎng)法,1）機(jī)械分散法 采用一些纖維成分很少的組織進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以直接用分散法進(jìn)行分散?？蓪⒔M織直接用剪刀剪切，用吸管吸打，這種對(duì)組織損傷較大，一般可用注射器針心擠壓通過不銹鋼網(wǎng)的方法。 2）消化分散法 使用生物化學(xué)的方法將剪碎的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞的方法。消化培養(yǎng)法可以將細(xì)胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等去除，是的細(xì)胞分散，形成懸液，適用于大量組織的分離。常用的消化液有胰蛋白酶，膠原酶。另外，鏈酶蛋白酶，黏蛋白酶，蝸牛酶等也可以用于細(xì)胞的分化。 膠原酶是從細(xì)菌中提取的酶，對(duì)膠原和細(xì)胞間質(zhì)有較強(qiáng)的消化作用，適用于分離纖維性組織，上皮組織和癌組織，Ga Mg 和血清成分不會(huì)影響膠原酶的消化作用，作用溫和，無(wú)須機(jī)械振動(dòng)。其常用量為200iu/ml,胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。,,2、傳代培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)增殖一段時(shí)間到達(dá)一定的細(xì)胞密度后，就應(yīng)當(dāng)將細(xì)胞分離到新的培養(yǎng)器皿并補(bǔ)充新的培養(yǎng)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，即為細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。在首次培養(yǎng)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：1細(xì)胞沒有生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代，2原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長(zhǎng)，上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞并存的情況很多見，傳代時(shí)不同的細(xì)胞有不同的傳代時(shí)間，因而要根據(jù)需要注意觀察并及時(shí)進(jìn)行處理，3首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多些，使細(xì)胞盡快適應(yīng)新的環(huán)境而李宇細(xì)胞生存和增殖。 貼壁細(xì)胞的傳代大都采用酶消化法來(lái)進(jìn)行。部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞可用直接吹打或離心分離后傳代。懸浮細(xì)胞可直接傳代。,（1）貼壁細(xì)胞的消化法傳代 （2）懸浮細(xì)胞的傳代,,,（三）細(xì)胞純化,1、自然純化 自然純化是利用某一細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，而排擠其他細(xì)胞生長(zhǎng)，最后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，去除其他細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。 2、人工純化 （1）酶消化法： 1）先用0，5%胰蛋白酶和0，02%EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞，然后再換新的混合液繼續(xù)消化，之后在導(dǎo)致的顯微鏡下觀察并不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，等到半數(shù)細(xì)胞脫落下來(lái)后，便立即停止消化。 2）吧消化液吸入離心管中，離心去上清，然后移入另一培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)，再向原瓶中也不加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過幾次反復(fù)處理，可把成纖維細(xì)胞除凈。 （2）機(jī)械刮除法 1)標(biāo)記 鏡下觀察，在培養(yǎng)皿背面圈下上皮細(xì)胞生長(zhǎng)部位 2)刮除 棄培養(yǎng)基，把無(wú)菌刀深入瓶中，肉眼或顯微鏡下刮除無(wú)標(biāo)記空間 3)沖洗 用hank‘s液沖洗1或2次，洗出被掛掉的細(xì)胞 4）培養(yǎng) 然后注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞存留，可重刮除 （3）反復(fù)貼壁法 操作方法與貼壁細(xì)胞傳代基本相同 （4）克隆法 （5）流式細(xì)胞儀技術(shù) （6）其他純化方法,（四）細(xì)胞的凍存復(fù)蘇及運(yùn)輸,1、細(xì)胞冷凍保存 （1）細(xì)胞超低溫保存的原理 細(xì)胞在-70*c以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性降低，代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵在于通過-20~0*c階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，易造成細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。如果不加保護(hù)直接冷凍，細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)晶，導(dǎo)致胞內(nèi)電解質(zhì)濃度增高，ph改變，部分蛋白質(zhì)變性，溶酶體膜受損而導(dǎo)致溶解酶釋放破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而造成細(xì)胞死亡。因此，為了減少細(xì)胞內(nèi)的冰晶形成，一般在培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑以減少冰晶形成和細(xì)胞死亡。 根據(jù)冷凍保護(hù)劑是否透過細(xì)胞膜可將其分為：1滲透性保護(hù)劑2非滲透性保護(hù)劑 最常用的保護(hù)劑為dmso本身對(duì)細(xì)菌有毒性作用，可自身滅菌。 （2）細(xì)胞冷凍過程 將對(duì)數(shù)期細(xì)胞以等體積20%DMSO培養(yǎng)液重懸，并分裝于冷凍管或安培平中，封口，然后降溫至4*c30min，冰盒10min，液氮罐氣相2h，最后投入液氮中保存。 2、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇 （1）離心法 1）取出冷凍管，迅速投入37~40*c水浴中，振蕩，使之融化。 2）吸入到10ml的培養(yǎng)液中，混懸，離心洗滌1或2次 3）取上清加培養(yǎng)液，調(diào)濃度為1*10^5~2*10^5個(gè)/ml （2）直接鋪板法 取貯存細(xì)胞，37*c水浴中快速融化，移入完全生長(zhǎng)培養(yǎng)集中，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，密度3*10^5個(gè)/ml 培養(yǎng)12~24小時(shí)，更換新鮮的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基，以去除冷凍劑。,3.細(xì)胞運(yùn)輸 1冷凍儲(chǔ)存運(yùn)輸2充液法 1）選生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，待接近或剛連接成片時(shí)去掉培養(yǎng)液，充新培養(yǎng)液，液量達(dá)到瓶頸部，擰緊螺帽，保留微量空氣； 2）妥善包轉(zhuǎn)運(yùn)送，瓶口用膠帶密封，并用棉花等做防震防壓處理。 3）到目的地后，倒出大部分培養(yǎng)液，僅保留維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需液量，置于37*c培養(yǎng)，次日傳代,,,二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法,（一）懸滴培養(yǎng)法 （二）培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 （三）培養(yǎng)板培養(yǎng)法 （四）旋轉(zhuǎn)管 培養(yǎng)法 （五）灌注小室培養(yǎng)法 （六）克隆培養(yǎng)法,,,六、單細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)主要分為三種，即多孔塑料板克隆細(xì)胞法、瓊脂培養(yǎng)法和飼養(yǎng)細(xì)胞層克隆法,1、多孔塑料板克隆細(xì)胞法 首先將細(xì)胞懸液混合均勻，在每孔內(nèi)加入，0，1ml的細(xì)胞懸液。加完后迅速蓋好蓋板，鏡檢，記錄含有單個(gè)細(xì)胞的孔。觀察時(shí)要特別注意孔底邊緣，凡不能確認(rèn)者不要計(jì)算在內(nèi)，用筆標(biāo)記。然后于co2培養(yǎng)箱進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。等到培養(yǎng)板孔內(nèi)細(xì)胞增至500~600個(gè)時(shí)，可以進(jìn)行分離培養(yǎng)。 2、瓊脂培養(yǎng) 當(dāng)瓊脂凝固時(shí)，可以把細(xì)胞接種在瓊脂表面，生長(zhǎng)成克隆后，容易分離，適于做單細(xì)胞克隆。此外，也可以用營(yíng)養(yǎng)液配成軟瓊脂，在溶解狀態(tài)下把細(xì)胞與之混合起來(lái)，細(xì)胞在松軟的瓊脂中攝取營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)，軟瓊脂培養(yǎng)是測(cè)定克隆形成率及測(cè)試轉(zhuǎn)化細(xì)胞形狀的重要手段。 3、飼養(yǎng)細(xì)胞層克隆法 此法是將飼養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)兩天后，即可接種準(zhǔn)備克隆的細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞也稱為滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過特殊處理的用做克隆底物的細(xì)胞層,,,,三、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是指在人工條件下，在細(xì)胞生物反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的方法。 （一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法 動(dòng)物細(xì)胞與微生物細(xì)胞相比有顯著差別：1）動(dòng)物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大的多，無(wú)細(xì)胞壁，耐機(jī)械強(qiáng)度低，對(duì)剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差2）倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，易受微生物感染，培養(yǎng)時(shí)需要抗生素3）培養(yǎng)過程需氧量少4）培養(yǎng)過程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在5）原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡 6）代謝產(chǎn)物具有生物活性， 生產(chǎn)成本高，但附加值也高 1、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 2、反應(yīng)器貼壁培養(yǎng) 3、懸浮培養(yǎng) 4、固定化培養(yǎng) 是將動(dòng)物細(xì)胞與非水溶性載體結(jié)合起來(lái)，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)的方法。,,固定化培養(yǎng) （1）微載體系統(tǒng) 1)微載體法 2）多空載體或大孔微載體法 其優(yōu)點(diǎn)：1比表面積大，是實(shí)心微載體的幾 倍甚至幾十倍2細(xì)胞在孔內(nèi)生長(zhǎng)，受到保護(hù)， 剪切損傷少3細(xì)胞三維生長(zhǎng)，細(xì)胞密度是實(shí) 心微載體的十倍以上，有的可達(dá)10^8個(gè)/ml 4適用于長(zhǎng)期維持培養(yǎng)5實(shí)心載體在培養(yǎng) 液中濃度怎大到一定時(shí)，細(xì)胞密度反而下降， 大孔微載體在濃度較高時(shí)，表面碰撞增加， 能促使細(xì)胞在孔內(nèi)生長(zhǎng)6最適合與蛋白質(zhì)生產(chǎn)， 因此有人預(yù)言，大孔微載體技術(shù)將成為動(dòng)物細(xì) 胞大規(guī)模培養(yǎng)的一種常用方式。 （2）中空纖維培養(yǎng)技術(shù) (3)微囊培養(yǎng)系統(tǒng),,（二）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器種類,1、攪拌式生物反應(yīng)器 1）供養(yǎng)方式 一般情況下，攪拌式反應(yīng)器常伴有鼓泡，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供所需養(yǎng)分。因動(dòng)物細(xì)胞對(duì)鼓泡敏感，所以對(duì)供養(yǎng)方式進(jìn)行改進(jìn)，生產(chǎn)了籠式供養(yǎng)方式的動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器。特點(diǎn)是既能保證混合效果又有竟可能小的剪切力，以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的要求。 2）攪拌器 改進(jìn)中，再攪拌器較薄而面積較大，或攪拌角較大而攪拌速度較低的情況下，可顯著降低剪切力。 2、氣升式生物反應(yīng)器 其是以氣體為動(dòng)力，靠導(dǎo)流裝置引導(dǎo)，形成氣液混合式的總體有序循環(huán)。 3、填充床反應(yīng)器 填充床反應(yīng)器中，細(xì)胞可以位于支持物表面，也可以包埋于支持物之中，培養(yǎng)物流經(jīng)支持物顆粒。細(xì)胞被固定于支持物之中時(shí)，填充床反應(yīng)器每單位體積能容納大量細(xì)胞。但是，填充床式固定化細(xì)胞反應(yīng)器存在許多缺點(diǎn)。由于其混合效果低，對(duì)必要的氧傳遞,ph,溫度控制和氣體產(chǎn)物的排除造成了困難。 4、流化床反應(yīng)器 其是通過流體的上升運(yùn)動(dòng)使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)即流化狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)的裝置。有魚固體顆粒和流體充分地進(jìn)行混合，因而流化床反應(yīng)器具有傳熱傳質(zhì)性能好，可使用較小顆粒催化劑，床層壓力小等特點(diǎn)。但同時(shí)也帶來(lái)固體催化劑磨損較大的不足。,（三）大規(guī)模培養(yǎng)操作方式,可分為分批式，流加式，半連續(xù)式，連續(xù)式和灌流式。其中，分批式，半連續(xù)式，連續(xù)式和植物細(xì)胞培養(yǎng)基本相同。 1、分批式培養(yǎng) 分批式培養(yǎng)是將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。反應(yīng)器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過程中和外界沒有物料交換。其體積不變，到細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成積累到一定時(shí)間，一次性收獲細(xì)胞和產(chǎn)物。周期一般在三到五天，收獲產(chǎn)物一般是在細(xì)胞快要死亡或已經(jīng)死亡后進(jìn)行。 2、流加式培養(yǎng) 是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜環(huán)境下接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，根據(jù)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和需求，流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)物或培養(yǎng)基，流加速度和消耗的速率相同按底物濃度控制相應(yīng)的流加過程，從而使細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)至較高的濃度，目標(biāo)產(chǎn)物達(dá)到較高的水平。通常流加多在指數(shù)生長(zhǎng)后期，細(xì)胞在進(jìn)入衰退期之前，添加高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在細(xì)胞衰亡后終止整個(gè)體系，進(jìn)行分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮，純化產(chǎn)物。其特點(diǎn)是能調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物的濃度。一，可以避免因某種營(yíng)養(yǎng)成分初始濃度太高而產(chǎn)生抑制現(xiàn)象。二，能防止某些限制性成分在培養(yǎng)過程中被耗盡而影響而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的生成，這是流加式操作和分批式操作的明顯不同。此外，由于新鮮營(yíng)養(yǎng)液的加入，整個(gè)過程中反應(yīng)體積變化，這也是其重要特征。,,3、半連續(xù)式培養(yǎng)、 其特點(diǎn)是培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物的體積逐漸增加，反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變；細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長(zhǎng)時(shí)間；可進(jìn)行多次回收。 4、連續(xù)式培養(yǎng) 是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該模式事將細(xì)胞接種于一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細(xì)胞達(dá)到最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)田間新鮮培養(yǎng)基。同時(shí)，含有細(xì)胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過程可以無(wú)限連續(xù)下去。其優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)。細(xì)胞濃度以及細(xì)胞的生長(zhǎng)速率可維持不變。 5、灌流式培養(yǎng) 是把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中，不斷將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式培養(yǎng)的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物的同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，一般可達(dá)10^7~10^9個(gè)/mL，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量。連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞穩(wěn)定的處在較好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。這種方法最大困難是污染概率較高，且存在長(zhǎng)期培養(yǎng)中保持細(xì)胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性以及規(guī)模放大過程中的工程問題。,（四）動(dòng)物細(xì)胞工程表達(dá)產(chǎn)品應(yīng)用,20世紀(jì)60年代初，英國(guó)AVRI研究所在貼壁細(xì)胞系BHK21中將口蹄疫病毒培養(yǎng)成功后，動(dòng)物培養(yǎng)技術(shù)在規(guī)模和可靠性方面都不斷發(fā)展，生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)藥物和疫苗越來(lái)越受人們的重視并在疾病防御方面也得到了應(yīng)用。 1、疫苗 是用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)的主要產(chǎn)品之一。美國(guó)公司應(yīng)用SV40作為載體，將乙型肝炎表面抗原基因插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，已獲得高效表達(dá)，并制成乙型肝炎疫苗。目前，已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化產(chǎn)品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰疹病毒疫苗和巨細(xì)胞病毒疫苗等。這些疫苗已被大規(guī)模應(yīng)用。 2、單克隆抗體 應(yīng)用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)各種不同的單克隆抗體是經(jīng)濟(jì)可靠地方法。英國(guó)的Celltech公司采用100L和1000L自動(dòng)氣升式培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)各種生產(chǎn)單克隆抗體的小鼠、大鼠和人的細(xì)胞株，生產(chǎn)各種單克隆抗體的產(chǎn)品，已應(yīng)用于疾病診斷、治療和免疫學(xué)研究。,,3、基因重組產(chǎn)品 動(dòng)物細(xì)胞能精確地轉(zhuǎn)譯和加工較大或更復(fù)雜的蛋白質(zhì)。此外動(dòng)物細(xì)胞還可以把人們所需的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)液內(nèi)，而從培養(yǎng)液分離蛋白質(zhì)要比細(xì)胞勻漿更容易。因此，利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式可大量生產(chǎn)基因重組產(chǎn)品。如美國(guó)的En -dotronic公司用Acusyst-P型中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)出了免疫球蛋白G、A和M，尿激酶，人生長(zhǎng)激素，乙型肝炎表面抗原等產(chǎn)品。 目前，國(guó)內(nèi)外采用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的藥物主要有重組人粒細(xì)胞集落刺激因子、a-2a干擾素、a-2b干擾素、y-干擾素、人白細(xì)胞介素-2、重組人紅細(xì)胞生成素、表皮生長(zhǎng)因子和重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。,第三節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查和特性鑒定,一、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)鑒定和細(xì)胞系（株）的建立 由于體內(nèi)和體外環(huán)境不同，培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性與體內(nèi)細(xì)胞有所不同。在培養(yǎng)細(xì)胞期間，要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)性檢測(cè)，包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、營(yíng)養(yǎng)液和微生物污染等方面。一旦細(xì)胞生長(zhǎng)成形態(tài)上單一的細(xì)胞群或細(xì)系后，還要做一系列的細(xì)胞生物學(xué)方面的檢測(cè)。 （一）、細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞形態(tài)的觀察內(nèi)容主要包括細(xì)胞的形態(tài)、核質(zhì)比例、染色質(zhì)、核仁大小和多少以及微絲微管的排列狀態(tài)等。一般生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，在相差顯微鏡下觀察，輪廓清晰，如細(xì)胞生長(zhǎng)條件改變或細(xì)胞功能不良時(shí)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可以變得不規(guī)則，如上皮細(xì)胞變成纖維類細(xì)胞。 （二）、細(xì)胞生長(zhǎng)情況 1、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是觀察細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律的重要方法。因而，在細(xì)胞的生長(zhǎng)特性觀察中，生長(zhǎng)曲線的測(cè)定是最為基本的指標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似“S”形。一般在傳代后第一天細(xì)胞數(shù)有所減少，在經(jīng)過幾天的潛伏適應(yīng)期，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，達(dá)到平臺(tái)期后生長(zhǎng)穩(wěn)定，最后衰老。 在生長(zhǎng)曲線上細(xì)胞數(shù)量增加一倍的時(shí)間，稱為細(xì)胞倍增時(shí)間，可以從曲線上換算出。細(xì)胞倍增的時(shí)間區(qū)間即細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。細(xì)胞傳代、實(shí)驗(yàn)等都應(yīng)在此區(qū)間進(jìn)行。細(xì)胞群體倍增時(shí)間的計(jì)算方法有兩種，一為通過作圖方法在細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期找出細(xì)胞增長(zhǎng)一倍所需的時(shí)間，即倍增時(shí)間；二為通過公式按細(xì)胞倍增時(shí)間計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間。常用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定方法有：,,（1）細(xì)胞計(jì)數(shù)法 1） 將細(xì)胞利用一般傳代方法進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液。經(jīng)計(jì)數(shù)后，精確地將細(xì)胞分別接種于21~30個(gè)大小一致的培養(yǎng)瓶中。每瓶細(xì)胞總數(shù)要求一致，加入培養(yǎng)液的量也要一致。細(xì)胞接種數(shù)不能過多，也不能太少，太少細(xì)胞適應(yīng)期太長(zhǎng)；數(shù)量太多細(xì)胞將很快進(jìn)入增殖穩(wěn)定期，需要在短期內(nèi)進(jìn)行傳代，生長(zhǎng)曲線不能確切反應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。一般接種數(shù)量以7~10天能長(zhǎng)滿而不發(fā)生生長(zhǎng)抑制為度。同種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線先后測(cè)定要采用同一接種密度，這樣才能做縱向比較。不同細(xì)胞也要接種細(xì)胞數(shù)相同，才能進(jìn)行比較。 2)每天或隔天取出3瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值。一般每隔24h取1瓶，連續(xù)觀察一至二周或到細(xì)胞總數(shù)有 明顯減少為止。培養(yǎng)三到五天后常要給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液。 3）以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，連接成曲線后即成該細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。 （2）四唑鹽比色實(shí)驗(yàn) 四唑鹽是一種能接受氫原子的燃料，簡(jiǎn)稱MTT?；驹硎腔罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反應(yīng)其細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量和細(xì)胞數(shù)成正比。它的特點(diǎn)是靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，無(wú)放射性污染。 （3）CCK-8試劑盒檢測(cè)法 其基本原理是，該試劑中含有WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲贊產(chǎn)物。生成的數(shù)量和活細(xì)胞的數(shù)量成正比，細(xì)胞增殖越多，則顏色越深。 CCK-8與MTT的不同之處在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的，不需要再吸出培養(yǎng)液加入有機(jī)溶劑溶解這一步，因此可以減少誤差。優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性和靈敏度優(yōu)于MTT，對(duì)細(xì)胞毒性小。,2、細(xì)胞分裂指數(shù),分裂指數(shù)是指細(xì)胞群體中分裂細(xì)胞所占的百分比，即細(xì)胞群的分裂相數(shù)/1000個(gè)細(xì)胞。獲得細(xì)胞相數(shù)值后，可以繪制成細(xì)胞分裂指數(shù)曲線。一般細(xì)胞分裂指數(shù)曲線與生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)一致，但細(xì)胞增長(zhǎng)進(jìn)入停滯期后，細(xì)胞數(shù)值增大，而分裂相完全消失。,3、細(xì)胞接種存活率 細(xì)胞接種存活率=（貼壁存活細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）x100% 4、細(xì)胞周期 （1）放射性核素標(biāo)記自顯影法 在細(xì)胞進(jìn)入增殖期后，可以用川標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷處理30min后，每隔30min取材，直到48h為止。觀察和計(jì)算細(xì)胞分裂相出現(xiàn)的時(shí)間、高峰和消失分裂相數(shù)，繪制成圖進(jìn)行分析。 （2）流式細(xì)胞儀測(cè)定法 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用消化法制成細(xì)胞懸液，使細(xì)胞成為單個(gè)細(xì)胞，不能成團(tuán)。然后根據(jù)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)步驟進(jìn)行操作。最后通過計(jì)算機(jī)分析結(jié)果計(jì)算出細(xì)胞周期。,,,5、細(xì)胞活力的檢測(cè) 細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，某些燃料可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合而著色。而活細(xì)胞能阻止這類染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。借此可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。 1）臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn) 死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞據(jù)染，從而達(dá)到區(qū)別培養(yǎng)細(xì)胞活力的目的。 2）伊紅Y排斥實(shí)驗(yàn) 本法與臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)類似，但用伊紅Y染色后，活細(xì)胞與死細(xì)胞的對(duì)比度不如臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)。 3）苯胺黑排斥實(shí)驗(yàn) 死細(xì)胞被染成黑色，活細(xì)胞不被染色。,,（三）培養(yǎng)細(xì)胞種屬鑒定的方法 1、熒光抗體染色鑒別細(xì)胞的種屬 利用間接熒光抗體染色技術(shù)對(duì)細(xì)胞系的種系進(jìn)行鑒定。步驟是用兔身上產(chǎn)生的特異性抗血清標(biāo)記待檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞，然后加標(biāo)記有熒光染料異硫氰酸熒光素的山羊抗兔免疫球蛋白抗體，加上的熒光抗體將結(jié)合到已標(biāo)記有兔抗體的靶細(xì)胞上，借助熒光即可看到抗原-抗體復(fù)合物。 2同工酶譜系鑒別細(xì)胞種屬 通過確定6-磷酸葡萄糖脫氫酸，乳酸脫氫酶和核苷酸酸化酶的淀粉膠電泳的遷移率，鑒定細(xì)胞系的種屬。該法有高度的可靠性，G6PD、LDH、NP的電泳遷移率差異不僅可用來(lái)鑒別細(xì)胞系種屬，還可查出種內(nèi)細(xì)胞的交叉污染。根據(jù)同種異體同工酶的表型和正常人群體的表型頻率資料，可以估計(jì)出一特定細(xì)胞系遺傳特征出現(xiàn)的頻率。 3、染色體分析 用顯微鏡觀察細(xì)胞核型特點(diǎn)，進(jìn)行染色體核型分析。包括檢測(cè)染色體數(shù)量，標(biāo)記染色體的有無(wú)，帶型等。親緣關(guān)系近的靈長(zhǎng)類細(xì)胞系之間和人癌細(xì)胞之間的比較可用Giemsa現(xiàn)代分析 4、人主要組織相容性抗原 人主要組織相容性抗原又稱人類白細(xì)胞抗原，存在于大多數(shù)有核細(xì)胞膜上，常用的抗原檢測(cè)是用補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，用拒染來(lái)鑒定細(xì)胞活性。個(gè)別情況需要改動(dòng)，主要的變化原因是HLA血清中的非特異性抗體的出現(xiàn)。細(xì)胞系上存在特定的HLA同種異體抗原，細(xì)胞吸收抗血清中已知特性的HLA同種異體抗體，由吸收后細(xì)胞毒效應(yīng)減少量而得知細(xì)胞表面HLA抗原的情況。 5、核酸技術(shù) 用重組DNA技術(shù)或DNA探針技術(shù)鑒定和定量培養(yǎng)細(xì)胞中等位基因的多效性。,四、細(xì)胞系（株）的建立,1、建立細(xì)胞系的要求 1）組織來(lái)源 應(yīng)說明細(xì)胞供體所屬物種是來(lái)自人體，動(dòng)物或其他；供體的年齡，性別，取材的器官或組織。 2）細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè) 應(yīng)了解細(xì)的一般和特殊的生物學(xué)特性，特異性；看其是否有特殊產(chǎn)物包括分泌蛋白或激素等。 3）培養(yǎng)條件和方法 各種細(xì)胞都有自己比較適應(yīng)的生存環(huán)境。因此，應(yīng)指明使用的培養(yǎng)基，血清種類，用量以及細(xì)胞生存的適宜ph等。 2、培養(yǎng)細(xì)胞的命名 HeLa：為供體患者的姓名(來(lái)源于宮頸癌) CHO:中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞(chinese hamster ovary) 宮-743：宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立 NIH3T3:美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所建立每3天傳代，每次接種3x10^5個(gè)/ml 3、已建立細(xì)胞系的鑒定、管理和使用 按國(guó)際慣例，當(dāng)一個(gè)細(xì)胞系或細(xì)胞株建立后，研究者需要認(rèn)真負(fù)責(zé)地把有關(guān)資料在雜志或期刊上報(bào)道，詳細(xì)介紹上述個(gè)項(xiàng)目即可。建立細(xì)胞系后，還要對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行維持：記錄好細(xì)胞系檔案；注意保持其規(guī)律性；細(xì)胞系傳代要防止交叉污染；每一種細(xì)胞系有凍存儲(chǔ)備。,二、培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)檢查,（一）培養(yǎng)液和ph檢查 培養(yǎng)液一般情況下是呈桃紅色，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，由于CO2積累過多，培養(yǎng)液會(huì)發(fā)生酸化變黃，如果不及時(shí)調(diào)整ph，會(huì)對(duì)細(xì)胞發(fā)生不利的影響，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞脫落發(fā)生死亡。 （二）細(xì)胞生長(zhǎng)情況分析 在很多情況，最先從組織又走出的為游走細(xì)胞，他們單獨(dú)活動(dòng)，形態(tài)不規(guī)則，用縮時(shí)逐格顯微電泳法可以揭示出它們活躍的變形，游走和吞噬活動(dòng)。游走細(xì)胞之后，接著出現(xiàn)的是成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞，此時(shí)的細(xì)胞很少分裂。只有當(dāng)細(xì)胞分裂出現(xiàn)以后，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，形成較大的生長(zhǎng)暈或連接成片時(shí)，進(jìn)入生長(zhǎng)狀態(tài)。上皮細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中還常產(chǎn)生溶解酶，使得細(xì)胞發(fā)生液化，導(dǎo)致細(xì)胞相互分離，形成所謂的拉網(wǎng)現(xiàn)象，可能導(dǎo)致細(xì)胞脫落。,（三）培養(yǎng)細(xì)胞的污染檢測(cè)和排除,1、污染途徑 1)空氣 空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑。應(yīng)將培養(yǎng)設(shè)施設(shè)在避風(fēng)場(chǎng)所，做到無(wú)菌操作。 2）器材 各種培養(yǎng)器皿、器械消毒不徹底和洗刷不干凈可導(dǎo)致污染，另外co2培養(yǎng)箱等如果不定期消毒，可能引起污染。 3）操作 實(shí)驗(yàn)無(wú)菌操作意識(shí)不強(qiáng)，技術(shù)不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴(yán)等，都可造成污染。培養(yǎng)兩種以上細(xì)胞是，操作不規(guī)范，交叉使用吸管和培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶等有可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。 4）血清 有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染源。 5）組織樣本 原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來(lái)源于組織樣本，取材時(shí)碘酒消毒后脫碘不徹底，可造成碘混入組織，細(xì)胞或培養(yǎng)液中，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。,,2、污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染的檢測(cè) 1）細(xì)菌污染 常見的細(xì)菌污染有大腸桿菌，假單胞菌和葡萄球菌。細(xì)菌污染初期由于培養(yǎng)體系的抗生素作用，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)不受明顯限制，污染情況用倒置顯微鏡觀察不易判斷。懷疑培養(yǎng)細(xì)胞有污染時(shí)，取10ml細(xì)胞懸液，100r/min離心5min，沉淀中加入無(wú)抗生素培養(yǎng)液2ml，將細(xì)胞放培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24小時(shí)內(nèi)可以獲得陽(yáng)性結(jié)果。當(dāng)污染的細(xì)菌量比較大或細(xì)菌增殖到一定基數(shù)，增殖的細(xì)菌就可以導(dǎo)致培養(yǎng)液外觀渾濁。肉眼就可以判斷。 2)真菌污染 一般真菌污染易發(fā)現(xiàn)，有白色或黃色污染物。在倒置顯微鏡下可以看見在細(xì)胞之間有縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀，管狀或樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。念珠菌或酵母菌形態(tài)成卵形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長(zhǎng)。有時(shí)通過顯微鏡觀察可能發(fā)現(xiàn)瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲，不要錯(cuò)當(dāng)是培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的污染。瓶外的污染物應(yīng)及時(shí)用酒精棉球擦洗。 3）支原體污染 支原體是一種簡(jiǎn)單的細(xì)胞。細(xì)胞被支原體污染后，支原體可與細(xì)胞長(zhǎng)期共存，一般不會(huì)死亡，培養(yǎng)基一般不會(huì)發(fā)生渾濁。多數(shù)情況下，細(xì)微變化可以經(jīng)過傳代換液而緩解，外觀給人以正常感覺，實(shí)則細(xì)胞受到多方面潛在影響。個(gè)別嚴(yán)重者，可以導(dǎo)致細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)瓶脫落。 可以利用相差油鏡觀察有無(wú)支原體污染。支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。利用熒光染色法可使得支原體內(nèi)含有的dna著色進(jìn)行觀察，也可利用掃描電鏡和透射電鏡觀察支原體。目前，有專門做支原體檢測(cè)的試劑盒，可以幫助盡快發(fā)現(xiàn)支原體的污染。另外，市場(chǎng)上有新一代支原體抗生素M-Plasmocin，能有效地殺滅支原體，又不影響細(xì)胞本身代謝。,,3、污染的預(yù)防 1）器皿嚴(yán)格消毒 2）操作間的消毒 定期清洗或更換超凈臺(tái)的空氣濾網(wǎng)，請(qǐng)專職人員進(jìn)行定期檢查超凈臺(tái)的空氣凈化標(biāo)準(zhǔn)。檢查培養(yǎng)皿有無(wú)消毒標(biāo)志。新配制的培養(yǎng)基應(yīng)確定無(wú)菌的情況下方可使用，操作之前先用紫外燈滅菌半小時(shí)。 3）操作過程中預(yù)防 操作應(yīng)戴口罩，雙手消毒。操作過程中應(yīng)避免手碰到無(wú)菌部位。在開培養(yǎng)瓶蓋時(shí)妖精酒精燈燒灼。用培養(yǎng)液時(shí)要用專門的吸管。使用培養(yǎng)液時(shí)不宜過早開口。開瓶后的培養(yǎng)瓶應(yīng)保持斜位，避免直立。不用了的培養(yǎng)液應(yīng)立即封口。培養(yǎng)細(xì)胞處理前不要過早暴露。操作時(shí)避免交談，打噴嚏和咳嗽。操作完畢及時(shí)打掃超凈臺(tái)。 4）其他 應(yīng)及早凍存培養(yǎng)物。重要的細(xì)胞株應(yīng)有兩個(gè)人獨(dú)立完成。購(gòu)入的未滅活血清應(yīng)采取56*c水浴滅活30min，使血清的補(bǔ)體和支原體滅活。為了避免誘導(dǎo)抗藥細(xì)菌，應(yīng)定期更換培養(yǎng)系統(tǒng)的抗生素，或盡可能不用抗生素。對(duì)新購(gòu)入的細(xì)胞株應(yīng)加強(qiáng)觀察，防止外來(lái)的污染源；定期消毒培養(yǎng)箱。,,4、污染的排除 通常用高壓滅菌法處理被污染的細(xì)胞，然后丟掉。如果有價(jià)值的細(xì)胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時(shí)排除污染物，挽救細(xì)胞恢復(fù)正常。常用排除微生物污染的方法有以下幾種： 1)抗生素培養(yǎng)法 各種抗生素性質(zhì)不同，對(duì)微生物作用也不同，聯(lián)合應(yīng)用比單用效果好，預(yù)防性運(yùn)用比污染后運(yùn)用效果好。有的抗生素對(duì)細(xì)菌僅有抑制作用，無(wú)殺滅效應(yīng)。反復(fù)使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，而且對(duì)細(xì)胞本身也有一定的影響。一些有價(jià)值的細(xì)胞被污染后，加入高濃度抗生素作用24至48H，再換入常規(guī)的培養(yǎng)液。 2）加溫除菌 根據(jù)支原體對(duì)熱敏度的特點(diǎn)，將受支原體污染的細(xì)胞加溫處理（41*C，5~10h）可以殺滅支原體。 3）動(dòng)物體內(nèi)接種 將受微生物污染的腫瘤細(xì)胞接種到同種動(dòng)物皮下或腹腔，借動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅微生物，待腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)一定時(shí)間后。從體內(nèi)取出再進(jìn)行體外培養(yǎng)。 4）與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng) 巨噬細(xì)胞在體外條件下仍然能吞噬微生物并將其消化。 另外，巨噬細(xì)胞可分泌一些細(xì)胞因子支持其他細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)。因此，采用96孔板將極少培養(yǎng)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，可以在高度稀釋培養(yǎng)細(xì)胞，極大地降低微生物污染程度的同時(shí)，更有效的發(fā)揮巨噬細(xì)胞清除污染的效能。,第四節(jié)、細(xì)胞同步化,細(xì)胞同步化是指為研究細(xì)胞周期的不同階段的生化特征，必須獲得與細(xì)胞周期一致性的細(xì)胞。細(xì)胞同步化分自然同步化和人工同步化。 一、選擇同步化 （一）有絲分裂選擇法 這種方法主要是根據(jù)細(xì)胞周期的不同階段的生理變化設(shè)計(jì)的。是單層培養(yǎng)的細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增殖期，此時(shí)細(xì)胞分裂活躍，分裂指數(shù)高，有絲分裂的細(xì)胞變圓隆起，與培養(yǎng)皿的附著性低。此時(shí)輕輕震蕩，M期細(xì)胞脫離器壁，懸浮于培養(yǎng)液中，手機(jī)培養(yǎng)液，再加入新鮮培養(yǎng)液，依此法繼續(xù)收集，則可以獲得一定數(shù)量的中期細(xì)胞。此法不足之處是只能在鐵臂細(xì)胞中用。 （二）細(xì)胞沉降分離法 此法主要用于懸浮細(xì)胞。不同時(shí)期的細(xì)胞體積不同，而細(xì)胞在給定離心場(chǎng)中沉降的速度與其半徑的平方成正比。因此，可用離心的方法分離細(xì)胞。,二、誘導(dǎo)同步化,（一）DNA合成阻斷法 選用 DNA合成的抑制劑，可逆的抑制DNA合成，將細(xì)胞群阻斷在S期或G/S交界處。胸腺嘧啶核苷雙阻斷法：該法利用過量的TdR能阻礙DNA合成的原理而設(shè)計(jì)，為了加強(qiáng)細(xì)胞同步化效果，常采用兩次TdR阻斷法，即雙阻斷法。第一次阻斷時(shí)間相當(dāng)于G2 ，M和G1的總和或稍長(zhǎng)。釋放時(shí)間不短于S其時(shí)間，而小于G2+M+G1期時(shí)間，這樣才能是所有位于G1/S期的細(xì)胞通過S期，而又不使沿周期前進(jìn)最快的細(xì)胞進(jìn)入下一個(gè)S期。第二次阻斷時(shí)間同第一次，再釋放。 （二）中期阻斷法 秋水仙素結(jié)合的微管蛋白可加合到微管上，但阻止其他微管蛋白單體繼續(xù)添加，從而破壞紡錘體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致染色體不能分開，將細(xì)胞阻斷在中期。常用的藥物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性較小。秋水仙酰胺阻抑法操作如下： 1）將細(xì)胞傳代培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期 2）加入秋水仙酰胺，是最終濃度為0.05~0.1ug/ml培養(yǎng)基，作用6~7h。如使用秋水仙素，使用濃度應(yīng)加大5 ~10倍 3）震蕩收集細(xì)胞，8004r/min離心5~10min，棄上清，收集的沉淀細(xì)胞即為M期細(xì)胞。加入一定量培養(yǎng)基將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中。 由于秋水仙素和秋水仙酰胺都對(duì)細(xì)胞有一定毒性，用量較小或作用時(shí)間較短細(xì)胞活性尚可恢復(fù)，而用量過大或時(shí)間過長(zhǎng)則細(xì)胞不能存活。因此，使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制其劑量和作用時(shí)間。,,三、各期細(xì)胞的獲得 （一）G2期細(xì)胞的獲得 根據(jù)細(xì)胞周期測(cè)定的數(shù)值，采用TdR雙阻斷法使細(xì)胞同步在G1/S期交界處后，洗去TdR使細(xì)胞釋放后繼續(xù)培養(yǎng)。其培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)大于S期時(shí)間而小于S+G2期時(shí)間。然后先用振蕩法使已進(jìn)入M期的細(xì)胞脫落，棄去上清培養(yǎng)基；再用胰蛋白酶消化，加入新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞即為G2期細(xì)胞。 （二）G1期細(xì)胞的獲得 1）將用M期阻斷法獲得的細(xì)胞加入一定量的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1至10h即可獲得各階段的G1期細(xì)胞。 2）用缺乏異亮氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間超過一個(gè)細(xì)胞周期，即可獲得G1期細(xì)胞 (三）G0期細(xì)胞的獲得 可采用血清饑餓法得到G0期細(xì)胞 1）取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞 2）用含0.5%~1%小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48~72h，或用無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h 3）用0.1~0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞可收獲G0期細(xì)胞，可用3H-TdR摻入驚醒測(cè)量鑒定。 四、同步化細(xì)胞的檢測(cè) 對(duì)各個(gè)時(shí)期的同步化細(xì)胞可通過流式細(xì)胞儀來(lái)鑒定其細(xì)胞周期，通過比較各時(shí)相細(xì)胞的百分比，看是否達(dá)到預(yù)期的目的。S期細(xì)胞可通過放射性自顯影來(lái)鑒定結(jié)果，M期細(xì)胞可涂片，染色，在顯微鏡下觀察染色體，統(tǒng)計(jì)有絲分裂指數(shù)來(lái)鑒定。,第五節(jié)、器官培養(yǎng),一、器官培養(yǎng)的概念 器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或器官組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外培養(yǎng)，保持其原有器官細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和聯(lián)系。器官培養(yǎng)主要強(qiáng)調(diào)器官組織的相對(duì)完整性，重點(diǎn)觀察細(xì)胞正常聯(lián)系和排列情況，它們之間的相互影響和局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。這樣，就為實(shí)驗(yàn)生物學(xué)提供了既處于一定的組織結(jié)構(gòu)之中又脫離于體內(nèi)種種復(fù)雜因素的細(xì)胞群體?，F(xiàn)代器官培養(yǎng)法采用把組織放置在細(xì)胞難以粘附的表面上，減少支持物與組織的接觸面積，以及把組織包埋于瓊脂中等方法，大大減少了細(xì)胞遷移現(xiàn)象，達(dá)到限制生長(zhǎng)，是器官專一細(xì)胞同它們的基質(zhì)細(xì)胞維持相對(duì)正常的結(jié)構(gòu)關(guān)系的目的。離體器官需要特殊的培養(yǎng)條件。因此，器官培養(yǎng)的直徑與厚度均以不超過1~2nm為宜，以使?fàn)I養(yǎng)物，氧氣和代謝廢物易于進(jìn)入或排出。為了，使得內(nèi)部細(xì)胞有足夠的氧氣進(jìn)入，一是將器官組織塊放置在培養(yǎng)基氣液面上，或者提高培養(yǎng)環(huán)境的氧分壓，一般要加注純氧。另外，還需要添加一些生長(zhǎng)因子，激素等。 器官培養(yǎng)方法很多，但均只能進(jìn)行原代培養(yǎng)，不能連續(xù)培養(yǎng)。,二、器官培養(yǎng)方法,（一）表玻璃器官培養(yǎng)法 即在一塊表玻璃內(nèi)加上雞胚提取液和雞血漿，凝固后將所培養(yǎng)的器官移植到上面，然后一起置于一培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)。 （二）瓊脂凝膠培養(yǎng)法 其是一種在合成培養(yǎng)基的混合溶液中，添加少量的瓊脂使其固化成固體培養(yǎng)基后，用來(lái)培養(yǎng)器官的方法。與血凝塊比較，瓊脂固體培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)在于基質(zhì)不液化，細(xì)胞在瓊脂上的遷移受到抑制。,（三）擦鏡紙培養(yǎng)法 擦鏡紙具有疏水性，可以漂浮在培養(yǎng)液表面作為培養(yǎng)器官的支持物，同時(shí)，培養(yǎng)液可以透過擦鏡紙而進(jìn)入培養(yǎng)器官的內(nèi)部。需要注意的是，在將植塊放于擦鏡紙上面時(shí)，要盡量小心，以免下沉。 （四）金屬格柵器官培養(yǎng)法 （五）瓊脂小島器官培養(yǎng)法 用瓊脂制成小島狀的支持物，放在液體培養(yǎng)基中，然后將要培養(yǎng)的器官置于瓊脂上面進(jìn)行培養(yǎng)。瓊脂不但具有支持的作用，而且還可以防止培養(yǎng)器官的細(xì)胞發(fā)生遷移。這種方法可以在培養(yǎng)過程中直接觀察植塊的生長(zhǎng)狀況，換液也簡(jiǎn)便。此外，固相培養(yǎng)基和液相培養(yǎng)基共存，從而可在同一培養(yǎng)體系中加入不同的營(yíng)養(yǎng)成分，使在同一培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)不同的器官成為可能。,,