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乙肝病毒檢測,——方法學(xué)評價,乙肝病毒結(jié)構(gòu),（一） 乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)特點,HBsAg：是HBV感染的主要標(biāo)志 HBsAb：保護(hù)性抗體 HBcAg：僅存于感染的肝細(xì)胞核內(nèi)， 一般不存在于血循環(huán)中 HBcAb: 非保護(hù)性抗體，HBcAb-IgM 提示HBV處于復(fù)制狀態(tài) HBeAg：HBV復(fù)制及強(qiáng)感染性的指標(biāo) HBeAb：有一定的保護(hù)作用，預(yù)后良好,患者血清中存在三種基本形態(tài),大球型顆粒，又稱Dane顆粒；小球型顆粒；管型顆粒 小球型顆粒；管型顆粒 管型顆粒,乙型肝炎病毒的實驗室診斷,（一）血清學(xué)檢查 （二）生化學(xué)檢查 （三）HBV DNA、基因型和變異檢查,血清學(xué)檢查,項目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBc IgM 方法 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，最常用，定性),,HBsAg – 感染的標(biāo)志 Anti-HBs – 既往感染/接種疫苗 Anti-HBc IgM – 急性感染標(biāo)志 Anti-HBc IgG – 既往或慢性感染 HBeAg – 急性病毒復(fù)制，有傳染性 Anti-HBe –病毒不再復(fù)制 HBV-DNA – 急性病毒復(fù)制，比HBeAg更準(zhǔn)確；主要用于監(jiān)測治療反應(yīng),HBV血清學(xué)標(biāo)志物的臨床意義,兩對半的意義,— 乙型肝炎的診斷 — 判斷傳染性 — 判斷預(yù)后 — 篩查獻(xiàn)血員 — 流行病學(xué)調(diào)查,,乙肝三系定性檢查是用來判斷是否感染乙肝或粗略估計病毒復(fù)制水平的初步檢查，對患者病情程度的評估參考性不大，所以乙肝患者在做乙肝三系定性檢查的時候，應(yīng)結(jié)合肝功能檢查、乙肝病毒DNA檢查、B超檢查等來判定病情的輕重，,ELISA檢測靈敏低的原因及局限,ELISA法受其自身敏感性和特異性的限制; HBV S和前C基因區(qū)出現(xiàn)位點突變導(dǎo)致HBsAg和HBeAg表達(dá)缺陷。 影響因素多,如加樣時間,試劑平衡時間,樣本溶血程度等等。特別是低濃度樣本易導(dǎo)致假陰性結(jié)果,使弱陽性樣本漏檢。 急性感染的窗口期; HBsAg檢測方法靈敏度不足;血清亞型的漏檢等。 標(biāo)本中病毒顆粒少;,血清學(xué)檢測的局限性,HBV具有“檢測窗口期 假陰性結(jié)果 無法檢測突變株及抗體,乙肝病毒的定量檢測,1、乙肝表面抗原（HBsAg）定量檢測： 1）參考值：0-0.05IU/mL 2）臨床意義： （1）可作為HBV攜帶者乙肝病毒復(fù)制的參考指標(biāo) （2）評價拉美呋定的治療效果 （3）監(jiān)測應(yīng)用alpha-干擾素治療病人的乙肝病毒復(fù)制 （4）確定肝移植病人免疫球蛋白的使用劑量,2.乙肝表面抗體（抗-HBs）定量測定：,是HBsAg刺激機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體，是一種保護(hù)性抗體，能中和HBV。 （1）抗-HBs含量在0-10mIU/ml，表示不具有保護(hù)性，需要注射乙肝疫苗（3針：0-1-6方案）。 （2）抗-HBs含量在10-100mIU/ml，表示具有保護(hù)性，但較弱，需要乙肝疫苗強(qiáng)化注射（1針）。 （3）抗-HBs含量大于100mIU/ml，表示具有很強(qiáng)的保護(hù)性，不需要注射乙肝疫苗。,,3、乙肝病毒e抗原（HBeAg） HBeAg增高說明病毒復(fù)制，具有很強(qiáng)的傳染性。 4、乙肝病毒e抗體（抗-HBe） 抗-HBe陽性說明病毒復(fù)制減少，傳染性弱，但并非沒有傳染性?？笻Be不是保護(hù)性抗體 。,,5、乙肝病毒核心抗體（抗-HBc） 抗-HBc：不是中和抗體，有IgG和IgM兩種形式。IgM在早期出現(xiàn)，而IgG在恢復(fù)期出現(xiàn)，可持續(xù)多年或終身存在。,乙肝五項定量檢測的優(yōu)點,由于乙肝病毒容易發(fā)生變異，再加上乙肝定性檢測方法的局限性，會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，導(dǎo)致不能及時發(fā)現(xiàn)乙肝的感染，也就不能得到及時的治療，對醫(yī)護(hù)人員和其他患者也存在著被感染的威脅。 乙肝五項定量應(yīng)用目前最先進(jìn)的化學(xué)發(fā)光法檢測，避免了假陰性和漏檢的問題，而且準(zhǔn)確，尤其對乙肝病人的療效觀察提供了依據(jù)，這是檢驗發(fā)展的趨勢。,,兩對半定量檢測極大地提高了檢測的靈敏度，LiCa技術(shù)檢測HBsAg靈敏度可達(dá)0．5ng/ml，而ELISA檢測HBsAg達(dá)到2ng/ml時才會陽性。 急性乙肝早期定量能及早檢出HBsAg，確證HBV感染，幾乎能與PreSi同時檢測，在病程觀察中大大縮短了“窗口期”，而酶標(biāo)檢測在乙肝早期往往HBsAg呈陰性。 慢性乙肝一些患者由于機(jī)體常缺乏對HBV包膜蛋白的免疫應(yīng)答，HBsAg表達(dá)較低，酶標(biāo)檢測可出現(xiàn)HBsAg和HBsAb均陰性的情況，而定量檢測則可避免這些情況的出現(xiàn)，為正確判斷病情提供依據(jù)。 靈敏度如病毒發(fā)生變異后，表達(dá)量較低，常規(guī)ELISA測不出抗原，而定量檢測具有極高的靈敏度，可發(fā)現(xiàn)極有可能同時檢測出HBsAg和HBsAb，血清中HBsAg含量與病人對HBsAg細(xì)胞免疫成反比關(guān)系，而肝功能改變則與此種細(xì)胞免疫成正比。定量HBsAg是反映這一關(guān)系的唯一手段?？砂l(fā)現(xiàn)低濃度的HBsAg攜帶者，特別是一些群體如醫(yī)務(wù)工作者及病人家屬等。,定量檢測意義,監(jiān)測疾病發(fā)展 評估藥物療效 指導(dǎo)疫苗接種,國內(nèi)疫苗評價標(biāo)準(zhǔn),無應(yīng)答者:無抗體產(chǎn)生 (5%) ---- 加強(qiáng)計量復(fù)種 低應(yīng)答者:100 IU/L (20%) ---- 無須復(fù)種,PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用,乙型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），基因組長度3.2kb 目前感染人類最小的DNA病毒 部分雙鏈環(huán)狀DNA。,定量PCR的特點,可定量結(jié)果，準(zhǔn)確靈敏地反應(yīng)了病原體的感染和治療恢復(fù)情況 光譜分析儀直讀結(jié)果，自動分析， 增強(qiáng)了靈敏性和客觀性。,,HBV基 因 及 編 碼 蛋 白,HBV-DNA定量檢測的臨床應(yīng)用,慢性乙肝診斷 治療監(jiān)測和療效評價 跟蹤隨訪 預(yù)后判斷,（二） HBV-DNA與“兩對半”,1. “兩對半” ：機(jī)體的免疫反應(yīng)狀態(tài)； FQ-PCR：檢測的是HBV本身的遺傳物質(zhì)—DNA，是 病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)。 2. “攜帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學(xué)指標(biāo)不能 反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。,,3. 血清學(xué)指標(biāo)(－)不能排除HBV感染。 4. 也可能出現(xiàn)HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。 5. HBsAb (＋) 、 HBcAb (＋) 、 HBeAb (＋)三抗體陽性 與HBV DNA 2.5 103 copy /ml 結(jié)果解釋。,HBV-DNA檢測的臨床意義,⒈ 診斷方面： ⑴ HBV DNA是HBV存在最直接的依據(jù) ⑵ HBV DNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志 ⑶ HBV DNA是患者具有傳染性的標(biāo)志 ⑷ 對HBV-M起補(bǔ)充作用： ① HBeAg(﹣)/ 抗HBe(﹢)乙型肝炎 （前C區(qū)變異） ② HBsAg(﹣)乙型肝炎 （S區(qū)變異） ③ 低水平感染 單項抗HBc(﹢)乙型肝炎,,⒉ 療效判斷： HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo) ⒊ 預(yù)后判斷 HBV DNA水平與病情有一定的關(guān)系,,一、乙肝病毒DNA檢查可檢查乙肝病毒的復(fù)制狀況。如乙肝病毒DNA測定值1000copies/ml，就提示乙肝病毒有復(fù)制，而且病毒數(shù)量的高低與病毒復(fù)制的程度成正相關(guān)。若結(jié)果陰性，則表明病毒處于不活躍階段，病情比較平穩(wěn)。 二、乙肝病毒DNA檢查還是判斷乙肝病毒傳染性的重要指標(biāo)。如果乙肝病毒DNA測定值1000copies/ml，常提示具有傳染性，且檢測值越高就說明乙肝病毒復(fù)制越活躍，傳染性越強(qiáng)。,,三、乙肝病毒DNA檢查可以作為肝病患者確診病情的主要依據(jù)。乙肝病毒DNA陽性者，即使肝功能正常，必要時也應(yīng)考慮進(jìn)行抗病毒治療。乙肝抗病毒治療的標(biāo)準(zhǔn)就是乙肝病毒DNA1000copies/ml，且患者轉(zhuǎn)氨酶超過正常值兩倍，此時是肝病患者抗病毒治療的最佳時機(jī)。 四、乙肝病毒DNA檢查結(jié)果還可以在一定程度上輔助判斷乙肝病毒是否產(chǎn)生了變異，如在治療過程中乙肝病毒DNA檢測結(jié)果由陰性轉(zhuǎn)為陽性時，則提示病毒已發(fā)生變異，應(yīng)結(jié)合具體病情重新選擇抗病毒藥物。,基因檢測在乙肝診療各階段的應(yīng)用,,藥物治療方案的確定 （用藥：干擾素、拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋）,藥物治療 （療效評價）,前C區(qū)1896位點突變檢測,跟蹤隨訪,,,,乙 肝 病 毒 定 量檢測,確 診,病毒學(xué)分析,乙肝病毒分型檢測,拉米夫定耐藥檢測,阿德福韋耐藥檢測,,,,共價閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)檢測,,恩替卡韋耐藥檢測,,,,,,,FQ-PCR檢測的優(yōu)勢,靈敏度高可以達(dá)到 pg 級而 ELISA 只能檢測 ng級，可以檢測包括乳汁的其他低含量的標(biāo)本; 不受病毒變異影響，而前C和S變異后ELISA難以檢測; 熒光定量PCR 技術(shù)采用閉管檢測, 無須凝膠電泳, 避免了交叉污染,實現(xiàn)了對HBV DNA 的定量測定, 其實時監(jiān)測技術(shù)使藥物選擇和療效觀察成為可能; 漏檢率低。,,謝謝！,