《【基金標(biāo)書】2010CB912200-基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)群的功能及作用機(jī)制研究》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《【基金標(biāo)書】2010CB912200-基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)群的功能及作用機(jī)制研究（33頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

項目名稱： 基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)群的功能及作用機(jī)制研究首席科學(xué)家： 尹玉新 北京大學(xué)起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部門： 教育部一、研究內(nèi)容（一）擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題面對我國生命和健康科學(xué)的重大需求和癌癥等重大疾病研究的挑戰(zhàn)，結(jié)合我們前期的研究基礎(chǔ)，本項 目將圍繞遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性這一中心課題，選擇細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的各個環(huán)節(jié)，從蛋白 質(zhì)群入手解決如下關(guān)鍵科學(xué)問題：1. 蛋白質(zhì)群在細(xì)胞生長分裂過程中細(xì)胞周期各個階段的調(diào)控機(jī)制和相互作用。相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路在 細(xì)胞增殖過程中如何維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。細(xì)胞異常增殖過程中相關(guān)蛋白質(zhì)群的變化規(guī)律及其對細(xì)胞周期和基因組穩(wěn)定性的影響。2. PTEN在有絲分裂過程中調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)群的機(jī)制。抑癌基因PTEN與p53通路之間的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)群的聯(lián)系。 細(xì)胞增殖和凋亡的分子調(diào)控機(jī)制，Hippo信號通路及微管結(jié)合蛋白在其中發(fā)揮的作用。（二）主要研究內(nèi)容1. 研究真核細(xì)胞 DNA 復(fù)制及檢驗點維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的機(jī)理，確定DNA 復(fù)制起始蛋白 Sap1 的相互作用蛋白及闡明它 們的生化功能；大規(guī)模確定新的 DNA 復(fù)制蛋白；闡明 Dna2 維持 DNA 復(fù)制叉穩(wěn)定的機(jī)理以及 Cds1-Dna2 的檢驗點通路，揭示檢驗點在維 持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用；從 G1、S 期細(xì)胞中鑒定新的受 GSK-3β調(diào)控的基因或蛋白質(zhì)群，并挑 選適當(dāng)?shù)墓δ芑蚧虻鞍祝?細(xì)胞水平和整體水平（動物模型）分析、驗證，且探 討其機(jī)制及意義。 2. 檢測有絲分裂期間PTEN及其調(diào)控的蛋白質(zhì)群的作用機(jī)制，鑒定更多PTEN調(diào)節(jié)的與有絲分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)群；檢測PTEN與這些蛋白質(zhì)群的物理性相互作用；通過基因敲除小鼠模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型評價有絲分裂破壞與腫瘤發(fā)生的關(guān)系；深入探討PTEN與p53調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)群之間的分子網(wǎng)絡(luò)。3. 以癌癥和衰老模型為主要研究對象，對前期已鑒定出的，與癌癥發(fā)生或轉(zhuǎn)移及衰老密切相關(guān)蛋白進(jìn)行生物學(xué)功能及蛋白質(zhì)糖基化修飾研究，探究其相互作用和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從蛋白質(zhì)水平上揭示腫瘤或衰老細(xì)胞增殖異常的分子機(jī)制。研究調(diào)控細(xì)胞周期G1 和M期的新蛋白Mig-2，通過對其所調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)群的相互作用研究，揭示其調(diào)控細(xì)胞周期和腫瘤侵襲性生長的分子機(jī)制。4. 篩選 Hippo 通路上游調(diào)節(jié)蛋白及下游靶基因，探索該通路已知蛋白之間的動態(tài)互作及通路激活機(jī)制， 檢測 Hippo 通路核心蛋白調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡，進(jìn)而影響基因組穩(wěn)定性的分子機(jī)制；探索 Hippo 信號通路與 PTEN 以及 Rassf、EB1和 CYLD 等微管結(jié)合蛋白之間的關(guān)系，解析上述各蛋白協(xié)同或獨立調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡、影響基因組穩(wěn)定性的分子機(jī)理。二、預(yù)期目標(biāo)（一）總體目標(biāo)瞄準(zhǔn)國家戰(zhàn)略需求和國際腫瘤相關(guān)科學(xué)研究前沿，從與遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)蛋白質(zhì)群這一關(guān)鍵科學(xué)問題出發(fā)，在細(xì)胞周期的各個環(huán)節(jié)探討相關(guān)蛋白質(zhì)群的分子調(diào)控機(jī)制以及相互作用網(wǎng)絡(luò)。在此基礎(chǔ)上， 鑒 定一批新的與細(xì)胞正常、異常增殖調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)群，建立全細(xì)胞水平的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫；確定一些與維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)群的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用和一些重要靶蛋白的動態(tài)調(diào)控機(jī)制，并研究它們的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外， 還將探索一些與細(xì)胞周期失調(diào)后決定細(xì)胞命運的信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制。通過本課題的實施將使我國在細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白研究的相關(guān)領(lǐng)域達(dá)到或領(lǐng)先國際水平。同時，以本項目的實施為契機(jī), 促進(jìn)蛋白 質(zhì)組學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科研究的銜接和集成，培養(yǎng)一批交叉學(xué)科新型研究隊伍。（二）五年目標(biāo)1. 確定DNA復(fù)制起始蛋白Sap1的相互作用蛋白及闡明它們的生化功能；大規(guī)模確定新的DNA復(fù)制蛋白；闡明Dna2維持DNA復(fù)制叉穩(wěn)定的機(jī)理以及Cds1-Dna2的檢驗點通路，揭示檢驗點在維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用。鑒定G1、S期細(xì)胞中新的受GSK-3β 調(diào)控的基因或蛋白質(zhì)群及其機(jī)制和意義。2. 評價PTEN及其調(diào)控的蛋白質(zhì)群在控制有絲分裂中的作用并且探討PTEN對這些蛋白質(zhì)群的表達(dá)調(diào)控和物理相互作用，鑒定更多與有絲分裂調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)群。揭示抑癌基因PTEN與p53之間的分子網(wǎng)絡(luò)，為臨床診斷和化療提供理論基礎(chǔ)。3. 揭示蛋白質(zhì)群在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移及衰老中的生物學(xué)功能，著重研究調(diào)控細(xì)胞周期的新蛋白Mig-2的信號傳導(dǎo)通路，通過對其所調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)群的研究，揭示其調(diào)控細(xì)胞周期的分子機(jī)制。通過穩(wěn)定同位素標(biāo)記建立細(xì)胞核蛋白質(zhì)動態(tài)表達(dá)分析鑒定的實驗方法，并由此獲得新的標(biāo)志蛋白；針對所發(fā)現(xiàn)的新的相互作用蛋白，驗證其與靶蛋白的相互關(guān)系并確定其生物功能并鑒定出關(guān)鍵核蛋白質(zhì)修飾類型與可用于新藥開發(fā)的重要靶標(biāo)，并探討其在腫瘤治療、延緩衰老和保護(hù)細(xì)胞方面應(yīng)用的可能性。4. 闡明Hippo通路各組成分子間相互作用機(jī)制，鑒定新的靶蛋白及其在Hippo通路中的作用；鑒定Hippo通路上游分子和分析通路激活機(jī)制；揭示Hippo信號通路核心分子對基因組穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制；分析CYLD 和EB1等微管結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡的分子機(jī)制；探討Hippo信號通路與微管結(jié)合蛋白質(zhì)群的關(guān)系及其在調(diào)控細(xì)胞分裂和誘發(fā)凋亡中的作用。5. 取得具有國際影響的原創(chuàng)性成果，在國 際重要學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表高水平論文 50 篇以上。其中，在影響因子大于 10 的刊物發(fā)表 15-20 篇，培養(yǎng)一批從事 腫瘤基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的交叉學(xué)科人才。三、研究方案（一）總體研究思路、技術(shù)路線及可行性分析1. 總體研究思路在細(xì)胞增殖過程中遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性有賴于細(xì)胞周期的系統(tǒng)調(diào)節(jié)，DNA 的精確復(fù)制和DNA損傷的修復(fù)。蛋白 質(zhì)群在此過程中的相互作用使 細(xì)胞周期的精密調(diào)控成為可能。機(jī)體通過細(xì) 胞周期調(diào)控維持基因組穩(wěn)定性，這一過程是經(jīng)由細(xì)胞周期的各個環(huán)節(jié)實現(xiàn)的。 細(xì)胞周期分為G1、 S、G2和M期，研究細(xì)胞周期的調(diào)控應(yīng)該分解到細(xì)胞周期自然過程的各個環(huán)節(jié)中。細(xì)胞周期調(diào)控的正常進(jìn)行以及遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性與腫瘤的發(fā)生以及衰老等生命重大事件密切相關(guān)。因此，鑒定參與調(diào)控細(xì)胞周期各個環(huán)節(jié)的蛋白質(zhì)群并且評價這些蛋白質(zhì)群在調(diào)控細(xì)胞周期的各個階段、 維持基因組穩(wěn)定性中所發(fā)揮的作用機(jī)制以及蛋白質(zhì)群之間的相互作用對于癌癥等重大疾病研究至關(guān)重要。對我們認(rèn)識與了解這些疾病發(fā)生的機(jī)理，有效防治這些疾病具有重大意義?；谝陨纤悸罚菊n題重點圍繞細(xì)胞周期的各個環(huán)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)群開展研究，闡明 這些蛋白質(zhì)群在細(xì) 胞周期各個時期：DNA復(fù)制、合成、有絲分裂期的調(diào)控機(jī)制。評價蛋白質(zhì)群對于 細(xì)胞周期調(diào)控正常進(jìn)行，維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用。在此基礎(chǔ)上，我們將利用一個大型高通量蛋白質(zhì) 分析平臺，大 規(guī)模鑒定和分析與細(xì)胞周期調(diào)控和維持基因組穩(wěn)定性相關(guān)的蛋白質(zhì)群，探究其相互作用蛋白和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。此外，我們還將研究多細(xì)胞生物如何 處理細(xì)胞周期失調(diào)而發(fā)生遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定的情況下而對細(xì)胞命運進(jìn)行調(diào)節(jié)，探討細(xì)胞生存、死亡與遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的綜合關(guān)系，即在 細(xì)胞周期失調(diào)、基因 組不 穩(wěn)定的情況下通過何種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞命運，對細(xì)胞生存和死亡進(jìn)行決斷。 這將不 僅闡釋機(jī)體清除癌細(xì)胞的機(jī)制，還將為癌癥治療提供更多的靶向藥物選擇。細(xì) 胞 生 長 和 DNA復(fù) 制相 關(guān) 蛋 白 質(zhì) 群課 題 1 有 絲 分 裂 和 DNA修 復(fù)相 關(guān) 蛋 白 質(zhì) 群課 題 2細(xì) 胞 異 常 增 殖相 關(guān) 蛋 白 質(zhì) 群課 題 3調(diào) 節(jié) 細(xì) 胞 增 殖 和 凋 亡蛋 白 質(zhì) 群課 題 4細(xì) 胞 生 長 和 復(fù) 制相 關(guān) 蛋 白 質(zhì) 群課 題細(xì) 胞 生 長 和 復(fù) 制相 關(guān) 蛋 白 質(zhì) 群課 題課 題 有 絲 分 裂 和 修 復(fù)相 關(guān) 蛋 白 質(zhì) 群課 題有 絲 分 裂 和 修 復(fù)相 關(guān) 蛋 白 質(zhì) 群課 題課 題 細(xì) 胞 異 常 增 殖相 關(guān) 蛋 白 質(zhì) 群課 題細(xì) 胞 異 常 增 殖相 關(guān) 蛋 白 質(zhì) 群課 題課 題 調(diào) 節(jié) 細(xì) 胞 增 殖 和 凋 亡蛋 白 質(zhì) 群課 題調(diào) 節(jié) 細(xì) 胞 增 殖 和 凋 亡蛋 白 質(zhì) 群課 題課 題附圖：主要技術(shù)途徑流程圖2. 技術(shù)路線根據(jù)我們的學(xué)術(shù)思路，本項目的總體研究技術(shù)途徑如附圖所示。研究細(xì)胞周期的各個時期相關(guān)蛋白質(zhì)群的結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控機(jī)制和相互作用，并且闡述細(xì)胞正常增殖過程中遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的維持。還將研究細(xì)胞異常增殖中蛋白質(zhì)群的變化和細(xì)胞凋亡的程序控制。主要途徑為：【課題一】用遺傳的方法篩選Sap1溫度敏感株的抑制蛋白；直接從細(xì)胞內(nèi)分離Sap1的蛋白復(fù)合體；用蛋白親和層析的方法分離Sap1的相互作用蛋白。并用生化，遺傳及熒光 單分子技術(shù)闡明一些已知及一些新確定的DNA復(fù)制蛋白的生化作用機(jī)理；闡明 Dna2維持DNA 復(fù)制叉穩(wěn)定的機(jī)理以及Cds1-Dna2的檢驗點通路，用基因干 擾技術(shù) （RNAi）揭示該通路相關(guān)的檢驗點在維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用。采用基因表達(dá)譜芯片或蛋白組學(xué)的方法，與課題 二和課題三合作，篩選受GSK-3β調(diào)控的基因或蛋白 質(zhì)群，鑒定G1、S期細(xì)胞中新的受GSK-3β 調(diào) 控的基因或蛋白質(zhì)群并且探討其機(jī)制和意義。 【課題二】確定PTEN在維持有絲分裂檢驗點中的重要地位，利用基因芯片技術(shù)鑒定出新的PTEN調(diào)節(jié)基因群并且深入了解其調(diào)控機(jī)理。采用染色質(zhì)-免疫共沉淀（Chromatin-Immunoprecipitation, ChIP）方法確定PTEN與染色質(zhì)之間的相互作用從而探討PTEN調(diào)控其靶基因表達(dá)的機(jī)理。利用蛋白質(zhì)Pull-down分析系統(tǒng)大規(guī)模鑒定與PTEN相互作用的有絲分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)群。通過傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用實驗（IP-western）、定向誘變、熒光素酶分析等方法檢測PTEN與這些新鑒定出的有絲分裂相關(guān)蛋白質(zhì)群的物理性相互作用，利用課題組三的蛋白質(zhì)分析平臺鑒定PTEN與這些蛋白質(zhì)群物理性相互作用的結(jié)構(gòu)域及蛋白質(zhì)修飾位點。通過建立小鼠動物模型從活體角度綜合評價PTEN通路以及相關(guān)蛋白質(zhì)群在調(diào)節(jié)有絲分裂進(jìn)程、維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的重要性。最后利用這一動物模型揭示抑癌基因p53與PTEN的分子網(wǎng)絡(luò)關(guān)系及其在抗癌過程中的作用。 【課題三】以癌癥和衰老模型為主要研究對象，探討在細(xì)胞異常增殖過程中相關(guān)蛋白質(zhì)群，如Mig-2信號通路的變化規(guī)律。通過對目的基因進(jìn)行表達(dá)干預(yù)（過表達(dá)或沉默），從體外到體內(nèi)深入研究候選蛋白質(zhì)群對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控的影響。結(jié)合信號通路的特異性抑制藥物等分析目的基因表達(dá)干預(yù)后導(dǎo)致的新差異蛋白及所涉及的信號通路。采用TAP技術(shù)并結(jié)合質(zhì)譜分析篩選和鑒定出差異蛋白的相互作用蛋白或蛋白復(fù)合體。利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記并結(jié)合高靈敏度的生物質(zhì)譜鑒定技術(shù)，研究細(xì)胞核蛋白質(zhì)和DNA片段上的修飾類型、修飾位點， 闡明其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其在衰老過程中的功能。采用在體鑒定快速腫瘤細(xì)胞增殖、侵 襲和轉(zhuǎn)移的實驗系統(tǒng)，提高甄 別在細(xì)胞周期中調(diào)控異常增殖蛋白質(zhì)群的效率。選擇調(diào)控細(xì)胞異常增殖的代表性新蛋白，建立其與腫瘤病人的相關(guān)性。【課題四】研究Hippo信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理，揭示Hippo信號通路核心分子對基因組穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制，分析Hippo信號通路蛋白與微管結(jié)合蛋白的關(guān)系及其在調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡中的作用。在全基因組水平上通過干擾基因的表達(dá)（RNAi）篩選Hippo調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)群，并結(jié)合微陣列分析鑒定Hippo通路新的靶基因集團(tuán)；通過上位分析（epistasis）和IP-Western 等方法在體內(nèi)與體外研究 Hippo通路組 成分子間的動態(tài)互作；通過質(zhì)譜分析鑒定蛋白修飾，特別是磷酸化修飾調(diào)控Hippo通路的分子及生物學(xué)意義；系統(tǒng)分析Hippo通路蛋白質(zhì)組群在細(xì)胞內(nèi)的定位情況及轉(zhuǎn)位意義；分析CYLD 和EB1等微管結(jié)合蛋白與有絲分裂、細(xì)胞增殖以及基因 組穩(wěn)定性之間的關(guān)系；通過蛋白共定位研究探討Hippo通路與PTEN調(diào)節(jié)基因組穩(wěn)定性的關(guān)系，從而探討多細(xì)胞生物在細(xì)胞周期失調(diào)而發(fā)生遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定的情況下如何對細(xì)胞命運進(jìn)行調(diào)節(jié)。各課題組還將充分利用課題組三具備的大型蛋白質(zhì)鑒定分析技術(shù)平臺對更多參與維持基因組穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)群進(jìn)行大規(guī)模鑒定和分析。3. 可行性分析(1) 本項目的科研 隊伍以從事生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)等國家和部門重點實驗室、教育部985創(chuàng)新平臺為主體，集中了目前從事基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)群研究的優(yōu)勢科研團(tuán)隊。其中，各課題負(fù)責(zé)人都是本領(lǐng) 域的專家， 親自設(shè)計各自的 課題并將指導(dǎo)項目的具體實施。(2) 本項目著眼于大 規(guī)模蛋白質(zhì)組（群）而非單個蛋白的研究。2007年10月召開的國際蛋白質(zhì)組學(xué)組織大會標(biāo)志著從大規(guī)模技術(shù)性研究向差異和動態(tài)組學(xué)研究的趨勢。但迄今已有的技 術(shù)幾乎都限于檢測和比較蛋白的累積量。課題三近期自主建立的SiLAD 技術(shù)對蛋白真正表達(dá)水平差異的 測定提供了更敏感和更精密的手段，并且保持了高通量的能力。另一方面利用穩(wěn) 定同位素同時摻入細(xì)胞核蛋白質(zhì)和DNA上新添甲基的系統(tǒng)研究方法已成熟地用于本課題相關(guān)模型的研究中。這些新技術(shù)方法都是針對細(xì)胞調(diào)控中的蛋白質(zhì)組（群）動態(tài)研究而開發(fā)的。本研究具備扎實的前期研究工作基礎(chǔ)和創(chuàng)新技術(shù)平臺，以及用于功能研究的基因敲除動物模型和高精確度的質(zhì)譜分析鑒定蛋白質(zhì)動態(tài)表達(dá)和蛋白質(zhì)修飾平臺。良好的工作基礎(chǔ)和強(qiáng)大的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺為本課題研究計劃的順利進(jìn)行提供了有力的保障。(3) 參加本項 目研究的各實驗室具備優(yōu)良的研究條件。同時，各課題間早已經(jīng)形成了緊密的協(xié)作關(guān)系，各方面的研究相互交叉、 組成了一個有機(jī)的整體。 課題二中建立的基因敲除小鼠模型以及轉(zhuǎn)基因小鼠模型在國際上也具有領(lǐng)先地位，為其他課題順利實施提供了珍貴的活體動物模型。課題三的高通量蛋白質(zhì)鑒定和分析平臺為其他各個課題組的研究分析提供了可靠、高效的技術(shù)平臺。（二）創(chuàng)新點1. 本項目瞄準(zhǔn)國際前沿，面向國家需求，綜合利用多學(xué)科優(yōu)勢，集中 針對遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)蛋白質(zhì)群的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和相互作用，展開多層面更又互相關(guān)聯(lián)的研究。2. 本項目將細(xì)胞周期的各個時期有機(jī)地整合在一起，通過研究各個環(huán)節(jié)相關(guān)的蛋白質(zhì)群及其調(diào)控和相互作用機(jī)理而探討這些蛋白質(zhì)群對細(xì)胞周期調(diào)控的分子機(jī)制，評價其作為有機(jī)整體和分子網(wǎng)絡(luò)對遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的相關(guān)性，在此基礎(chǔ)上大規(guī)模鑒定和分析與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的各種蛋白質(zhì)群，并探索這些蛋白質(zhì)群之間的相互作用，構(gòu)建與 細(xì)胞周期調(diào)控和基因組穩(wěn)定性維持相關(guān)的蛋白質(zhì)組分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，還進(jìn)一步研究當(dāng)細(xì)胞周期失 調(diào)發(fā)生遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定后，多細(xì)胞生物作為有機(jī)整體利用何種機(jī)制對細(xì)胞命運進(jìn)行決斷，從而綜合性評價細(xì)胞周期調(diào)控與基因組穩(wěn)定性的內(nèi)在聯(lián)系和相關(guān)蛋白質(zhì)群的功能和相互作用。3. 本項目在研究內(nèi)容方面具有完全創(chuàng)新性：孔道春實驗室在裂殖酵母S. pombe發(fā)現(xiàn)了 DNA復(fù)制起始蛋白 —Sap1，他們證明 Sap1是DNA復(fù)制起始蛋白Cdc18結(jié) 合到DNA復(fù)制源上所必需的?？佃F邦教授在細(xì)胞周期和DNA 損傷檢測點中，發(fā)現(xiàn) 了一條新的調(diào)控通路（GSK-3β-Cdc25A），該通路在G1 、S期和G1-S 期轉(zhuǎn)換中起關(guān)鍵作用。尹玉新課題組研究設(shè)想PTEN對細(xì)胞周期有絲分裂形成獨特的調(diào)節(jié)，而 這種調(diào)節(jié)在國際上也是全新發(fā)現(xiàn)。 張宏權(quán)課題組發(fā)現(xiàn)跨膜受體整合素結(jié)合蛋白Mig-2是細(xì)胞跨過有絲分裂中期（Metaphase）所必須的，并證明這一作用是通過一個全新的Mig-2－ILK信號通路調(diào)控的。肖雪媛和紀(jì)建國課題組以腫瘤和衰老為實驗?zāi)Ｐ停芯啃掳l(fā)現(xiàn) 的與細(xì)胞增殖異常相關(guān)蛋白的生物學(xué)功能及組蛋白修飾變化規(guī)律。而以此為 基礎(chǔ)構(gòu)建靶蛋白表達(dá)干預(yù)后的交替多輪差異蛋白篩選策略。4. 本項目在研究方法方面也具有獨到之處，在國際上處于領(lǐng)先水平。尹玉新課題組在多年的研究基礎(chǔ)上， 發(fā)展了一系列體內(nèi)、體外活體研究模型，例如小鼠基因敲除模型系統(tǒng)：他們已經(jīng)成功敲除PAC1基因（p53下游的一個重要基因）并且建立了一系列PTEN條件基因敲除knock-in模型，通過這些模型檢測PTEN在腫瘤發(fā)生過程中如何調(diào)節(jié)有絲分裂，研究PTEN與相關(guān)蛋白質(zhì)群作用，而這些作用可與特定小鼠模型的腫瘤發(fā)生直接關(guān)聯(lián)，從而更加直觀地評價PTEN調(diào)控有絲分裂的作用與腫瘤發(fā)生有無直接關(guān)系。此外，他們正在建立 轉(zhuǎn)基因小鼠模型預(yù)測某些重要蛋白過度表達(dá)是否可促進(jìn)腫瘤發(fā)生。張宏權(quán)課題組首次在斑馬魚模型中建立了在3－7天內(nèi)在體鑒定腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的實驗系統(tǒng)，為增殖異常的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模體內(nèi)評價提供了快速、經(jīng)濟(jì)和方便的最新方法。肖雪媛課題組則首次提出使穩(wěn)定同位素同時摻入細(xì)胞核蛋白質(zhì)和DNA上新添甲基的系統(tǒng)研究方法，從而可以快速、定量鑒定表觀遺傳修飾的動態(tài)變化， 這將有助于組蛋白修飾密碼及其作用機(jī)制的確定。（三）課題設(shè)置課題一：真核細(xì)胞DNA復(fù)制機(jī)理及細(xì)胞周期檢驗點在維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用研究目標(biāo)：本課題將研究真核細(xì)胞DNA復(fù)制及檢驗點維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的機(jī)理，確定DNA 復(fù)制起始蛋白Sap1的相互作用蛋白及闡明它 們的生化功能；確定人細(xì)胞的Sap1同源蛋白；大規(guī)模確定新的DNA復(fù)制蛋白；闡 明Dna2維持DNA 復(fù)制叉穩(wěn)定的機(jī)理；闡明Cds1-Dna2的檢驗點通路，揭示 檢驗點在 維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用。闡 明Cds1-Dna2的檢驗點通路，揭示檢驗點在維持復(fù)制叉穩(wěn)定的作用；鑒定G1、S期 細(xì)胞中新的受GSK-3β調(diào)控的基因或蛋白質(zhì) 群及其機(jī)制和意義。研究內(nèi)容：1. 確定Sap1的相互作用蛋白和人細(xì)胞的Sap1同源蛋白并闡明它們的生物功能和生化作用機(jī)理。采用下面三種方法確定Sap1相互作用蛋白。一是用遺傳的方法篩選Sap1溫度敏感株的抑制蛋白；二是直接從細(xì)胞內(nèi)分離Sap1的蛋白復(fù)合體；三是用蛋白親和層析的方法分離Sap1的相互作用蛋白。2. 確定新的DNA復(fù)制蛋白在裂殖酵母S. pombe , DNA復(fù)制起始蛋白Cdc18的高表達(dá)導(dǎo)致DNA重復(fù)復(fù)制并最終使細(xì)胞死亡。如果另一個復(fù)制蛋白由于突變使得它的活性降低，該蛋白就能拮抗Cdc18的高表達(dá)導(dǎo)致的DNA重復(fù)復(fù)制從而使細(xì)胞能存活。用該方法已經(jīng)篩選到了幾百個突變株，現(xiàn)正確定它們的突變基因，并進(jìn)一步與課題組三合作，利用高通量蛋白質(zhì)鑒定分析平臺研究新的DNA復(fù)制蛋白的相互作用及其生物學(xué)功能。3．闡明Cds1-Dna2的檢驗點通路已發(fā)現(xiàn)Dna2能防止停 頓的DNA復(fù)制叉倒轉(zhuǎn)，也發(fā)現(xiàn) Cds1調(diào)控Dna2和DNA的相互作用，但Cds1 和Dna2不直接相互作用。這暗示Cds1通過調(diào)控另一個蛋白達(dá)到促使Dna2結(jié)合到 DNA上。采用生化和遺傳的方法確定 該蛋白，并最終闡明Cds1-Dna2的檢驗點通路。4．鑒定新的 GSK-3β底物，及其機(jī)理和調(diào)控機(jī)制本課題組最近發(fā)現(xiàn)，在DNA損傷時GSK-3β 在S期的調(diào)控中也起重要作用。將用基因表達(dá)譜芯片或蛋白組學(xué)的方法，鑒定新的受GSK-3β調(diào)控的基因或蛋白質(zhì)群，并挑選適當(dāng)?shù)墓δ芑蚧虻鞍?，?細(xì)胞水平和整體水平（動物模型）進(jìn)行分析、驗證，并探 討其作用機(jī)制及意 義。同 時，本課題組還發(fā)現(xiàn) GSK-3β可能通過磷酸化Cdh1調(diào)節(jié) APCCdh1的活性，從而調(diào)控有絲分裂的過程。本課題擬鑒定Cdh1在體內(nèi)、外被GSK-3β 磷酸化的位點；探討GSK-3β 和Cdh1在 細(xì)胞周期調(diào)控、 DNA損傷修復(fù)中的作用。承擔(dān)單位：中山大學(xué)、北京大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：康鐵邦，特聘教授，42歲, 中山大學(xué)腫瘤防治中心學(xué)術(shù)骨干：孔道春、張麗君等預(yù)算經(jīng)費： 23.5%課題二：PTEN調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)群在細(xì)胞有絲分裂中的作用研究目標(biāo)：本課題旨在探討PTEN在有絲分裂過程中的地位和作用，首先了解PTEN調(diào)控其靶基因集團(tuán)的機(jī)理，然后研究PTEN和有絲分裂相關(guān)蛋白質(zhì)群的相互作用，第三建立活體動物模型以評價PTEN在維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性和抑制腫瘤中的作用，最后揭示PTEN與p53通路蛋白質(zhì)群之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。研究內(nèi)容：1. 檢測有絲分裂期間PTEN在維持著絲粒和關(guān)卡功能中所發(fā)揮的作用。揭示著絲粒中PTEN的精確定位；在體外和體內(nèi)的Pten- 缺陷型細(xì)胞中確定PTEN缺失如何導(dǎo)致染色體凝集和集合障礙，著絲粒-微管相互作用受損以及紡錘體關(guān)卡應(yīng)答障礙；觀察Pten-缺陷型細(xì) 胞中過度表達(dá)PTEN是否能校正染色體錯排和分離錯誤，以及恢復(fù)著絲粒功能和關(guān)卡應(yīng)答。利用基因芯片技術(shù)鑒定出新的PTEN調(diào)節(jié)基因群并且深入了解其調(diào)控機(jī)理。采用染色質(zhì)-免疫共沉淀（ChIP）方法確定PTEN與染色質(zhì)之間的相互作用從而探討PTEN調(diào)控其靶基因表達(dá)的機(jī)理。2. 鑒定與PTEN相互作用的蛋白質(zhì)群。我們已建立了成熟的蛋白質(zhì)Pull-down分析系統(tǒng)，并且成功地發(fā)掘出與有絲分裂相關(guān)的蛋白激酶，如PLK-1和紡錘體運動相關(guān)的馬達(dá)蛋白，如EG5 。本 課題將利用這一成熟的系 統(tǒng)通過標(biāo)記PTEN鑒定更多與有絲分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)群。通過傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用實驗（IP-western）、定向誘變、 熒光素酶分析等方法檢測PTEN 與這些新鑒定出的有絲分裂相關(guān)蛋白質(zhì)群的物理性相互作用并且利用課題組三的蛋白質(zhì)分析平臺鑒定PTEN與這些蛋白質(zhì)群物理性相互作用的結(jié)構(gòu)域及蛋白質(zhì)修飾位點。3. 建立PTEN突變的小鼠模型，以評價PTEN在有絲分裂過程和維持基因組穩(wěn)定性中的重要性。在前期研究中已成功地建立了條件性PTEN189 knock-in小鼠模型，這些PTEN突變的小鼠以極高的頻率發(fā)生腫瘤。將利用這些模型評價PTEN在活體中調(diào)控細(xì)胞周期，有絲分裂及其維持基因組穩(wěn)定性的作用，并且衡量基因組不穩(wěn)定性與腫瘤發(fā)生的因果關(guān)系。4. 揭示PTEN與p53調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)群之間的分子網(wǎng)絡(luò)。本課題組的前期研究結(jié)果顯示：PTEN對p53形成負(fù)調(diào)節(jié)，即失去PTEN可激活p53通路，如Apalf-1、PUMA和PAC1等，導(dǎo)致自 發(fā)性細(xì)胞死亡。我們將利用已建立的組織特異性PTEN基因敲除小鼠模型研究p53通路及其凋亡靶基因群如何對PTEN的功能失調(diào)產(chǎn)生應(yīng)答，以此評價抑癌基因之間的分子網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系及對化療藥物敏感性的影響，為臨床化療、藥物的篩選提供理論依據(jù)。承擔(dān)單位：北京大學(xué)、中山大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：尹玉新，教授，49歲, 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)術(shù)骨干：張輝等預(yù)算經(jīng)費： 29.5%課題三：細(xì)胞增殖異常模型中的相關(guān)蛋白質(zhì)群及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究研究目標(biāo)：本課題以腫瘤和衰老模型為主要研究對象，對前期已鑒定出的，與癌癥發(fā)生或轉(zhuǎn)移及衰老密切相關(guān)蛋白進(jìn)行生物學(xué)功能的研究，鑒定新的參與細(xì)胞周期G1和M期的蛋白并研究其在細(xì)胞異常增殖過程中的作用。從蛋白質(zhì)群調(diào)控網(wǎng)絡(luò)水平上揭示細(xì)胞增殖調(diào)控失常的分子機(jī)制。研究內(nèi)容：1、對已初步選定的一些與異常增殖特異相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，如 S100A 家族、Mig-2、和 PHP14 等，利用基因干擾技術(shù)和課題二中所建立的轉(zhuǎn)基因小鼠和條件性基因敲除等平臺，從體外培養(yǎng)細(xì)胞到體內(nèi)動物模型驗證并研究其在腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移以及衰老過程中的生物功能及其變化規(guī)律。2、利用 SiLAD 等動態(tài)蛋白質(zhì)組學(xué)方法，篩選鑒定腫瘤或衰老相關(guān)蛋白的相互作用蛋白及其在干預(yù)靶蛋白情況下的動態(tài)變化規(guī)律。結(jié)合信號通路特異性抑制劑等手段探索和確定其所參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，特別是與 PTEN 和 p53 通路的關(guān)系。闡明其導(dǎo)致調(diào)控異常的分子機(jī)制。3、利用前期研究所建立的體內(nèi)快速檢驗異常增殖的與腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)群的斑馬魚技術(shù)平臺，鑒定出 調(diào)控腫瘤細(xì)胞異常增殖的重要蛋白質(zhì)群，并在臨床病人中建立相關(guān)性驗證，以明確其在腫瘤診斷、 預(yù)防和治 療中的意義，以及作 為潛在藥物靶標(biāo)的可能性。4、進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化已初步建立的，可對組蛋白基因調(diào)控區(qū)的甲基化等修飾及修飾位點進(jìn)行系統(tǒng)性定量鑒定的新技術(shù)，進(jìn)而探索特殊修飾在細(xì)胞增殖調(diào)控異常中的作用。力求發(fā)現(xiàn) 和鑒定１－２個關(guān)鍵核蛋白質(zhì)修飾類型及有可能用于新藥開發(fā)的重要靶標(biāo)。承擔(dān)單位：北京師范大學(xué)、北京大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：張宏權(quán)，教授，46歲，北京大學(xué)學(xué)術(shù)骨干：肖雪媛、紀(jì)建國等預(yù)算經(jīng)費： 23.5%課題四：調(diào)控細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究研究目標(biāo)：本課題將主要研究 Hippo 信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理；分析微 CYLD 和 EB1 等微管結(jié)合蛋白 調(diào)控細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程的分子機(jī)制。研究內(nèi)容：1、Hippo 信號通路組成蛋白間的動態(tài)互作。通 過上位分析（epistasis）和 IP-western 等方法全面調(diào)查 Hippo 信號通路各組成蛋白間動態(tài)的互作及其對 Hippo信號傳遞的意義；通過質(zhì)譜分析鑒定 Hippo 通路蛋白的修飾類型，特別是激酶Hpo 和 Wts 底物及其磷酸化位點的鑒定及其分子與生物學(xué)意義。2、鑒定新的靶蛋白。利用已有的 Yki 轉(zhuǎn)基因動物模型，通過 micro-array 比較表達(dá)譜的差異，鑒定新的 Yki 靶基因，并通 過上位分析（epistasis）確定其在Hippo 信號通路中的作用。3、鑒定 Hippo 通路調(diào)控分子及分析通路激活機(jī)制。與課題組三合作，利用高通量蛋白質(zhì)分析平臺和已制備的 Hpo 磷酸化 Wts 的磷酸化抗體，通過小分子RNA 干 擾基因表達(dá)檢測 Wts 的磷酸化水平的變化， 鑒定新的 Hippo 通路調(diào)控因子、特別 是上游調(diào)控分子并分析其功能，分析通路的激活機(jī)制。4、系統(tǒng)分析 Hippo 通路蛋白質(zhì)組群在細(xì)胞內(nèi)的定位與轉(zhuǎn)位。高速離心分離細(xì)胞組分，確定 Hippo 通路蛋白在細(xì)胞質(zhì)膜、 細(xì)胞質(zhì) 、細(xì)胞核以及細(xì)胞器的定位；在細(xì)胞整體水平上觀察通路蛋白的定位與轉(zhuǎn)位，分析引起蛋白轉(zhuǎn)位的因素與意義；Wts 、Mats 和 Wts 為中心體定位蛋白，均可以 調(diào) 控中心體的復(fù)制與染色體的分離，從而影響基因組的穩(wěn) 定性。我 們將與課題組二合作，探討三者之間的相互關(guān)系，為 Hippo 信號通路影響基因組穩(wěn)定性提供分子水平上的證據(jù)。5、探索 Hippo 信號通路與 Rassf、EB1、CYLD 等微管結(jié)合蛋白之間的關(guān)系，解析上述各蛋白協(xié)同或獨立調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的分子機(jī)理。承擔(dān)單位：南開大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：吳世安，教授，40歲，南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院特聘教授學(xué)術(shù)骨干：周軍、朱玉山等預(yù)算經(jīng)費： 23.5%（四）各課題間的相互關(guān)系，以及與項目總體目標(biāo)和五年目標(biāo)的關(guān)系根據(jù)總體目標(biāo)的要求，本項目的中心思想是維持細(xì)胞增殖與分裂過程中遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，而這一穩(wěn) 定性的維持有賴于細(xì)胞周期的精細(xì)調(diào)節(jié)，在此過程中不同蛋白組群相互作用、相互影響和相互調(diào)節(jié)。本 課題組將根據(jù)這個原則進(jìn)行分解、設(shè)計 ，了解與探索在細(xì)胞周期各個階段蛋白質(zhì)活 動的規(guī)律，探索信息 傳導(dǎo)在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)過程中的重要作用，評價細(xì)胞生存和死亡調(diào)控機(jī)制的價值。各個項目圍繞細(xì)胞周期的不同階段或不同檢驗點，選擇特定的研究渠道進(jìn)行機(jī)制研究和探索。各個課題之間相互 聯(lián)系、互相促 進(jìn)，旨在實現(xiàn) 本項目的總體目標(biāo)，即從與遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)蛋白質(zhì)群這一關(guān)鍵科學(xué)問題出發(fā)，在細(xì)胞周期的各個環(huán)節(jié)探討相關(guān)蛋白質(zhì)群的分子調(diào)控機(jī)制以及相互作用網(wǎng)絡(luò)。本項目五年目標(biāo)的完成則具體表現(xiàn)在以上所述四個課題的研究計劃中：課題一、著重研究DNA復(fù)制過 程中蛋白質(zhì)群的相互作用和 調(diào)節(jié)，同時研究DNA復(fù)制期檢驗點在維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用；課題二、了解有絲分裂過程中PTEN調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)群的相互作用和調(diào)節(jié)機(jī)制，還將進(jìn)一步探討PTEN與p53的分子抑癌網(wǎng)絡(luò)。以上兩個課題主要探 討細(xì)胞正常生長分裂過程中的兩個重要事件：DNA復(fù)制和有絲分裂中相關(guān)的蛋白質(zhì)群及其作用機(jī)制。課題三則利用現(xiàn)有的蛋白質(zhì)分析技術(shù)平臺來對細(xì)胞異常增殖中涉及的各種蛋白質(zhì)群進(jìn)行系統(tǒng)的大規(guī)模的鑒定和分析，以達(dá)到全面理解細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中各個系統(tǒng)蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)制和形式。此外，細(xì) 胞周期的完善與精細(xì)調(diào)節(jié)體現(xiàn)在遺傳 物質(zhì)穩(wěn)定性的保持。如果 細(xì)胞周期不能進(jìn)行正確調(diào)節(jié)，多 細(xì)胞系統(tǒng)將通過信號傳遞及細(xì)胞生長調(diào)控來實現(xiàn)細(xì)胞的存亡。課題四將研究不同細(xì)胞信號通路如何對細(xì)胞的生存和死亡進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。因而，以上四個課題相互關(guān)聯(lián)，層次遞進(jìn)，從作為中心的遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性，到細(xì)胞周期各階段的精確調(diào)節(jié)，到 細(xì)胞周期失調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，再到異常增殖導(dǎo)致的細(xì)胞信號通路的改變對細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。這些從細(xì)胞周期衍生出來的變化，讓細(xì)胞必須做出抉擇：生或死；正常增殖或發(fā)生腫瘤。課題組間在技術(shù)平臺層面還存在廣泛的聯(lián)系和互助。課題一的高精度蛋白分離技術(shù)將會用于所有課題所面臨的蛋白質(zhì)純化和分析的需求；課題二的基因敲除小鼠模型系統(tǒng)和課題三的斑馬魚腫瘤轉(zhuǎn)移模型系統(tǒng)可為其它課題組提供珍貴的活體動物模型，同時課題 三建立的快速鑒定調(diào)控細(xì)胞異常增殖蛋白質(zhì)群的動物在體技術(shù)平臺，將大大加速 對四個課題研究的與遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)蛋白質(zhì)群的功能研究，并結(jié)合不同信號通路的在體研究，有助于快速揭示這些蛋白質(zhì)群的作用機(jī)制；課題四的果蠅細(xì)胞快速增殖模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型可用于測試各個課題組鑒定出的新的蛋白質(zhì)群的功能。四、年度計劃第一年：研究內(nèi)容1. 篩選與 Sap1、Cds1 和 Dna2 相互作用的蛋白，并且大規(guī)模鑒定和 DNA 復(fù)制有關(guān)的蛋白。2. 建立穩(wěn)定高表達(dá) GSK-3β或 RNA 干擾 GSK-3β的 Hela 細(xì)胞系。3. 確定 TAP 的最佳條件，以便最大限度地 純化出 GSK-3β相互作用蛋白。4. 基因芯片法篩選出差異基因群，該基因群可能在轉(zhuǎn)錄水平直接或間接受GSK-3β的調(diào) 控。5. 著手研究 GSK-3β磷酸化 Cdh1 的具體位點，及其意義。6. 創(chuàng)建一系列 GFP-PTEN 質(zhì)粒，以使其在結(jié)構(gòu)上具有 AcGFP1 編碼序列。將 這些 pAcGFP 載體轉(zhuǎn)染 Pten+/+ MEFs 或 HeLa 細(xì)胞。對細(xì)胞周期中不同時期的細(xì)胞進(jìn)行分析以獲得 PTEN 動態(tài)定位的足夠信息。7. 在含有野生型 PTEN 和 PTEN 缺陷型的不同細(xì)胞系中對動粒功能進(jìn)行分析。8. 建立 PTEN 敲除 MEFs 系統(tǒng)和 PTEN 誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。通過 Western Blot 和Northern 分析檢測 PTEN 缺失和 PTEN 誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞中 p53 蛋白及其mRNA 的水平。9. 通過基因表達(dá)干預(yù)等方法從體內(nèi)外系統(tǒng)研究與肺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)蛋白 S100A7、S100A11 和 PHP14 等的生物學(xué)功能。10. 建立神經(jīng)細(xì)胞衰老和衰老模型，制備不同發(fā)育或分化階段的樣品材料，進(jìn)行亞細(xì)胞器分級實驗，提取關(guān)鍵蛋白質(zhì)組分。11. 在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平核實鑒定 Mig-2 上調(diào)的促 腫瘤生長和侵襲轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)群，并在腫瘤病人標(biāo)本上建立相關(guān)性。12. 利用微陣列方法鑒定 Hippo 通路靶蛋白集團(tuán)。13. 合成雙鏈 RNA，構(gòu)建果蠅 RNAi 文庫。14. 完成 Hippo 通路主要已知組成蛋白如 Hpo、Sav、Wts、Mats、Yki 等及微管結(jié)合蛋白蛋白 Rassf、CYLD、EB1 等 GFP 融合蛋白表達(dá) 載體的構(gòu)建，分析上述蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位、共定位與轉(zhuǎn)位情況。15. 分析微管結(jié)合蛋白對細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，檢測微管結(jié)合蛋白在腫瘤和對照組織中表達(dá)水平的變化及其表達(dá)對反映細(xì)胞生長或死亡的克隆形成率的影響，并通過 BrdU 整合實驗等，分析微管 結(jié)合蛋白表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響。16. 制備并純化 Wts 磷酸化抗體。預(yù)期目標(biāo)1. 質(zhì)譜確定和 Sap1 相互作用的候選蛋白。篩選得到一些和 Cds1 和 Dna2 相互作用的蛋白。篩選得到~100 個突變株。并開始突變株的形態(tài)分析、開始突變株突變基因的確定。2. 分別得到 3 株以上穩(wěn)定高表達(dá) GSK-3β或干擾 GSK-3β的 Hela 細(xì)胞系。3. 初步確定 TAP 的最佳條件.4. 篩選出干擾 GSK-3β后表達(dá)差異的基因群。5. 確定 GSK-3β磷酸化 Cdh1 的具體位點，初步確定 GSK-3β磷酸化 Cdh1 的意義。6. 揭示動粒中 PTEN 的精確定位。7. 確定 PTEN 缺失是否會導(dǎo)致染色體凝集和集合障礙，動粒-微管相互作用受損以及紡錘體檢驗點應(yīng)答障礙。8. 完成不同 PTEN 狀態(tài)下 p53 蛋白及其 mRNA 水平的 測定分析，確定 PTEN 如何控制 p53 轉(zhuǎn)錄。9. 確認(rèn) S100A7、S100A11 和 PHP14 在肺癌發(fā)生和/或發(fā)展中的生物學(xué)作用。10. 獲得不同發(fā)育和衰老階段的亞細(xì)胞器樣品。11. 選擇 2-3 個 Mig-2 上調(diào)的與腫瘤增殖和侵襲有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，闡明其調(diào)控機(jī)制。12. 得到 Yki 過量表達(dá)后靶蛋白表達(dá)增加與減少的順序列表，分析得到 3-5 個候選蛋白用于進(jìn)一步分析。13. 完成約 5，000 個果蠅基因雙鏈 RNA 的制備。14. 獲得 Hippo 通路主要組成蛋白細(xì)胞內(nèi)定位、共定位和轉(zhuǎn)位情況，完成對 Hippo通路與微管結(jié)合蛋白相互作用分子網(wǎng)絡(luò)的解析。15. 獲得微管結(jié)合蛋白對參與調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡機(jī)制的了解。16. 得到 Wts 磷酸化抗體。第二年：研究內(nèi)容1. 用體外生化方法，驗證和 Sap1 相互作用的蛋白。著手開展這些蛋白基因的突變株的篩選。開始篩選人細(xì)胞的 Sap1 同源蛋白。2. 對第一年篩選的突變株進(jìn)行形態(tài)分析，確定突變株的突變基因。DNA 序列分析確定突變基因的突變位點。序列對比分析這些基因表達(dá)的蛋白及可能的功能域。3. 體外驗證和 Cds1 及 Dna2 相互作用的蛋白。研究 Cds1 和 Dna2 通路的中間蛋白。著手開始篩選這些蛋白的突變株并開始功能分析。4. 利用生物信息學(xué)找出其中與細(xì)胞周期、DNA 損傷監(jiān)測 點的調(diào)控或與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因群。5. 利用 RT-PCR 在翻譯水平驗證該基因群；利用 Western blot 在蛋白水平上驗證。6. 以 TAP 大規(guī)模純化 GSK-3β高表達(dá)細(xì)胞 Hela 細(xì) 胞系與對照 Hela 細(xì)胞系裂解蛋白，SDS-PAGE 檢測差異蛋白群，LC-MS 以及生物信息學(xué)鑒定出差異蛋白群。7. 深入探討 GSK-3β磷酸化 Cdh1 的對細(xì)胞周期的影響及其意義。8. 將 pcDNA3/PTEN 轉(zhuǎn)染 Pten-/- MEFs 并且通過 Western 分析證實異位 PTEN表達(dá)，通過免疫熒光法和活細(xì)胞成像對上述細(xì)胞中的染色體排列和分離進(jìn)行監(jiān)測。9. 采用 epitope-tagging 策略從人類乳癌 MCF-7 細(xì)胞中分離純化在核內(nèi)與 PTEN存在特異性相互作用的新的有絲分裂因子。對所得蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析后搜索蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定。10. 采用染色質(zhì)免疫共沉淀法（ChIP）檢測 PTEN 與 p53 啟動子 DNA 物理上的關(guān)聯(lián)。熒光素酶分析法檢測 PTEN 對 p53 啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。進(jìn)行 Dnase I 指紋圖譜分析，通過核心指紋圖譜系統(tǒng)精確限定 PTEN 與 p53 啟動子的結(jié)合區(qū)域。在 p53 啟動子區(qū)域構(gòu)建一系列的缺失來縮小 PTEN 結(jié)合的最小的必需序列。11. 在第一年工作的基礎(chǔ)上，采用 TAP 技術(shù)對 S100A7、S100A11 和 PHP14 等相互作用蛋白或蛋白復(fù)合體組分進(jìn)行篩選，并對獲得的候選蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。通過免疫共沉淀等方法對其中感興趣的候選蛋白進(jìn)行驗證。12. 對不同階段細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定同位素定量標(biāo)記研究，收集研究材料進(jìn)行亞細(xì)胞器分級，初步分析標(biāo)記效率和蛋白質(zhì)表達(dá)情況，利用質(zhì)譜鑒定部分蛋白質(zhì)。13. 通過免疫共沉淀并結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)新的 Mig-2 相互作用蛋白質(zhì)、制備抗體，揭示 mig-2 本身調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制。14. 通過免疫組化分析的方法在體內(nèi)驗證 Hippo 通路調(diào)控新靶蛋白的表達(dá)并確定其參與的生物學(xué)過程。15. 合成雙鏈 RNA，構(gòu)建果蠅 RNAi 文庫。16. 利用果蠅 RNAi 文庫、通 過 western blotting 方法觀察 Wts 磷酸化水平的變化篩選 Hippo 通路調(diào)控蛋白。預(yù)期目標(biāo)課題一：1. 確定和 Sap1 相互作用的蛋白。得到 1 或 2 個和 Sap1 相互作用的蛋白的基因條件突變株。得到和人細(xì)胞 Cdc6 蛋白相互作用的候選蛋白。2. 完成突變株的形態(tài)分析。 完成突變株的突變基因的確定。 完成序列對比分析及蛋白功能域的確定。3. 確定 Cds1 及 Dna2 相互作用蛋白。敲除它 們的基因。完成突變株的形態(tài)分析。4. 驗證出 3-5 個與細(xì)胞周期、DNA 損傷監(jiān)測點的調(diào)控或與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)受 GSK-3β直接或 間接調(diào)控的基因。5. LC-MS 鑒 定 5-10 個 TAP 純化的差異蛋白。6. 確定 GSK-3β磷酸化 Cdh1 的對細(xì)胞周期的影響及其意義。7. 確定在 Pten 缺陷型細(xì) 胞中過度表達(dá) PTEN 是否能校正染色體錯排和分離錯誤，以及恢復(fù)動粒功能和檢驗點應(yīng)答。8. 分離純化若干個與 PTEN 相互作用的有絲分裂相關(guān)蛋白，并查詢其基本生物功能。9. 確定 PTEN 調(diào)節(jié) p53 轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制。10. 獲得若干個 S100A7、S100A11 和 PHP14 的相互作用蛋白或蛋白復(fù)合體組分。將其中一些蛋白將申請專利。11. 將穩(wěn)定同位素標(biāo)記進(jìn)入細(xì)胞各亞細(xì)胞器，獲得蛋白質(zhì)的動態(tài)表達(dá)數(shù)據(jù)。12. 獲得 Mig-2 調(diào)控的新信號通路并建立相關(guān)信號通路與腫瘤病人的相關(guān)性。13. 確定 3-5 個候選靶蛋白在 Hippo 通路調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡中作用。14. 完成另外約 5，000 個果蠅基因雙鏈 RNA 的制備。15. 完成 Hippo 通路調(diào)控蛋白的篩選，分析選擇 3-5 個候選基因用于下一步分析。16. 培養(yǎng)研究生 8 名，培養(yǎng)博士后 4 名。 發(fā)表 IF>10 的論文 4 篇，IF>5 的論文 16篇。申請專利 4 項。第三年：研究內(nèi)容課題一：1. 開始 Sap1 相互作用蛋白的功能分析。驗證和人細(xì)胞 Cdc6 相互作用的蛋白。2. 研究這些蛋白在細(xì)胞生長過程中的動態(tài)變化。研究它們是否是 DNA 復(fù)制必需的蛋白。研究它們是作用于 DNA 復(fù)制起始階段還 是 DNA 合成延長階段。3. 著手開展研究 Cds1 及 Dna2 相互作用蛋白在維 持 DNA 復(fù)制叉穩(wěn)定性中的作用。4. 研究 3-5 基因芯片篩選的個蛋白在翻譯水平上受 GSK-3β調(diào)控的方式及其機(jī)理（直接調(diào)控還是間接調(diào)控）。5. 評價該 3-5 個蛋白對細(xì)胞周期調(diào)控、DNA 損傷監(jiān)測點調(diào)控的作用，或?qū)δ[瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用。6. 細(xì)胞水平驗證 TAP-LC-MS 發(fā)現(xiàn)的 GSK-3β相互作用蛋白的相互作用（免疫共沉淀實驗、GST pull-down 實驗等）7. 從 PTEN+/+ MEFs 和 PTEN-/- MEFs 中提取 RNA，逆 轉(zhuǎn)錄為 cDNA，采用生物素標(biāo)記探針對芯片進(jìn)行雜交。比較整體基因表達(dá)譜與 PTEN 功能的關(guān)系。8. 采用細(xì)菌表達(dá)的蛋白（GST-PTEN，GST 和候選蛋白）進(jìn)行體外 GST pull-down分析。建立 HA-標(biāo)記的鑒定蛋白細(xì)胞系，在 該細(xì)胞系中，或瞬時轉(zhuǎn)染 PTEN 表達(dá)載體及 HA-標(biāo)記的鑒定蛋白的細(xì)胞中進(jìn)行體內(nèi)免疫沉淀和 western blot 分析。9. 構(gòu)建含有 PTEN 磷酸酶活性失活的哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒，檢測 p53 的產(chǎn)生是否依賴于 PTEN 磷酸酶活性，同時檢測存在或缺失 PTEN 時 p53 是否發(fā)生活化。利用免疫沉淀（IP-Western）檢測 AKT 和 p53 之間的物理相互作用。10. 采用免疫共沉淀等方法對候選的相互作用蛋白進(jìn)行驗證，從中選取 1-2 個感興趣蛋白或是功能未知蛋白，通過基因轉(zhuǎn)染等方法對其進(jìn)行生物學(xué)功能分析。11. 利用多種質(zhì)譜系統(tǒng)如 MALDI TOF/TOF MS 和 LC-MS/MS 系統(tǒng)鑒定不同衰老階段的蛋白質(zhì)動態(tài)表達(dá)和修飾，鑒定修飾位點和修飾類型，進(jìn)行氧化修飾和組蛋白質(zhì)及和蛋白質(zhì)修飾分析。12. 通過蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)，結(jié)合使用抑制劑和細(xì)胞實時圖像技術(shù)，揭示 Mig-2調(diào)控細(xì)胞周期 M-entry 和 Spindle assembly 的分子機(jī)制。13. Hippo 通路候選調(diào)控蛋白體內(nèi)外功能分析。構(gòu)建候選蛋白轉(zhuǎn)基因和敲基因動物模型，觀察其表型特點；利用免疫共沉淀等方法確定候選蛋白與 Hippo 通路已知蛋白之間的相互作用。14. 通過細(xì)胞共轉(zhuǎn)染、蛋白分離純化和質(zhì)譜分析鑒定 Hpo 磷酸化 Sav 的關(guān)鍵磷酸化位點，構(gòu)建關(guān)鍵位點突變的轉(zhuǎn)基因和敲入（knock-in）果蠅模型，分析磷酸化位點的功能。15. 分析 Hippo 信號通路主要蛋白與線粒體功能的相互關(guān)系，如 Hippo 通路蛋白與線粒體蛋白的共定位情況、Hippo 通路對線粒體功能的影響、線粒體對Hippo 通路激活機(jī)制的影響。16. 整理分析數(shù)據(jù)，撰寫論文。預(yù)期目標(biāo)1. 確定 Sap1 相互作用蛋白是否在 DNA 復(fù)制起始中起必需作用。 驗證和確定人細(xì)胞 Cdc6 相互作用的蛋白，即人 細(xì)胞 Sap1 的同源蛋白。2. 確定這些和 DNA 復(fù)制過程相關(guān)蛋白在 DNA 復(fù)制過程中的作用階段。3. 確定 Cds1 和 Dna2 之間的通路。4. 初步闡明 5-10 個基因在翻譯水平上受 GSK-3β調(diào)控的方式及其機(jī)理。5. 初步闡明 3-5 個受 GSK-3β調(diào)控的基因?qū)?xì)胞周期調(diào)控、DNA 損傷監(jiān)測點調(diào)控的作用，或?qū)δ[瘤的發(fā)生、 發(fā)展中的作用。6. 驗證出 3-5 個與 GSK-3β相互作用的蛋白。7. 完成基因芯片篩選分析，鑒定出若干由 PTEN 調(diào)節(jié)的靶基因。8. 驗證第二年通過分離純化鑒定的若干 PTEN 相關(guān)蛋白與 PTEN 的相互作用是否為直接的。9. 完成 PTEN 磷酸化與 p53 活性的相關(guān)性分析以及 AKT 與 p53 相互作用的分析，確定 PTEN 是否間接調(diào)節(jié) p53 通路。10. 初步探究 S100A7、S100A11 和 PHP14 對肺癌發(fā)生和/或發(fā)展的分子機(jī)理。11. 獲得細(xì)胞核蛋白質(zhì)動態(tài)修飾、修飾類型、修 飾位點信息，為進(jìn)一步功能分析打下基礎(chǔ)。12. 闡明 Mig-2 調(diào)控細(xì)胞周期和基因組不穩(wěn)定性的新分子機(jī)制。13. 得到 3-5 候選調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)基因與敲基因果蠅動物模型，根據(jù)表型初步判斷其生理功能；確定候選蛋白與 Hippo 通路蛋白的相互作用。14. 確定 Hpo 磷酸化 Sav 的關(guān)鍵位點與磷酸化的生物學(xué)意 義。15. 確定 Hippo 通路蛋白特別是 Hpo 與線粒體功能的相互關(guān)系。16. 培養(yǎng)研究生 12 名，培養(yǎng)博士后 4 名。 發(fā)表 IF>10 的論文 4 篇，IF>5 的論文 16篇。申請專利 4-8 項。第四年：研究內(nèi)容1. 開始研究 Sap1 相互作用蛋白在 DNA 復(fù)制起始中的機(jī)理研究。 研究人細(xì)胞Sap1 在 DNA 復(fù)制起始中的作用。2. 開始新確定的 DNA 復(fù)制蛋白在 DNA 復(fù)制起始及延長階段的作用機(jī)理研究。3. 開展研究 Cds1 及 Dna2 相互作用蛋白在維持基因 組穩(wěn)定性中的作用。4. 進(jìn)一步研究受 GSK-3β調(diào)控的基因?qū)?xì)胞周期調(diào)控、DNA 損傷監(jiān)測點調(diào)控，或?qū)δ[瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用、意義及其機(jī)理。5. 鑒定各個蛋白與 GSK-3β相互作用的肽段或 GSK-3β對各個蛋白磷酸化的位點。6. 研究各個與 GSK-3β相互作用蛋白對細(xì)胞對周期調(diào)控、DNA 損傷監(jiān)測點調(diào)控，或?qū)δ[瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用，以及與 GSK-3β對該 蛋白功能的影響。7. 采用染色質(zhì)免疫共沉淀法（ChIP）檢測 PTEN 與染色質(zhì)物理上的關(guān)聯(lián)，隨后以熒光素酶分析法檢測 PTEN 對靶基因啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。進(jìn)行 Dnase I 指紋圖譜分析，通過核心指紋圖譜系統(tǒng)精確限定 PTEN 與靶基因啟動子的結(jié)合區(qū)域。基于指紋圖譜分析數(shù)據(jù)，在啟動子區(qū)域進(jìn)行一系列的缺失來縮小 PTEN結(jié)合的最小的必需序列。8. 利用課題組三的蛋白質(zhì)分析平臺鑒定 PTEN 與有絲分裂相關(guān)蛋白質(zhì)群的物理性相互作用的結(jié)構(gòu)域及蛋白質(zhì)修飾位點。進(jìn)一步通過 RNAi 等分析已驗證蛋白的功能特性。9. 建立條件性 PTEN knock-in 小鼠模型。10. 在不同 PTEN 和 p53 狀態(tài)的乳腺癌細(xì)胞株中，通過 Western 分析檢測 p53、 Apaf-1、PUMA 和 PAC1 的基本表達(dá)水平。在 PTEN siRNA 以及 PTEN189 突變的細(xì)胞株中再次檢測 p53、Apaf-1、PUMA 和 PAC1 的表達(dá)水平。11. 采用基因表達(dá)芯片和/或雙向電泳等技術(shù)篩選 S100A7、S100A11 和 PHP14 基因沉默后，對其所調(diào)控的基因或蛋白群表達(dá)的影響。12. 分析關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)和修飾變化，激起涉及關(guān)鍵生物學(xué)機(jī)制和信號傳導(dǎo)途徑，對關(guān)鍵蛋白質(zhì)通過基因表達(dá)干預(yù)、利用 RNAi 和小分子化合物進(jìn)行抑制和/ 或活化進(jìn)行功能研究。13. 研究 Mig-2 調(diào)控的多重細(xì)胞信號通路及其協(xié)同整合調(diào)控腫瘤侵襲性生長的分子機(jī)制，特別要關(guān)注 Mig-2 信號通路與 Wn、Hedgehog 及生長因子信號通路中的交互作用。14. 利用構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因以及敲基因果蠅模型，通過上位分析（epistatsis ）探討候選調(diào)控蛋白與已知 Hippo 通路蛋白的遺傳學(xué)關(guān)系，并結(jié)合前述所得體外相互作用分析通路激活機(jī)制。15. 探討 Hippo 通路蛋白直接影響基因組穩(wěn)定性的機(jī)理，分析通路蛋白如Wts、Mats 等與 PTEN 和 P53 等蛋白之間的關(guān)系。16. 結(jié)合果蠅研究，選擇 1-2 種候選調(diào)控蛋白構(gòu)建誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因小鼠模型，探討候選基因在哺乳動物中的功能保守性。17. 整理分析數(shù)據(jù)，撰寫論文。預(yù)期目標(biāo)1. 確證 Sap1 相互作用蛋白在 DNA 復(fù)制起始中的作用。 確證人細(xì)胞 Sap1 在DNA 復(fù)制起始中的作用。2. 初步確定新的 DNA 復(fù)制蛋白在 DNA 復(fù)制中的作用機(jī)理。3. 初步確定 Cds1 及 Dna2 相互作用蛋白在維持復(fù)制叉的 穩(wěn)定性、 DNA 修復(fù)、及基因組穩(wěn)定性的作用機(jī)理。4. 深入闡明 3-5 個受 GSK-3β調(diào)控的基因?qū)?xì)胞周期調(diào)控、DNA 損傷監(jiān)測點調(diào)控的作用，或?qū)δ[瘤的發(fā)生、 發(fā)展中的作用。5. 鑒定 3-5 個與 GSK-3β相互作用蛋白的具體作用肽段或位點。6. 初步闡明 3-5 個與 GSK-3β相互作用蛋白對細(xì)胞對周期調(diào)控、DNA 損傷監(jiān)測點調(diào)控，或?qū)δ[瘤的發(fā)生、 發(fā)展中的作用，以及與 GSK-3β相互作用后對該蛋白功能的影響。7. 對之前通過基因芯片鑒定的 PTEN 靶基因，確定 PTEN 調(diào)控這些靶基因表達(dá)的機(jī)理。8. 完成 PTEN 及其相關(guān)蛋白質(zhì)群的功能分析，評價與 PTEN 相互作用的蛋白質(zhì)群在控制有絲分裂中的重要性。9. 獲得條件性 PTEN knock-in 小鼠。10. 完成在 PTEN 缺失或突變的狀態(tài)下 p53 通路蛋白表達(dá)水平的測定分析，證實PTEN 功能障礙能引發(fā) p53 通路活化。11. 揭示 S100A7、S100A11 和 PHP14 抑制肺癌細(xì)胞生長和/或轉(zhuǎn)移的信號通路。12. 獲得和蛋白質(zhì)動態(tài)變化所涉及的關(guān)鍵生物學(xué)機(jī)制，分析相互作用蛋白質(zhì)。13. 揭示 Mig-2 信號通路與 Wnt、Hedgehog 及生長 因子信號通路的蛋白質(zhì)群之間在調(diào)控腫瘤侵襲性生長中協(xié)同整合作用。14. 闡明候選蛋白在 Hippo 通路中的位置與激活通路的分子機(jī)制。15. 確定 Hippo 通路與基因組穩(wěn)定性之間的直接關(guān)系。16. 得到 1-2 種候選蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。17. 培養(yǎng)研究生 12 名，培養(yǎng)博士后 4 名。 發(fā)表 IF>10 的論文 4 篇，IF>5 的論文 16篇。申請專利 4-8 項。第五年：研究內(nèi)容1. 多方面深入研究 Sap1 相互作用蛋白在 DNA 復(fù)制起始中的作用機(jī)理。探 討人細(xì)胞 Sap1 在 DNA 復(fù)制起始中的作用。2. 深入研究新的 DNA 復(fù)制蛋白在 DNA 復(fù)制起始及在復(fù)制叉生化反應(yīng)中的機(jī)理。3. 探討 Cds1 及 Dna2 相互作用蛋白在維持基因組穩(wěn) 定性中的作用。4. 進(jìn)一步研究各個與 GSK-3β相互作用蛋白對細(xì)胞周期調(diào)控、DNA 損傷監(jiān)測點調(diào)控，或?qū)δ[瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用，意 義及其機(jī)理，以及與 GSK-3β相互作用后對該蛋白功能的影響、意義及其機(jī)理。5. 在從 PTEN189 小鼠和