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LOREMIPSUMDOLOR,乙肝病毒DNA的實驗室檢測,1,1、熒光定量PCR技術2、乙肝病毒的感染3、HBV-DNA與臨床,2,熒光定量PCR技術,3,熒光定量PCR技術,Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶鏈式反應，是一種DNA的快速擴增技術。PCR技術通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱酶（TaqDNA聚合酶）的作用，經(jīng)過高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個步驟在3個小時內(nèi)反復循環(huán)25-30次，把特定的DNA片段擴增1000萬倍。每個PCR體系含4種主要成分：含有待擴增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）,4,實時熒光定量PCR技術，是指在反應體系中加入熒光標記，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，通過標準曲線對PCR終產(chǎn)物的分析，最終實現(xiàn)對未知的起始模版進行定量分析的一種技術，是迄今對已知基因序列的核酸測定中最靈敏的方法。,熒光定量PCR技術,5,PCR反應過程,d.NTPs,Taq酶,Primers,反應組分,變性,,6,,延伸,,重復,退火,7,循環(huán)24個拷貝,循環(huán)38個拷貝,8,熒光定量PCR原理,插入染料法SYBRGreenI雜交探針法(最常用)TaqMan,9,TaqMan探針,d.NTPs,Taq酶,Primers,反應體系,變性,,l,10,,退火,1.鏈取代,2.水解,3.聚合,4.檢測熒光,l,,,,11,乙肝病毒的感染,12,乙肝病毒的感染,（一）乙型肝炎病毒結構及特點,HBsAg：是HBV感染的主要標志HBsAb：保護性抗體HBcAg：僅存于感染的肝細胞核內(nèi)，一般不存在于血循環(huán)中HBcAb:非保護性抗體，HBcAb-IgM提示HBV處于復制狀態(tài)HBeAg：HBV復制及強感染性的指標HBeAb：有一定的保護作用，預后良好,13,乙肝病毒的感染,（二）HBV-DNA與“兩對半”,1.“兩對半”：機體的免疫反應狀態(tài)；,2.“攜帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學指標不能反應體內(nèi)病毒復制水平與感染程度。,FQ-PCR：檢測的是HBV本身的遺傳物質(zhì)—DNA，是病毒存在和復制的最可靠、最直接的指標。,,3.血清學指標(－)不能排除HBV感染。,14,乙肝病毒的感染,5.HBeAg陽性標本HBVDNA檢出率90％左右HBeAg與HBVDNA有著良好的相關性,4.也可能出現(xiàn)HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。,15,乙肝病毒的感染,16,乙肝病毒的感染,慢性HBV感染分期及相關實驗室檢測指標,魯鳳民，莊輝，乙型肝炎實驗室診斷研究進展2009,,17,HBV-DNA與臨床,18,HBVDNA檢測的臨床意義,HBVDNA是HBV存在最直接的依據(jù)HBVDNA是HBV復制的標志HBVDNA是患者具有傳染性的標志HBVDNA對乙肝兩對半起補充作用HBVDNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標HBVDNA可檢測出隱匿性慢性乙型肝炎,19,有利于獻血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷,提供直接證據(jù)縮短“窗口期”,HBVDNA檢測的臨床意義,20,調(diào)查表明并不是所有“大三陽”的病人都處于HBV復制期，具有傳染性；也不是所有“小三陽”的病人HBV都無復制。因此，要準確知道HBV是否處于復制狀態(tài)，最準確的方法還是通過檢測HBVDNA來決定。,HBVDNA檢測的臨床意義,21,22,23,HBVDNA檢測的臨床意義,HBsAg和HBeAg均陽性而HBVDNA陰性？,●干擾素或拉米夫定等治療后病毒復制受抑制。●PCR所用引物相應的DNA序列發(fā)生突變，此引物與突變DNA不能配對結合?！癫《綝NA整合于宿主肝細胞染色體而血中游離HBVDNA很少或缺乏。,24,目前尚無一種能迅速、直接殺死清除乙肝病毒的藥物，最好的抗病毒藥物療效也僅能達到50％左右。目前國際醫(yī)學界公認的治療慢性乙肝有確切療效的抗病毒藥物主要有兩大類：?干擾素：重組人α-1b干擾素、α-2a、α-2b干擾素等。核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋。,乙肝的治療,25,主要包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎保肝、抗纖維化等對于HBVDNA≥105的患者應進行抗病毒治療,乙肝的治療,26,謝謝,27,