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聚丙酰胺凝膠電泳法分離丙球蛋白,樊貝貝第二組,目錄,簡介實訓(xùn)原理材料與器材操作步驟注意事項,簡介,一、電泳法（如：聚丙烯酰胺凝膠電泳)定義：利用溶液中帶有不同量的電荷的陽離子或陰離子，在外加電場中以不同的遷移速度向電極移動，而達到分離目的的分析方法。作用：用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。作用原理：聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）；非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。,聚丙烯酰氨凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種：化學(xué)聚合法和光聚合法。化學(xué)聚合以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。,聚丙烯酰胺凝膠的特性,凝膠透明，有彈性，機械性能好；化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)；對pH和溫度變化較穩(wěn)定,幾乎無吸附和電滲作用；樣品用量少，靈敏度可達10-6g;凝膠孔徑可調(diào)節(jié)；分辨率高。,影響電泳速度的因素,樣品本身：帶電量，分子大小，形狀電場強度：電壓電泳介質(zhì)的pH和離子強度電滲作用,盤狀電泳,圓盤電泳是帶電粒子(膠體顆粒、離子等)在電場的作用下在特定的介質(zhì)中向與其電荷性質(zhì)相反的電極方向定向泳動的現(xiàn)象.廣泛應(yīng)用于生物大分子的分離和鑒定。它是利用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在催化劑的作用下聚合成大分子的凝膠物。它同時兼有分子篩和電泳效應(yīng)。當(dāng)樣品通過凝膠進行電泳時，便可以根據(jù)其樣品中各分子的電荷和分子量的不同而泳動出不同的區(qū)帶。由于聚丙烯酰胺凝膠化學(xué)性質(zhì)較瓊脂穩(wěn)定，很少帶有側(cè)基，在電泳過程中，吸附作用與電滲作用均小，所以該技術(shù)的分辨率均高于其它瓊脂電泳技術(shù)。,實訓(xùn)原理,聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳是根據(jù)被分離物質(zhì)所帶的電荷多少及其分子的大小，形狀的不同，在電場的作用下，產(chǎn)生不同的速度而分離的方法。它具有分子篩效應(yīng)、電荷效應(yīng)、濃縮效應(yīng)三重作用。在這三重效應(yīng)的共同作用下使血清蛋白中不同的蛋白質(zhì)分離開來。,材料與儀器,電泳儀、電泳槽、注射器、長針頭、吸管、培養(yǎng)皿試劑：1.三羥甲基氨基甲烷（簡稱Tris）2.貯備液的配制：按下表配制A、B、C、D、E、F各貯備液，然后冷藏于4℃條件下，以防變質(zhì)。,3.染色液：0.05%氨基黑10B溶于7%醋酸溶液，或者用靈敏度高5倍考馬斯亮藍R250溶液染色。4.脫色液：7%醋酸溶液。5.電極緩沖液（pH8.3甘氨酸-Tris緩沖液）：甘氨酸28.8g，Tris0.6g加水定容至1000ml.6.示蹤劑：0.01%溴酚藍溶液,操作步驟,1.制膠：取一支長10cm左右的玻璃管，在一端套上乳膠帽。1）7%聚丙烯酰胺凝膠（PH8.9，分離膠）：將試劑按A:C:H2O:F=5ml：10ml：5ml：15ml比例混合于一燒杯中.用滴管將分離膠加入玻璃管至3/4高度，表面再加少量水覆蓋，在烘箱中25~35℃下聚合，當(dāng)有界面出現(xiàn)時，表明已經(jīng)聚合，吸取分離膠表面的水分。2）2.5%聚丙烯酰胺凝膠（pH6.7，濃縮膠）：將試劑按B:D:E:F=2ml：4ml：2ml：8ml比例混合于燒杯中，迅速將其用滴管加到分離膠上面。加入1厘米高左右，在小心地加入一層薄水。然后膠管于烘箱中25℃~35℃下放置，待第二次出現(xiàn)界面，表示聚合完成，除去表面水分。,2.安裝膠管把玻璃管下端得橡皮冒除去（拔時用力不要過猛，以防使膠條受損），將膠管安裝在電泳儀上。注意垂直，并要緊密，防止緩沖液從上槽漏下。先向各膠管中加滿電極緩沖液，不要有氣泡留存，在向下槽注入緩沖液，然后將膠管下降至下槽緩沖液內(nèi)。3.加樣0.5ml新鮮血清，用5ml20%蔗糖溴酚藍溶液稀釋。用微量注射器或移液槍向膠管內(nèi)加20ul樣品液，注意微量注射器或移液槍頭要插入膠管內(nèi)加液。,4.電泳上槽連接負極，下槽連接正極，然后通電，先每管電流3mA電泳，當(dāng)示蹤劑進入分離膠時，電流增至每管5mA。當(dāng)示蹤劑移至膠管下端1cm處時，關(guān)閉電源，取出膠管。電泳大約2-3小時。5.剝膠取一只帶長針頭的注射器，灌滿水，將針頭從濃縮膠的一端小心的管壁與凝膠之間，轉(zhuǎn)動膠管，并同時推動注射器，在針頭向前推動時，注入蒸餾水，使膠條隨水的壓力及潤滑作用從玻璃管中脫離。,6.染色及洗脫1).將取下的膠條放入12.5%三氯醋酸中固定10min，用1%考馬斯亮藍水溶液染色15min，7%醋酸過夜保存。2).將取下的膠條放入7%三氯醋酸中固定10min，用氨基黑10B染色15min，7%醋酸浸泡過夜。注:染液回收。7.觀察繪圖將脫色膠條取出放于濾紙上，觀察分離色帶，將結(jié)果繪于實驗報告紙上。,注意事項,1．丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑，對皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸。2．制膠時，要充分搖勻，加速劑TEMED最后加。3．注意觀察實驗現(xiàn)象：分界面，濃縮效應(yīng).4.染液回收。5．固體膠切忌倒入水池。,謝謝觀賞,