《【SN商檢標(biāo)準(zhǔn)】snt 1135.5 馬鈴薯環(huán)腐病菌檢疫鑒定方法》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《【SN商檢標(biāo)準(zhǔn)】snt 1135.5 馬鈴薯環(huán)腐病菌檢疫鑒定方法（9頁珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、 中 華 人 民 共 和 國 出 入 境 檢 驗(yàn) 檢 疫 行 業(yè) 標(biāo) 準(zhǔn) 犛 犖 ／犜 １１３５ ．５ — ２００７ 馬 鈴 薯 環(huán) 腐 病 菌 檢 疫 鑒 定 方 法 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀 狅犳 犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉 犿犻犮犺犻犵犪狀犲狀狊犻狊 狊狌犫狊狆 ．狊犲狆犲犱狅狀犻犮狌狊 ２００７１２２４ 發(fā)

2、布 ２００８０７０１ 實(shí) 施 中 華 人 民 共 和 國 發(fā) 布 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局 犛犖 ／犜 １３５ ．５ — ２０７ 前 　　 言 　　 ＳＮ — ／ Ｔ１３５ 共分為五個(gè)部分 馬鈴薯癌腫病檢疫鑒定方法 ： ； — 馬鈴薯黃化矮縮病毒檢疫鑒定方法 ； — 馬鈴薯帚頂病毒檢疫鑒定方法 ； — 馬鈴薯黑粉病菌檢疫鑒定方法 ； — 馬鈴薯環(huán)腐病菌檢疫鑒定方法 。 本部分是 ＳＮ ／ Ｔ１３５ 的第 ５ 部分 。

3、 本部分的附錄 Ｂ 、附錄 Ｃ 均為規(guī)范性附錄 ，附錄 Ａ 為資料性附錄 。 本部分由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口 。 本部分起草單位 ：中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 、中華人民共和國北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 。 本部分主要起草人 ：趙文軍 、陳紅運(yùn) 、梁新苗 、張樂 、朱水芳 、魏梅生 。 本部分系首次發(fā)布的出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 。 Ⅰ 犛 犖 ／犜 １１３５ ．５ — ２００７

4、馬 鈴 薯 環(huán) 腐 病 菌 檢 疫 鑒 定 方 法 １ 　 范 圍 Ｓ Ｎ ／ Ｔ １１３５ 的 本 部 分 規(guī) 定 了 馬 鈴 薯 環(huán) 腐 病 菌 的 檢 疫 鑒 定 方 法 。 本 部 分 適 用 于 所 有 進(jìn) 出 境 馬 鈴 薯 種 薯 及 商 品 用 薯 的 檢 疫 和 鑒 定 。 ２ 　 術(shù) 語 和 定 義 ２ ．１ 下 列 術(shù) 語 和 定 義 適 用 于 Ｓ Ｎ ／ Ｔ １１３

5、５ 的 本 部 分 。 雙 抗 體 夾 心 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 測 定 在 固 相 支 持 物 上 （酶 聯(lián) 板 ）包 被 細(xì) 菌 特 異 性 抗 體 ，加 入 待 測 樣 品 后 ，再 用 酶 標(biāo) 記 的 細(xì) 菌 抗 體 進(jìn) 行 免 疫 識(shí) 別 ，最 后 通 過 酶 促 化 學(xué) 反 應(yīng) 檢 測 細(xì) 菌 是 否 存 在 的 一 種 血 清 學(xué) 檢 測 方 法 。 ２ ．２ 犘 犆 犚 以 耐 熱

6、 Ｄ Ｎ Ａ 聚 合 酶 和 一 對(duì) 引 物 （與 待 測 目 標(biāo) 核 酸 分 子 序 列 同 源 的 Ｄ Ｎ Ａ 片 段 ）通 過 高 溫 （Ｄ Ｎ Ａ 分 子 變 性 ）和 低 溫 （引 物 和 目 標(biāo) 核 酸 分 子 復(fù) 性 并 被 耐 熱 Ｄ Ｎ Ａ 聚 合 酶 延 伸 ）交 替 循 環(huán) 擴(kuò) 增 待 測 目 標(biāo) 核 酸 分 子 的 方 法 。 ３ 　 原 理 馬 鈴 薯 環(huán) 腐 病 菌 （犆犾犪狏犻犫犪犮

7、狋犲狉 犿犻犮犺犻犵犪狀犲狀狊犻狊 ｓｕｂｓｐ ．狊犲狆犲犱狅狀犻犮狌狊 ），屬 厚 壁 菌 門 （Ｆｉｒ ｍｉｃｕｔｅｓ ）厚 壁 細(xì) 菌 綱 （Ｆｉｒ ｍｉｂａｃｔｅｒｉａ ）棒 形 桿 菌 屬 （犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉 ），依 靠 病 薯 進(jìn) 行 遠(yuǎn) 距 離 傳 播 。 寄 主 及 世 界 分 布 參 見 附 錄 Ａ 。 ４ 　 儀 器 和 用 具 ４ ．１ 　 儀 器 設(shè) 備 Ｐ Ｃ Ｒ 儀 、超 凈 工 作 臺(tái) 、滅 菌 鍋 、制 冰 機(jī) 、核 酸 蛋

8、 白 分 析 儀 、高 速 冷 凍 離 心 機(jī) 、臺(tái) 式 小 型 離 心 機(jī) 、超 低 溫 冰 箱 、常 規(guī) 冰 箱 、旋 渦 振 蕩 器 、微 量 進(jìn) 樣 器 、電 泳 儀 、凝 膠 成 像 系 統(tǒng) 、酶 標(biāo) 儀 。 ４ ．２ 　 主 要 試 劑 除 另 有 規(guī) 定 外 ， 所 有 試 劑 均 為 分 析 純 。 Ｐ Ｃ Ｒ 緩 沖 液 、 氯 化 鎂 （Ｍ ｇ Ｃｌ２ ）、ｄ Ｎ Ｔ Ｐｓ （ｄ Ａ Ｔ Ｐ 、ｄ Ｔ Ｔ Ｐ 、 ｄ

9、Ｃ Ｔ Ｐ 、ｄ Ｇ Ｔ Ｐ ）、犜 犪狇 Ｄ Ｎ Ａ 聚 合 酶 、引 物 和 探 針 、牛 肉 汁 、酵 母 膏 、磷 酸 氫 二 鉀 （Ｋ ２ Ｈ Ｐ Ｏ ４ ）、磷 酸 二 氫 鉀 （Ｋ Ｈ ２ Ｐ Ｏ ４ ）、硫 酸 鎂 （Ｍ ｇＳ Ｏ ４ ）、葡 萄 糖 、瓊 脂 ，酶 聯(lián) 檢 測 試 劑 見 附 錄 Ｂ 。 ５ 　 病 菌 的 鑒 定 ５ ．１ 　 癥 狀 檢 查 取 樣 品 量 １ ％ ～ ５ ％ （若 樣 品 少 可

10、 適 量 增 大 比 例 ）的 塊 莖 進(jìn) 行 檢 查 。 將 塊 莖 橫 切 ，檢 查 環(huán) 腐 病 菌 侵 染 癥 狀 ，擠 壓 塊 莖 ，檢 查 維 管 組 織 是 否 浸 解 。 發(fā) 病 輕 者 維 管 束 變 黃 ，呈 不 連 續(xù) 的 點(diǎn) 狀 變 色 ；重 者 整 個(gè) 維 管 束 環(huán) 變 色 。 病 菌 也 可 侵 害 塊 莖 維 管 束 周 圍 的 薄 壁 組 織 ，呈 環(huán) 狀 腐 爛 ，嚴(yán) 重

11、 時(shí) 可 引 起 皮 層 與 髓 部 組 織 分 離 ， 輕 輕 擠 壓 塊 莖 從 維 管 束 中 涌 出 奶 酪 樣 的 柱 狀 物 。 塊 莖 表 面 的 癥 狀 在 輕 度 危 害 時(shí) 不 明 顯 ，隨 病 害 發(fā) 展 ，皮 色 變 暗 或 變 褐 ，嚴(yán) 重 時(shí) 表 皮 可 出 現(xiàn) 裂 縫 。 ５ ．２ 　 雙 抗 體 夾 心 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 測 定 利 用 雙 抗 體 夾 心 酶 聯(lián) 免 疫

12、 吸 附 測 定 法 對(duì) 樣 品 進(jìn) 行 初 篩 （見 附 錄 Ｂ ），若 檢 測 結(jié) 果 為 陽 性 ，需 進(jìn) 行 病 原 １ 犛犖 ／犜 １３５ ．５ — ２０７ 菌的分離培養(yǎng)及 ５４． ５ ．３ 　 病原菌的分離培養(yǎng) ５ ．３ ．１ 　 培養(yǎng)基的制備 方法測定 。 營養(yǎng)肉湯酵母膏培養(yǎng)基 （ＮＢＹ ）： 牛肉汁 ８０． ｇ ，酵母膏 ２０． ｇ ，磷酸氫二鉀 （Ｋ ２ ＨＰＯ ４ ）２０． ｇ ，磷酸二 氫鉀 （ＫＨ ２ ＰＯ ４ ）０５． （Ｍ ｇＳＯ ４ ）

13、溶液 。 ｇ ，葡萄糖 ２５． ｇ ，瓊脂 １５０． ｇ ，水 １Ｌ ，滅菌后加 １ｍＬ 過濾滅菌的 １ｍｌｏ ／ Ｌ 硫酸鎂 ５ ．３ ．２ 　 塊莖中病原菌的分離培養(yǎng) 馬鈴薯塊莖洗凈后用 ７５％ 乙醇表面消毒 ５ｎｍｉ  ，從帶病薯塊的維管束挑取少量菌膿在 ＮＢＹ 培養(yǎng)基 上劃線或從帶病塊莖的維管束圈切取少量病組織 ，在滅菌水中搗碎制成懸浮液 ，用接菌環(huán)蘸菌懸液劃 線 ，經(jīng)兩次純化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基斜面 。 ５ ．４ 　 犘犆犚 凝膠電泳檢測 見附錄 Ｃ 。 ６ 　 結(jié)果判定 若酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果為陽性 ，可初步判定為檢出

14、馬鈴薯環(huán)腐病菌 ，需利用 ５４． 方法進(jìn)一步檢測 。 在 ５４． 環(huán)腐病菌 。 檢測中 ，若 ＰＣＲ 凝膠電泳檢測結(jié)果為陽性 ，而且擴(kuò)增片段大小與描述相符可判定為馬鈴薯 ７ 　 樣品保存與復(fù)核 ７ ．１ 　 樣品保存與處理 樣品經(jīng)登記和經(jīng)手人簽字后妥善保存 。 對(duì)檢出馬鈴薯環(huán)腐病菌的樣品應(yīng)保存于 ４℃ 冰箱中 ，以備 復(fù)核 。 該類樣品保存期滿后應(yīng)經(jīng)高壓滅菌后方可處理 。 ７ ．２ 　 菌株保存與處理 從檢測樣品中分離并鑒定為馬鈴薯環(huán)腐病菌的菌株 ，應(yīng)妥善保存 。 將菌株接種于 ＮＢＹ 培養(yǎng)基斜 面上 ，２８℃ 培養(yǎng) ４８ｈ ，然后 ４

15、℃ 冰箱保存 ，或液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期 ，加入 ２０％ 滅菌甘油并混勻 ，－８０℃ 長期保存或用安瓿管冷凍干燥長期保存 。 對(duì)不需要長期保存的菌株應(yīng)及時(shí)高壓滅菌處理 。 ７ ．３ 　 結(jié)果記錄與資料保存 完整的實(shí)驗(yàn)記錄包括 ：樣品的來源 、種類 、時(shí)間 ，實(shí)驗(yàn)的時(shí)間 、地點(diǎn) 、方法和結(jié)果等 ，并要有實(shí)驗(yàn)人員 和審核人員簽字 。 若酶聯(lián)免疫方法需有酶聯(lián)反應(yīng)的原始數(shù)據(jù) ，ＰＣＲ 凝膠電泳檢測需有電泳結(jié)果照片 。 ７ ．４ 　 復(fù)核 由國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局指定的單位或人員負(fù)責(zé) ，主要考察實(shí)驗(yàn)記錄 、照片等資料的完整性和 真實(shí)性 ，必要時(shí)進(jìn)行復(fù)核實(shí)驗(yàn) 。

16、 ２ 犛 犖 ／犜 １１３５ ．５ — ２００７ 附 　 錄 　 犃 （資 料 性 附 錄 ） 寄 主 及 世 界 分 布 犃 ．１ 　 寄 主 范 圍 自 然 寄 主 只 有 馬 鈴 薯 （犛狅犾犪狀狌 犿 狋狌犫犲狉狅狊狌 犿 ）， 接 種 寄 主 有 番 茄 （犔 狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀 犲狊犮狌犾犲狀狋狌 犿 ）、 茄 子 （犛狅犾犪狀狌 犿 犿 犲犾狅狀犵犲狉犪 ）等 。 犃 ．２ 　 分 布

17、 地 區(qū) 阿 富 汗 、日 本 、柬 埔 寨 、朝 鮮 、黎 巴 嫩 、尼 泊 爾 、土 耳 其 、中 國 、中 國 臺(tái) 灣 、巴 基 斯 坦 、越 南 、俄 羅 斯 、 捷 克 、斯 洛 伐 克 、丹 麥 、芬 蘭 、挪 威 、波 蘭 、瑞 典 、加 拿 大 、美 國 、哥 斯 達(dá) 黎 加 、巴 拿 馬 、秘 魯 、委 內(nèi) 瑞 拉 、德 國 、 希 臘 、前 南 斯 拉 夫 、葡 萄 牙 、奧 地 利 、哥 倫 比 亞

18、 、法 國 、墨 西 哥 、羅 馬 尼 亞 、比 利 時(shí) 。 附 　 錄 　 犅 （規(guī) 范 性 附 錄 ） 雙 抗 體 夾 心 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 測 定 犅 ．１ 　 試 材 犅 ．１ ．１ 　 酶 聯(lián) 板 的 要 求 使 用 質(zhì) 量 有 保 證 廠 商 生 產(chǎn) 的 酶 聯(lián) 板 。 犅 ．１ ．２ 　 包 被 抗 體 特 異 性 的 馬 鈴 薯 環(huán) 腐 病 菌 抗 體 。 犅 ．１ ．３ 　 酶 標(biāo) 抗

19、體 堿 性 磷 酸 酯 酶 標(biāo) 記 的 馬 鈴 薯 環(huán) 腐 病 菌 抗 體 。 犅 ．１ ．４ 　 底 物 溶 液 對(duì) 硝 基 苯 磷 酸 二 鈉 （ρ Ｎ Ｐ Ｐ ）１００ ｍ ｇ 溶 解 于 底 物 緩 沖 液 １００ ｍ Ｌ 中 ，現(xiàn) 配 現(xiàn) 用 。 犅 ．１ ．５ 　 樣 品 抽 提 緩 沖 液 溶 于 １ Ｌ 　 １ Ｐ Ｂ Ｓ Ｔ ： 亞 硫 酸 鈉 （Ｎ ａ ２ Ｓ Ｏ ３ ）　 　 　 　

20、 　 　 　 　 　 １ ．３ ｇ Ｐ Ｖ Ｐ （Ｍ Ｗ ２４ ０００ ～ ４０ ０００ ） ２０ ．０ ｇ 疊 氮 化 鈉 （Ｎ ａ Ｎ ３ ） ０ ．２ ｇ 吐 溫 ２０ 　 （ｔ ｗ ｅｅｎ２０ ） ２０ ｍ Ｌ 調(diào) ｐ Ｈ 值 至 ７ ．４ ，４ ℃ 冰 箱 保 存 。 犅 ．１ ．６ 　 包 被 緩 沖 液 碳 酸 鈉 （Ｎ ａ ２ Ｃ Ｏ ３ ） １ ．５９ ｇ 碳 酸 氫 鈉 （Ｎ ａ Ｈ Ｃ Ｏ ３

21、 ） ２ ．９３ ｇ 疊 氮 化 鈉 （Ｎ ａ Ｎ ３ ） ０ ．２ ｇ 溶 于 蒸 餾 水 ，調(diào) ｐ Ｈ 值 至 ９ ．６ ，蒸 餾 水 定 容 至 １ ０００ ｍ Ｌ ，４ ℃ 冰 箱 保 存 。 犅 ．１ ．７ 　 犘 犅犛犜 緩 沖 液 （洗 滌 緩 沖 液 ） 溶 于 １ Ｌ 蒸 餾 水 ３ 犛犖 ／犜 １３５ ．５ — ２０７ 氯化鈉 （ＮａｌＣ ） ８０． ｇ 磷酸氫二鈉 （Ｎａ ２

22、 ＨＰＯ ４ ） １５． ｇ 磷酸二氫鉀 （ＫＨ ２ ＰＯ ４ ） ０２． ｇ 氯化鉀 （ＫｌＣ ） ０２． ｇ 吐溫 ２０ （Ｔ２０ｗｅｎｅ ） ０５．ｍＬ 調(diào) ｐ Ｈ 值至 ７４． 犅 ．１ ．８ 　 酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液 ，４℃ 冰箱保存 。 溶于 １Ｌ 　 １ＰＢＳＴ ： ＢＳＡ （牛血清白蛋白 ）或脫脂奶粉 ２０． ｇ ＰＶＰ （ＭＷ２４０ ～ ４００ ） ２０． ｇ 疊氮化鈉 （ＮａＮ ３ ） ０２． ｇ 調(diào) ｐ

23、 Ｈ 值至 ７４． ，４℃ 冰箱保存 。 犅 ．１ ．９ 　 底物 （ρ 犖犘犘 ）緩沖液 溶于 ８０ ｍＬ 蒸餾水 ： 氯化鎂 （Ｍ ｇ ｌＣ ２ ） ０１． ｇ 疊氮化鈉 （ＮａＮ ３ ） ０２． ｇ 二乙醇胺 ９７ ｍＬ 用 ｐ Ｈ 值調(diào)至 ９８． ，蒸餾水定容至 １Ｌ ，４℃ 冰箱保存 。 犅 ．２ 　 程序 犅 ．２ ．１ 　 包被抗體 用包被緩沖液將抗體按說明稀釋 ，加入酶聯(lián)板孔中 ，１０ μ Ｌ ／ 孔 ，加蓋 ，３７℃ 孵育 ２ｈ ，清 空 孔

24、中 溶 液 ，ＰＢＳＴ 洗滌 ４ 次 ，每次 ３ｎｍｉ 。 犅 ．２ ．２ 　 樣品制備 待測樣品按 １∶１０ （重量 ∶ 體積 ，犠 ／犞 ）加入抽提緩沖液 ，用研缽研磨成漿 ，２０ 犵 離心 １０ ｎｍｉ ，上清 液即為制備好的檢測樣品 。 對(duì)于塊莖可以在加有適量抽提緩沖液的厚塑料袋中拍碎 ，取上清液 。 對(duì)陰 性對(duì)照 、陽性對(duì)照作相應(yīng)的處理或按照說明書進(jìn)行 。 犅 ．２ ．３ 　 加樣 加入制備好的檢測樣品 、陰性對(duì)照 、陽性對(duì)照 ，１０ μ Ｌ ／ 孔 ，加蓋 ，３７℃ 孵育 ２ｈ 或 ４℃ 冰箱孵育過夜 ， ＰＢＳＴ 洗

25、滌 ４ 次 ，每次 ３ｎｍｉ 犅 ．２ ．４ 　 加酶標(biāo)抗體 。 每個(gè)樣品重復(fù) ２ 次 。 根據(jù)說明書用酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液將酶標(biāo)抗體稀釋至工作濃度 ，加入到酶聯(lián)板中 ，１０ μ Ｌ ／ 孔 ，加 蓋 ，３７℃ 孵育 ２ｈ ，ＰＢＳＴ 洗滌 ４ 次 ，每次 ３ｎｍｉ 。 犅 ．２ ．５ 　 加底物 將底物 ρ ＮＰＰ 加入到底物緩沖液中 ，終濃度為 １ ｍ ｇ／ ｍＬ （現(xiàn)配現(xiàn)用 ）， 按每孔加入 １０ μ Ｌ ，室溫避光 孵育 ３０ｎｍｉ 。 犅 ．２ ．６ 　 讀數(shù)

26、３０ｎｍｉ  后用酶標(biāo)儀在 ４０５ｎｍ 處讀 犗犇 值 。 犅 ．３ 　 結(jié)果判斷 犅 ．３ ．１ 　 對(duì)照孔的 犗犇 ４０５ 值 （緩沖液孔 、陰性對(duì)照及陽性對(duì)照孔 ）， 應(yīng)該在質(zhì)量控制范圍內(nèi) ，即 ： 緩沖液孔和陰性對(duì)照孔的 犗犇 ４０５ 值均小于 ０１５． ４ ，當(dāng)陰性對(duì)照孔的 犗犇 ４０５ 值小于 ０５． 時(shí) ，按 ０５． 計(jì) 犛 犖 ／犜 １１３５ ．５ — ２００７ 算 ；陽 性 對(duì) 照 犗 犇 ４ ０ ５ 值 ／ 陰 性 對(duì) 照 犗 犇

27、４ ０ ５ 值 大 于 ５ ～ １０ ；重 復(fù) 性 好 。 犅 ．３ ．２ 　 在 滿 足 了 Ｂ ．３ ．１ 質(zhì) 量 要 求 后 ，結(jié) 果 作 如 下 判 斷 ： 樣 品 犗 犇 ４ ０ ５ 值 ／ 陰 性 對(duì) 照 犗 犇 ４ ０ ５ 值 明 顯 大 于 ２ ，判 為 陽 性 ； 樣 品 犗 犇 ４ ０ ５ 值 ／ 陰 性 對(duì) 照 犗 犇 ４ ０ ５ 值 在 閾 值 附 近 ，判 為 可 疑 樣 品 ，需

28、重 新 做 一 次 ，或 用 其 他 方 法 加 以 驗(yàn) 證 ； 樣 品 犗 犇 ４ ０ ５ 值 ／ 陰 性 對(duì) 照 犗 犇 ４ ０ ５ 值 明 顯 小 于 ２ ，判 為 陰 性 。 若 采 用 商 品 化 試 劑 盒 ，按 照 試 劑 盒 說 明 操 作 并 判 定 結(jié) 果 。 附 　 錄 　 犆 （規(guī) 范 性 附 錄 ） 犘 犆 犚 凝 膠 電 泳 檢 測 犆 ．１ 　 病 原 細(xì) 菌 犇 犖 犃

29、 的 提 取 犆 ．１ ．１ 　 將 供 試 菌 株 在 斜 面 培 養(yǎng) 基 上 ２８ ℃ 培 養(yǎng) ４８ ｈ 。 犆 ．１ ．２ 　 每 一 試 管 中 加 入 ０ ．１ ｍ ｏｌ／ Ｌ 磷 酸 鈉 緩 沖 液 ５ ｍ Ｌ 洗 下 菌 苔 。 犆 ．１ ．３ 　 將 細(xì) 菌 懸 浮 液 轉(zhuǎn) 移 至 一 干 凈 的 １０ ｍ Ｌ 離 心 管 中 ，１０ ０００ 犵 離 心 １０ ｍ ｉｎ ，棄 上 清 液 ，加

30、入 Ｔ Ｅ 緩 沖 液 ５ ｍ Ｌ 、１０ ％ Ｓ Ｄ Ｓ 溶 液 ３００ μ Ｌ ，２０ ｍ ｇ／ ｍ Ｌ 蛋 白 酶 Ｋ ３０ μ Ｌ ，混 勻 ，３７ ℃ 水 浴 孵 育 １ ｈ 。 犆 ．１ ．４ 　 加 入 等 體 積 的 三 氯 甲 烷 ／ 異 戊 醇 （２４ ∶ １ ）混 勻 ，１２ ０００ 犵 離 心 １０ ｍ ｉｎ ，取 上 清 液 。 犆 ．１ ．５ 　 加 入 等 體 積 三 氯 甲 烷 ／

31、 異 戊 醇 （２４ ∶ １ ）混 勻 ，１２ ０００ 犵 離 心 １０ ｍ ｉｎ 。 犆 ．１ ．６ 　 將 上 清 液 移 至 一 新 管 ，加 入 ０ ．６ 倍 體 積 的 異 丙 醇 ，混 勻 ，１２ ０００ 犵 離 心 １０ ｍ ｉｎ ，棄 上 清 液 ；７０ ％ 乙 醇 洗 滌 沉 淀 ，室 溫 干 燥 后 ，將 Ｄ Ｎ Ａ 溶 解 在 １００ μ Ｌ 滅 菌 雙 蒸 水 中 。 注 ：病 原 菌 Ｄ Ｎ Ａ

32、 提 取 也 可 省 略 ，可 直 接 用 培 養(yǎng) 的 菌 株 稀 釋 懸 濁 液 作 為 模 板 進(jìn) 行 Ｐ Ｃ Ｒ 反 應(yīng) 。 犆 ．２ 　 引 物 序 列 正 向 引 物 ：５′ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｇ Ａ Ｃ Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ３′ ，反 向 引 物 ：５′ Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ３′ 犆 ．３ 　 犘 犆 犚 反 應(yīng) 體

33、 系 及 參 數(shù) 犆 ．３ ．１ 　 犘 犆 犚 反 應(yīng) 體 系 見 表 Ｃ ．１ 。  表 犆 ．１ 　 犘 犆 犚 反 應(yīng) 體 系 試 　 劑 　 名 　 稱 終 　 濃 　 度 １ ０ Ｐ Ｃ Ｒ 反 應(yīng) 緩 沖 液 １ 氯 化 鎂 （Ｍ ｇ Ｃｌ２ ） ２ ．５ ｍ ｍ ｏｌ／ Ｌ ｄ Ｎ Ｔ Ｐ ｓ ０ ．２ ｍ ｍ ｏｌ／ Ｌ 正 向 引 物 ０ ．２ μ ｍ ｏｌ／ Ｌ 反 向

34、引 物 ０ ．２ μ ｍ ｏｌ／ Ｌ 犜 犪狇 Ｄ Ｎ Ａ 聚 合 酶 ２ ．５ Ｕ Ｄ Ｎ Ａ 模 板 １ μ Ｌ 補(bǔ) Ｈ ２ Ｏ 至 ５ ０ μ Ｌ ５ 犛犖 ／犜 １３５ ．５ — ２０７ 犆 ．３ ．２ 　 陰性對(duì)照 、陽性對(duì)照和空白對(duì)照的設(shè)置 — 陰性對(duì)照 ：以待測健康的馬鈴薯葉片 ＤＮＡ 為模板 ； — 陽性對(duì)照 ：采用馬鈴薯環(huán)腐病菌或含有待測基因序列的質(zhì)粒 ； — 空白對(duì)照 ：設(shè)兩個(gè) ，一是提取 ＤＮＡ 時(shí)設(shè)置的提取空白對(duì)照 （以 Ｈ

35、 ２ Ｏ 代替樣品 ）， 二是 ＰＣＲ 反 應(yīng)的空白對(duì)照 （以水代替 ＤＮＡ 模板 ）。 犆 ．３ ．３ 　 犘犆犚 的反應(yīng)參數(shù) ： ９５℃ ／３ｎｍｉ ；９５℃ ／３０ｓ ，６０℃ ／３０ｓ ，７２℃ ／４０ｓ ，３５ 個(gè)循環(huán) 。 注 ：不同儀器可根據(jù)儀器要求將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整 。 犆 ．３ ．４ 　 瓊脂糖凝膠電泳 制備 ２％ 的瓊脂糖凝膠 ，按比例混勻電泳上樣緩沖液和 ＰＣＲ 擴(kuò)增產(chǎn)物 ，用 ＤＮＡ Ｍｒｋｒｅａ  作為分子 量標(biāo)記 ，進(jìn)行電泳分析 ，電泳結(jié)束后在凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴(kuò)增出預(yù)期的特異性 ＤＮ

36、Ａ 條帶 ，并拍攝記錄 。 犆 ．４ 　 結(jié)果判斷 通過觀察 ，若有 ２０５ｂ ｐ 大小的產(chǎn)物帶出現(xiàn) ，可判定為陽性 。 ６ ２００７ 犛 犖 ／犜 １１３５ ５ — 中 華 人 民 共 和 國

37、 出 入 境 檢 驗(yàn) 檢 疫 行 　 業(yè) 　 標(biāo) 　 準(zhǔn) 馬 鈴 薯 環(huán) 腐 病 菌 檢 疫 鑒 定 方 法 Ｓ Ｎ ／ Ｔ １ １ ３ ５ ．５ — ２ ０ ０ ７  中 國 標(biāo) 準(zhǔn) 出 版 社 出 版 北 京 復(fù) 興 門 外 三 里 河 北 街 １ ６ 號(hào) 郵 政 編 碼 ：１ ０ ０ ０ ４ ５ 網(wǎng) 址 ｗ ｗ ｗ ．ｓｐｃ ．ｎｅｔ ．ｃｎ 電 話 ：６ ８ ５ ２ ３ ９ ４ ６ 　 ６ ８ ５ １

38、７ ５ ４ ８ 中 國 標(biāo) 準(zhǔn) 出 版 社 秦 皇 島 印 刷 廠 印 刷  開 本 ８ ８ ０ １ ２ ３ ０ １ ／１ ６ 　 印 張 ０ ．７ ５ 　 字 數(shù) １ ２ 千 字 ２ ０ ０ ８ 年 ３ 月 第 一 版 　 ２ ０ ０ ８ 年 ３ 月 第 一 次 印 刷 印 數(shù) １ — ２ ０ ０ ０  書 號(hào) ： １ ５ ５ ０ ６ ６ ２１ ８ ４ ６ ６ 　 定 價(jià) ８ ．００ 元