高中生物 第二章 克隆技術 第1節(jié) 什么是克隆 第2節(jié) 植物的克隆教案 浙科版選修3
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1、 第一節(jié) 什么是克隆 第二節(jié) 植物的克隆 課 標 解 讀 重 點 難 點 1.比較有性繁殖與無性繁殖,簡述克隆的含義。 2.通過舉例,概述克隆的基本條件。 3.結合單細胞培養(yǎng)成完整植株的示意圖,理解細胞的全能性及簡述植物組織培養(yǎng)的程序。 4.聯(lián)系植物克隆的實例,闡明植物克隆的概念、成就及應用前景。 1.克隆的定義及其基本條件。(重點) 2.植物細胞的全能性的含義。(重點) 3.植物組織培養(yǎng)。(重難點) 無性繁殖與克隆 1.克隆就是無性繁殖,即只要不通過兩個分子、兩個細胞或兩個個體的結合,只由一個模板分子、母細胞或母體直接形成新一代分子、細胞或個體。 2.在分子
2、水平上,基因克隆是指某種目的基因的復制、分離過程。 3.在細胞水平上,細胞克隆技術應用在雜交瘤制備單克隆抗體的操作中。 4.在個體水平上,植物可由母體的特定部位或結構產生新個體,而動物的克隆較復雜,經歷了由胚胎細胞克隆到體細胞克隆的發(fā)展過程。 5.克隆的基本條件:具有完整基因組的細胞核的活細胞;能有效調控細胞核發(fā)育的細胞質物質;完成胚胎發(fā)育的必要的環(huán)境條件。 1.克隆技術的發(fā)展經歷了哪幾個階段?請嘗試舉例加以說明。 【提示】 微生物克隆,如菌落的形成;遺傳工程克隆,如DNA克隆或基因克隆;個體水平上克隆,如克隆動物。 植物細胞的全能性 1.基本含義:植物體的每一個生活細胞
3、,都具有發(fā)育成完整植株的潛能。 2.全能性的原因:每個細胞都含有本物種所特有的全套遺傳物質。 3.特點:不同植物或同種植物不同基因型個體間,細胞全能性的表達程度大不相同。 2.有人說只要找到秋海棠的一個細胞,就能再生出秋海棠,這依據的生物學原理是什么? 【提示】 能讓一個細胞發(fā)育成一個個體,依據的是細胞的全能性。 植物組織培養(yǎng) 1.原理:植物細胞具有全能性。 2.過程:離體的植物器官、組織或細胞愈傷組織根、 芽―→植物體。 3.植物組織培養(yǎng)的一般程序 (1)配制含有適當營養(yǎng)物質和植物生長調節(jié)劑并含有瓊脂的培養(yǎng)基,進行滅菌。 (2)從消毒的根、莖或葉上切取組織塊。
4、(3)將組織塊放在固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),獲得愈傷組織。 (4)以適當配比的營養(yǎng)物質和生長調節(jié)劑誘導愈傷組織,直到再生出新植株。 4.愈傷組織:是指在植物組織創(chuàng)傷表面形成的一種相對沒有分化的、高度液泡化的、活的薄壁細胞團。 5.細胞培養(yǎng):指處于適當液體培養(yǎng)條件的單個植物細胞,經過培養(yǎng)基中成分的誘導,可發(fā)生類似與受精卵發(fā)育成胚的過程,即從單細胞依次到細胞團、球形胚、心形胚和胚狀體,最后再生出完整的植株。 6.培養(yǎng)物的胚胎發(fā)生和器官形成能力下降的可能原因 (1)染色體畸變、細胞核變異或非整倍體產生等,而且不可逆。 (2)細胞或組織中激素平衡被打破,或細胞對外源生長物質的敏感性發(fā)生改變。
5、 (3)隨著時間推移,由于其他各種原因產生了缺乏成胚性的細胞系。 7.植物細胞培養(yǎng)和器官培養(yǎng)的意義 (1)可以在實驗室環(huán)境進行植物受精過程和植物自受精卵進行的胚胎發(fā)育過程,以及調節(jié)控制這些過程的環(huán)境因素、遺傳基礎和分子及生理生化機理研究。 (2)可以進行遺傳工程的操作,完成與植物生長發(fā)育有關的重要基因或影響因素的研究。 (3)可以通過實驗手段培育植物新品種。 3. 圖中①、②過程的選用的培養(yǎng)基相同嗎? 【提示】 不相同。 原生質體培養(yǎng)與植物細胞工程 1.植物原生質體的獲得方法:在0.5~0.6 mol/L的甘露醇溶液環(huán)境(較高滲透壓)下用纖維素酶和果膠酶混合液處理根尖
6、、葉片、愈傷組織或懸浮培養(yǎng)細胞,將細胞壁消化除去來獲得。 2.植物細胞工程的概念和操作過程是:培養(yǎng)植物細胞(包括原生質體),借助基因工程方法,將外源遺傳物質(DNA)導入受體細胞(包括原生質體受體)中,或通過細胞融合、顯微注射等將不同來源的遺傳物質重新組合,再通過對這些轉基因細胞或重組細胞進行培養(yǎng),獲得具有特定性狀的新植株。 4.嘗試寫出植物的全能性要表現(xiàn)出來需要哪些條件? 【提示】 植物細胞表現(xiàn)全能性的條件為:(1)脫離母體;(2)有一定的營養(yǎng)激素;(3)無菌;(4)適宜的溫度等條件。 1.通過胚胎細胞克隆出的山羊屬于個體水平上的克隆。(√) 2.生物體的體細胞的細胞核含有
7、此生物體全部的遺傳信息。() 【提示】 細胞質中的線粒體、葉綠體中含有少量的DNA即也含有遺傳信息。 3.胚胎細胞克隆不屬于嚴格意義上的動物克隆。(√) 4.經單細胞特殊培養(yǎng)形成的愈傷組織為一種高度分化的活的薄壁細胞團組成的新生組織。() 【提示】 愈傷組織為一種相對沒分化的薄壁細胞。 5.適當?shù)募に睾图毎至阉嘏浔瓤梢哉T導根的分化。() 【提示】 可誘導芽的分化,而不是根的分化。 6.在培養(yǎng)基上加入不同濃度的NaCl,可使培養(yǎng)的細胞發(fā)生染色體變異,從而篩選出抗鹽或抗病變異體。() 【提示】 發(fā)生了基因突變。 對三個水平上的克隆的理解 【問題導思】 ①三個水平上的
8、克隆分別是什么? ②細胞分裂的克隆、胚胎細胞克隆兔分別屬于哪種克??? ③克隆需要哪三個基本條件? 1.分子水平 克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含義是將某一特定DNA片斷通過重組DNA技術插入到一個載體(如質粒和病毒等)中,然后在宿主細胞中進行自我復制所得到的大量完全相同的該DNA片斷的“群體”。 2.細胞水平 克隆的實質是由一個單一的共同祖先細胞分裂所形成的一個細胞群體。其中每個細胞的基因都相同。比如,使一個細胞在體外的培養(yǎng)液中分裂若干代所形成的一個遺傳背景完全相同的細胞集體即為一個細胞克隆。又如,在脊椎動物體內,當有外源物(如細菌或病毒)侵入時,會通過免疫反應產生特異的識
9、別抗體。產生某一特定抗體的所有漿細胞都是由一個B細胞分裂而成。這樣的一個漿細胞群體也是一個細胞克隆。細胞克隆是一種低級的生殖方式——無性繁殖,即不經過兩性結合,子代和親代具有相同的遺傳性。生物進化的層次越低,越有可能采取這種繁殖方式。 3.個體水平 克隆是指基因型完全相同的兩個或更多的個體組成的一個群體。比如,兩個同卵雙胞胎即為一個克隆。因為他(她)們來自同一個受精卵,所以遺傳背景完全一樣。 克隆的本質是無性繁殖,克隆的技術主要是植物組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)等,在這些過程中不出現(xiàn)減數(shù)分裂,只有有絲分裂和分化,因此可以保證遺傳物質的穩(wěn)定性。如出現(xiàn)變異,也應該是有絲分裂和分化中可能存在的基因突
10、變和染色體畸變,而不考慮基因重組。 下列有關克隆的敘述,不正確的一項是( ) A.利用PCR技術擴增人的胰島素基因 B.將人的胰島素基因整合到細菌的DNA中 C.嫁接在果樹生產上用以保持品種優(yōu)良特性 D.細胞克隆技術在利用雜交瘤細胞制備單克隆抗體的操作中得到充分運用 【審題導析】 理解克隆的概念:(1)不是兩個分子、兩個細胞或兩個個體的結合。 (2)最后一定形成新一代分子、細胞或個體。 【精講精析】 A項屬于分子水平上的克隆;B項利用的原理是基因重組,屬于基因工程范疇;C項嫁接屬于個體水平上的克隆,能保持親本的優(yōu)良特性。 【答案】 B 下列現(xiàn)象不屬于克隆的是( )
11、 A.由一個DNA分子復制了許多一樣的子代DNA分子 B.純種白花豌豆的子代都開白花 C.綿羊“多莉”的產生過程 D.一個大腸桿菌在培養(yǎng)基上形成了一個菌落 【審題導析】 解答此題的關鍵在于掌握克隆的本質是無性繁殖即由一個模板復制出許多相同后代。 【精講精析】 A、C、D分別是分子、個體、細胞水平的克隆,B選項的豌豆自花受粉植物,白花豌豆為純合子,其后代不會發(fā)生性狀分離,所以子代全為白花,屬于有性生殖。 【答案】 B 植物組織培養(yǎng)與細胞的全能性 【問題導思】 ①為什么細胞有全能性? ②細胞全能性體現(xiàn)的條件有哪些? ③植物組織培養(yǎng)的原理過程是怎樣的? ④如何誘導愈傷組織
12、產生根或芽? 1.細胞全能性 (1)概念 生物體的細胞具有發(fā)育成完整個體的潛能,細胞的這種特性叫做細胞的全能性。 (2)生物體細胞具有全能性的原因 生物體的每一個細胞都含有該物種所特有的全套遺傳信息,都有發(fā)育成為完整個體所必需的全部基因。 (3)細胞全能性體現(xiàn)的條件 ①離體(必要條件)。 ②一定的營養(yǎng)物質(水、無機鹽、維生素和氨基酸等)。 ③激素(細胞分裂素、生長素等)。 ④適宜條件(適宜溫度、光、pH等)。 (4)細胞全能性大小的比較 ①比較大小的依據:細胞全能性體現(xiàn)所要求條件的難易程度。 ②一般情況下細胞全能性大小的比較順序。 植物體細胞>動物體細胞(核有全能性
13、)。 受精卵細胞>生殖細胞>體細胞。 2.植物組織培養(yǎng)技術 (1)植物組織培養(yǎng)原理 植物細胞的全能性,即具有某種植物全部遺傳信息的任何一個細胞,都具有發(fā)育成完整植株的潛能。 (2)植物組織培養(yǎng)的過程(如圖) 離體的植物器官、組織或細胞愈傷組織根、芽―→植物體。 (3)脫分化、再分化的比較 ①細胞脫分化:已分化的細胞,經過誘導后,失去其特有的結構和功能而轉化成未分化細胞的過程。 ②生物體細胞不能表達全能性的原因:植物體細胞內的基因選擇性表達。 ③脫分化和再分化的比較 比較內容 脫分化 再分化 過程 細胞→愈傷組織 愈傷組織→幼苗 形成體特點 排列疏松、高度
14、液泡化的薄壁細胞團 有根、芽 需要條件 ①離體 ②適宜的營養(yǎng) ③生長素和細胞分裂素 ①離體 ②適宜的營養(yǎng) ③生長素和細胞分裂素 ④光照 ④影響脫分化、再分化的因素 影響脫分化、再分化的重要因素為植物激素。當細胞分裂素與生長素共同使用時,能強烈的促進愈傷組織的形成,兩者不同濃度的配比在再分化過程中,分別對誘導根或芽的產生起關鍵作用。當細胞分裂素與生長素的濃度比高時,有利于芽的產生;濃度比低時,有利于根的產生。 正確理解細胞的全能性 (1)全能性表達的標志:已分化的細胞能形成完整的個體。 (2)全能性的原理:細胞具有發(fā)育成完整個體所必需的“全套”基因而不是“全部”基
15、因,因此含染色體組的配子中有全套基因,同樣具有全能性。 有關全能性的敘述,不正確的是( ) A.受精卵在自然條件下能使后代細胞形成完整個體,因此全能性最高 B.生物體內細胞由于分化,全能性不能表達 C.卵細胞與受精卵一樣,細胞未分化,全能性很高 D.植物細胞離體培養(yǎng)在一定條件下,能表現(xiàn)出全能性 【審題導析】 解答本題的關鍵是:明確細胞的全能性大小與細胞分化及分化的程度、細胞全能性實現(xiàn)的條件的關系。 【精講精析】 本題需從以下幾方面入手分析:①受精卵是個體發(fā)育的起點,在自然條件下,通過細胞的分裂、分化形成完整的個體,所以全能性最高;②體內每一個體細胞都是通過有絲分裂形成的,都含
16、有發(fā)育成完整個體所必需的全部基因,理論上講都應該具有全能性,但由于分化,基因在不同的細胞中選擇性表達,因而體細胞并不能表現(xiàn)出全能性;③卵細胞在一定條件下,全能性表現(xiàn)比體細胞高,但與受精卵相比,細胞的分化程度較高;④分化的植物細胞具有全能性,但要表達全能性,必須在一定條件下離體培養(yǎng)。 【答案】 C 如圖所示為胡蘿卜的韌皮部細胞通過無菌操作接入試管后,在一定條件下形成試管苗的培育過程,請據圖回答下列問題。 (1)要促進細胞分裂、生長,培養(yǎng)基中應有________和________。 (2)此過程依據的原理是_______________________________________
17、__。 A和B階段主要進行的分裂方式是________,B階段除了細胞分裂外,還進行細胞________等。 (3)此過程要無菌操作,主要是指對________________進行滅菌、消毒。B階段需要光照,原因是____________________________________________ ______________________________________________________________。 (4)試管苗的根細胞沒有葉綠素,而葉的葉肉細胞具有葉綠素,這是基因____________的結果。 【思維導圖】 解答此題的思維流程如下: ↓ 需要條件
18、 ↓ 【精講精析】 (1)細胞的分裂、生長需要營養(yǎng)物質和植物激素。 (2)植物細胞的全能性保證細胞發(fā)育成一個完整的個體,細胞分裂的方式為有絲分裂,在再分化過程中,還有細胞的分化。 (3)植物組織培養(yǎng)過程中,需要無菌、無毒的條件,因此要對培養(yǎng)基和器械滅菌,對離體的組織消毒。植物細胞產生葉綠素需要光照。 (4)細胞形態(tài)、功能不同是分化的結果即基因選擇性表達的結果。 【答案】 (1)營養(yǎng)物質 激素 (2)植物細胞的全能性 有絲分裂 分化 (3)培養(yǎng)基、器械 細胞中葉綠素的合成需要光照條件 (4)選擇性表達 植物細胞工程及植物克隆的應用 【問題導思】 ①植物細胞工程的操
19、作過程如何? ②如何獲得植物原生質體? 1.植物細胞工程的概念和操作過程 培養(yǎng)植物細胞,借助基因工程方法,將外源遺傳物質導入受體細胞中,或通過細胞融合、顯微注射等將不同的遺傳物質重新組合,再通過對這些轉基因細胞或重組細胞進行培養(yǎng),獲得具有特定性狀的新植株。 2.植物克隆的應用 (1)原生質體制備及植物體細胞雜交 ①植物原生質體的獲得方法:在0.5~0.6 mol/L的甘露醇溶液環(huán)境下用纖維素酶和果膠酶混合液處理根尖、葉片、愈傷組織或懸浮培養(yǎng)細胞,將細胞壁消化除去。 ②植物體細胞雜交 (2)快速繁殖(微型繁殖) 通過組織培養(yǎng)的方式,可以快速大量的繁殖種苗。 (3)作物脫毒
20、 采用莖尖(幾乎無病毒)組織培養(yǎng)的方式來脫除植物的病毒。 (4)培育作物新品種 用植物的花藥進行離體培養(yǎng)形成單倍體,人工誘導染色體加倍后篩選出需要的新品種;利用組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的突變體,培育新的品種。 (5)細胞產物的工業(yè)化生產 從人工培養(yǎng)的愈傷組織中提取細胞的某種成分,如紫草素、香料等。 請回答問題。 (1)植物微型繁殖技術屬于植物組織培養(yǎng)的范疇。該技術可以保持品種的________,繁殖種苗的速度__________。離體的葉肉細胞在適宜的條件下培養(yǎng),最終能夠形成完整的植株,說明該葉肉細胞具有該植物的全部________。 (2)把試管苗轉接到新的培養(yǎng)基上時,需要在超凈
21、工作臺上進行,其原因是避免________的污染。 (3)微型繁殖過程中,適宜濃度的生長素單獨使用可誘導試管苗________,而與________配比適宜時可促進芽的增殖。若要抑制試管苗的生長,促使愈傷組織產生和生長,需要使用的生長調節(jié)劑是_________________________(填“脫落酸”或“2,4D”)。 (4)將某植物試管苗培養(yǎng)在含不同濃度蔗糖的培養(yǎng)基上一段時間后,單株鮮重和光合作用強度的變化如圖。據圖分析,隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的增加,光合作用強度的變化趨勢是________,單株鮮重的變化趨勢是________。據圖判斷,培養(yǎng)基中不含蔗糖時,試管苗光合作用產生的有
22、機物的量________(填“能”或“不能”)滿足自身最佳生長的需要。 (5)據圖推測,若要在誘導試管苗生根的過程中提高其光合作用能力,應________(填“降低”或“增加”)培養(yǎng)基中蔗糖濃度,以便提高試管苗的自養(yǎng)能力。 【審題導析】 解答此題應識讀坐標曲線圖中的有關量的變化關系,即蔗糖濃度為0時,盡管光合作用強度最大,但植物積累的有機物較少,不能滿足植物自身的需要。 【精講精析】 (1)植物組織培養(yǎng)屬于無性繁殖,后代能夠保持親本的遺傳特性。植物微型繁殖技術能夠實現(xiàn)快速繁殖。植物組織培養(yǎng)的原理是植物細胞具有全能性,即已經分化的細胞,仍然具有發(fā)育成完整個體的潛能。(2)植物組織培養(yǎng)接種和
23、試管苗轉接過程中都需要無菌操作,以避免微生物(雜菌)污染。(3)微型繁殖培養(yǎng)基中使用的生長素與細胞分裂素比例不同,可以分別誘導根、芽的形成。使用高濃度的植物生長素類似物(如2,4D)可以抑制試管苗的生長。 (4)、(5)分析圖中曲線可知:光合作用強度隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的增大而下降,但單株鮮重的變化趨勢是先增加后下降。培養(yǎng)基中不含蔗糖時,光合作用強度最大,但由于該時期光合作用產生的有機物積累量較少,不能滿足自身最佳生長的需要。在蔗糖濃度為1%左右時,單株鮮重達到最大,此時有機物的量滿足自身最佳生長需要。 【答案】 (1)遺傳特性 快 遺傳信息 (2)微生物 (3)生根 細胞分裂素 2,4D
24、 (4)逐漸減小 先增加后下降 不能 (5)降低 本 課 知 識 小 結 網 絡 構 建 結 論 語 句 1.克隆是指只由一個模板分子、母細胞或母體直接形成新一代分子、細胞或個體的無性繁殖技術。 2.克隆分基因克隆、細胞克隆、個體克隆。 3.植物克隆的原理是植物細胞的全能性。 4.植物組織培養(yǎng)必須經過脫分化和再分化。 5.用纖維素酶和果膠酶可脫去植物細胞壁。 1.利用植物的莖尖、葉片、莖段等,在無菌的條件下,培養(yǎng)在玻璃器皿中人工配制的培養(yǎng)基上,使它發(fā)育成完整的植株。這種技術可以用來培育新品種,可以在較短時間內大量繁殖植物,還可以防止植物病毒的危害。下列關于這種培養(yǎng)技術
25、敘述正確的是( ) ①這種技術利用了植物細胞的全能性 ②這種技術叫做植物組織培養(yǎng),可以克隆生物體 ③這種技術屬于克隆的應用領域之一 ④這種技術屬于無性繁殖的方式 A.① B.①② C.①②③ D.①②③④ 【解析】 利用植物的莖尖、葉片、莖段等使它發(fā)育成完整的植株,是營養(yǎng)繁殖也是無性繁殖方式,此種技術叫植物組織培養(yǎng),利用的是植物細胞的全能性,屬于個體水平克隆的應用。 【答案】 D 2.下列屬于克隆的是 ( ) A.將雞的某個DNA片段整合到小鼠的DNA分子中 B.將抗藥性的某基因導入草履蟲的細胞內 C.將鼠的骨髓瘤細胞與經過免疫的B淋巴細胞融合成雜交瘤細
26、胞 D.將某腫瘤細胞在體外培養(yǎng)繁殖成一個細胞系 【解析】 A項敘述的是基因工程中DNA(基因)的重組過程,此過程中沒有涉及DNA分子的復制;B項是將目的基因導入受體細胞的過程;C項中描述的是細胞融合的過程;D項屬于細胞水平上的克隆。 【答案】 D 3.某科技活動小組將二倍體番茄植株的花粉按下圖所示的程序進行實驗。據圖所示對該實驗的分析正確的是 ( ) A.該實驗不能說明植物生殖細胞具有全能性 B.植株B的所有細胞中都含有兩個染色體組 C.植株A細胞內沒有等位基因 D.由花粉培養(yǎng)到植株B的過程都必須在無菌條件下進行 【解析】 由花粉培養(yǎng)成植株說明生殖細胞具有全能性。秋水仙
27、素處理的是植株A的地上部分,根細胞未處理,得到的植株B的根細胞仍含有一個染色體組。植株A是單倍體,細胞內沒有等位基因。由花粉培養(yǎng)到植株A的過程必須在無菌條件下進行,由植株A到植株B可在田地中進行,不必無菌操作。 【答案】 C 4.下列關于基因及其克隆的說法不正確的是( ) A.不同生物的基因不同 B.基因存在于DNA分子中 C.基因能控制生物的性狀 D.克隆產生的基因與原來的基因一定相同 【解析】 基因是有遺傳效應的DNA片段,能控制一定的生物性狀,基因存在于DNA分子上,不同生物基因的種類、數(shù)目不同。由于基因突變的原因,所以克隆產生的基因與原來的基因不一定相同。 【答案】
28、D 5.對于植物細胞工程的操作過程,下列表示方法不正確的是( ) A.植物細胞原生質體―→新植株 外源基因 B. C. D. 【解析】 現(xiàn)在還不具備將動植物細胞融合并發(fā)育成一個新個體的技術。 【答案】 D 6.美國科學家將分離得到的成熟的胡蘿卜根的韌皮部細胞進行培養(yǎng),由單個細胞發(fā)育成了完整的新植株。過程圖解如下,回答與之有關的問題。 (1)通過B過程產生的愈傷組織的細胞與根的韌皮部細胞在染色體的數(shù)目上是否相同?________;染色體上所含的遺傳物質是否相同?________;細胞的形態(tài)結構是否相同?________。 (2)培養(yǎng)過程中,在
29、培養(yǎng)基上需加入蔗糖,培養(yǎng)時需要照光,那么,培養(yǎng)的植物到底是自養(yǎng)型還是異養(yǎng)型?光的作用是什么?對于上述疑問,某研究性學習小組進行了下列實驗:一組在培養(yǎng)基中加入30%的蔗糖,另一組不加蔗糖,接種后,每組再分成兩個小組,分別在光下和暗中培養(yǎng)。1個月后,觀察植物體生長、分化情況,結果為下表: 培養(yǎng)條件 加蔗糖 不加蔗糖 光 正常生長,分化 不生長,死亡 暗 只生長,不分化 不生長,死亡 由此,你能得出什么結論?________________________________________。 【解析】 愈傷組織的細胞是通過有絲分裂由根細胞生成的,所以二者的染色體數(shù)目、染色體上的遺
30、傳物質是相同的,但細胞的形態(tài)結構不同,這是遺傳物質選擇性表達的結果。通過對比分析四組結果的生長和分化情況,可以得到蔗糖是植物生長所必需的,光是分化所必需的。 【答案】 (1)相同 相同 不同 (2)蔗糖是植物生長、分化所必需的,光是分化所必需的 6EDBC3191F2351DD815FF33D4435F3756EDBC3191F2351DD815FF33D4435F3756EDBC3191F2351DD815FF33D4435F3756EDBC3191F2351DD815FF33D4435F3756EDBC3191F2351DD815FF33D4435F3756EDBC3191F2351DD815FF33D4435F375
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