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PI染色法測細(xì)胞周期 1 一 細(xì)胞DNA含量檢測 細(xì)胞固定后用PI Propidiumiodide碘化丙啶 染色 因為PI特異性結(jié)合于細(xì)胞DNA 熒光強(qiáng)度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系 根據(jù)這個原理 可測出細(xì)胞的DNA含量 用于細(xì)胞周期 細(xì)胞倍體以及凋亡的檢測 2 3 單參數(shù)直方圖 圖中2N代表G0 G1期細(xì)胞 4N代表G2 M期細(xì)胞 兩者中間代表S期細(xì)胞 這是以2倍體和4倍體細(xì)胞為主的流式DNA圖 4 DNA細(xì)胞周期分析 細(xì)胞周期 G2 M G0 G1 s 200 400 600 800 1000 s DNA分析 DNA含量 細(xì)胞數(shù)量 5 6 2倍體 異倍體 4倍體 腫瘤組織中的各種DNA倍體 7 含量與凋亡關(guān)系 DNA亞G1峰的檢測 利用PI染色 檢測具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例 代表凋亡細(xì)胞數(shù) 凋亡過程中 細(xì)胞內(nèi)核酸酶的釋放 將DNA降解 分解成小的片段 在標(biāo)本制備中的固定處理時 細(xì)胞膜的完整性被破壞 使細(xì)胞內(nèi)降解的DNA片段從細(xì)胞內(nèi)流出 造成總體DNA含量減少 成為亞2倍體 8 9 10 2 凋亡研究 在G0 G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰 即凋亡峰 檢測調(diào)亡 可進(jìn)行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細(xì)胞的損傷機(jī)理的研究 11 12 AnnexinVAssay 13 圖AnnexinV PI雙標(biāo)記分析細(xì)胞凋亡和壞死 14 Dateacquired 14 Jan 03File 7Gy4hr 001Source dongboDIPLOID 100 00 DipG0 G1 73 12 at48 16DipG2 M 9 59 at96 33DipS 17 29 G2 G1 2 00Dip CV 6 04Apoptosis 13 66 Mean 27 48 圖FCM測試細(xì)胞周期分布和凋亡 15 根據(jù)凋亡細(xì)胞的特點(diǎn)來檢測 在形態(tài)上 早期細(xì)胞核固縮 染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)顯新月體形 核碎裂 細(xì)胞漿和細(xì)胞器密度增高 細(xì)胞體積變小 細(xì)胞膜皺折卷曲 但早期細(xì)胞膜的完整性未受到破壞凋亡細(xì)胞的FSC SSC 細(xì)胞壞死時 細(xì)胞腫脹 FSC SSC 16 正常人靜止體細(xì)胞有46條染色體 相當(dāng)于7 10 12pgDNA 細(xì)胞核 我們稱之為二倍體細(xì)胞 而正常增殖細(xì)胞則存在不同的DNA含量 在細(xì)胞周期 G0 G1 S G2 M 的各個時期 DNA含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化 在G1期 細(xì)胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成 但DNA含量仍保持二倍體 17 進(jìn)入S期后 DNA開始合成 這時細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于G1和G2期之間 當(dāng)DNA復(fù)制結(jié)束成為4倍體時 細(xì)胞進(jìn)入G2期 G2期細(xì)胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì) 直到進(jìn)入M期 因此 單純從DNA含量無法區(qū)分G2期和M期 一旦有絲分裂發(fā)生 細(xì)胞分裂成兩個子細(xì)胞 這兩個子細(xì)胞或者進(jìn)入下一個細(xì)胞周期 或者進(jìn)入靜止期 G0期 而G0期從DNA含量上同樣無法與G1期區(qū)分 因此 整個復(fù)制周期可以描述為G0 G1 S G2 M期 18 19 通過核酸染料標(biāo)記DNA 并由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析 可以得到細(xì)胞各個時期的分布狀態(tài) 計算出G0 G1 S及G2 M的百分含量 了解細(xì)胞的增殖能力 結(jié)合DNA指數(shù)分析 還可進(jìn)行凋亡 異倍體等檢測 20 G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 s DNAAnalysis DNAcontent Count NormalCellCycle 21 細(xì)胞濃度及質(zhì)量要求 單細(xì)胞和核的上機(jī)濃度應(yīng)約106 ml 濃度太低 上機(jī)時樣本的流速不得不提高 這樣就會影響檢測的CV 濃度太高 則可能導(dǎo)致染料的相對不足 最終使染色不飽和 同樣影響CV和檢測結(jié)果 制備完成后的標(biāo)本應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢查其質(zhì)量 細(xì)胞是否聚集或過多的碎片 22 染料的選擇取決于流式激光的配置 488nm的激光下應(yīng)用PI 碘化丙啶 由于PI也與RNA結(jié)合 所以分析前樣本應(yīng)用Rnase處理 重要的是染料要足夠 以保證飽和結(jié)合 PI的推薦濃度是至少20ug 106個細(xì)胞 其最佳濃度為50ug 106個細(xì)胞 23 操作步驟 取一瓶生長期的A549細(xì)胞 倒掉瓶中舊的培養(yǎng)液 加入3mlPBS 細(xì)胞生長面在下輕輕晃動細(xì)胞瓶 然后去掉液體 加入1ml胰蛋白酶消化1 5分鐘 以鏡下觀察決定 加入5mlPBS輕輕吹打細(xì)胞生長面 制成細(xì)胞懸液 將細(xì)胞懸液移至15ml離心管中1500rpm離心5min 去上清 加入500ulPBS輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)成細(xì)胞懸液 在旋渦狀態(tài)下逐滴加入2ml 20 95 冷乙醇 混勻后固定30min 24 加入5mlPBS 1500rpm離心5min 去上清液 加入5mlPBS重懸細(xì)胞 1500rpm離心5min 去上清液 加入800ulPI染液 用槍輕輕吹打細(xì)胞團(tuán) 混勻 室溫避光染色30min上機(jī)檢測 25 影響熒光染色的因素 溫度 溫度高于20 時 即出現(xiàn)溫度淬滅 2 PH PI在7 2 7 6 保持熒光染料分子與溶劑間的電離平衡 3 熒光染料濃度 染料太少 結(jié)合不完全 染料過多 又會出現(xiàn)濃度淬滅現(xiàn)象 4 固定劑 醛類固定劑會干擾插入性染料與核酸分子的結(jié)合 造成熒光發(fā)射強(qiáng)度減弱 26