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1,第19章：分子生物學(xué)常用技術(shù)－－4學(xué)時(shí) 分子雜交、PCR、基因測(cè)序 蛋白質(zhì)研究技術(shù)(雙向電泳，酵母雙雜交) 基因轉(zhuǎn)移與基因剔除(含RNA干擾) 第20章：基因工程－－4學(xué)時(shí) 第21章：基因診斷與基因治療－－4學(xué)時(shí),第四篇：分子生物學(xué)技術(shù)與應(yīng)用,,2,第十九章,分子生物學(xué)常用技術(shù),3,分子生物學(xué)技術(shù)能幫助我們干什么？,揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)與功能 DNA 水平：基因序列分析、拷貝數(shù)和染色體定位 RNA 水平：定量分析、基因表達(dá)產(chǎn)物的可變剪接分析 蛋白質(zhì)水平：蛋白質(zhì)定量、定位、功能 細(xì)胞與整體水平：基因在活體中的功能 目的：了解疾病發(fā)生的規(guī)律，提供治療與預(yù)防手段,4,我們需要了解和掌握哪些基本技術(shù)？,基本技術(shù)： 核酸：測(cè)序、印跡、雜交、體外擴(kuò)增技術(shù) 蛋白質(zhì)：電泳與印跡、組學(xué)技術(shù)、相互作用 綜合技術(shù)： 基因工程技術(shù) 轉(zhuǎn)基因生物與基因敲除技術(shù) 應(yīng)用技術(shù)： 基因診斷 基因治療,5,Molecular hybridization:利用已知核酸序列 (探針/probe) 檢測(cè)與其互補(bǔ)的未知核酸序列 用途： 確認(rèn)核酸序列間同源性 對(duì)特定核酸序列進(jìn)行定量 自核酸混合體中辨認(rèn)特定核酸序列,第一節(jié)：核酸分子雜交,6,一、基本原理,變性(denature)復(fù)性(renature)雜交(hybiridization),,,7,核酸變性,在特定變性因素作用下，DNA雙螺旋解離的過程 破壞氫鍵與疏水作用可導(dǎo)致變性 熱變性：高溫可使核酸變性，溫度高于 90℃時(shí)任何核酸雙鏈都將變性 酸堿變性：pH11 時(shí)核酸將變性，DNA 使用堿變性，RNA 則不可 化學(xué)試劑變性：能夠破壞氫鍵的化學(xué)試劑如尿素或甲酰胺可使核酸變性,8,變性溫度,Tm：melting temperature，解鏈溫度或變性溫度 影響變性溫度的因素： 溶液的離子強(qiáng)度 變性溫度與離子強(qiáng)度正相關(guān)，低鹽利于變性 DNA分子的 GC 含量 GC％＝(Tm－69.3)×2.24,9,核酸復(fù)性,變性的 DNA 單鏈相互識(shí)別并結(jié)合，恢復(fù)其天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程 復(fù)性類似與化學(xué)反應(yīng)，需要一定反應(yīng)時(shí)間,10,影響 DNA 復(fù)性速度的因素,DNA 分子的濃度：濃度高，復(fù)性快 DNA 分子的長(zhǎng)度：長(zhǎng)片段復(fù)性速度慢 DNA 分子的復(fù)雜性：重復(fù)序列復(fù)性速度快 不同物種C0t曲線比較 人類基因組C0t曲線,11,二、核酸探針,Probe：用于測(cè)定未知核酸片段的已知序列 探針為 DNA 或 RNA，可以為單鏈或雙鏈 探針必需經(jīng)過標(biāo)記：放射性標(biāo)記或非放射性標(biāo)記,12,1. 探針有哪些種類？,DNA 探針：常規(guī)探針利用基因組 DNA 序列或 cDNA 序列合成的探針，一般為雙鏈，也可制備成單鏈 RNA 探針：高靈敏度探針一般是通過體外轉(zhuǎn)錄而來，均為單鏈 寡核苷酸探針(oligo-nucleotide)：用于點(diǎn)突變檢測(cè)人工合成的短序列(~20nt)，可自由選擇序列,13,2. 標(biāo)記物有哪些？,標(biāo)記物的要求： 高度的靈敏性：足以檢測(cè)到極微量的核酸序列 高度的特異性：足以在大量非特異性序列中檢測(cè)到特異的靶序列 標(biāo)記物的種類： 放射性同位素(radio isotope) 非放射性標(biāo)記物(non-radioactive label),14,放射性同位素,特點(diǎn)：靈敏度最高的標(biāo)記物，足以檢測(cè)到飛克級(jí)微量的核酸序列g(shù)→mg→μg→ng→pg→fg 常用的放射性同位素,15,放射性標(biāo)記的核苷酸單體,dNTP or NTP 5’ or 3’ P32 labelling,16,非放射性標(biāo)記物,特點(diǎn)：安全且易于存放，但靈敏度與特異性均不及放射性同位素 地高辛：通過地高辛抗體結(jié)合并檢測(cè) 生物素：結(jié)合親和素/鏈親和素(avidin/streptavidin) 化學(xué)發(fā)光物質(zhì)：通過紫外激發(fā)或化學(xué)反應(yīng)而發(fā)光 電子密度標(biāo)記物：金等重金屬,17,3. 如何檢測(cè)雜交信號(hào)？,同位素標(biāo)記物： 蓋革計(jì)數(shù)器、液體閃爍計(jì)數(shù)器 放射自顯影(autoradiography),18,如何檢測(cè)雜交信號(hào)？,非放射性標(biāo)記物： 酶聯(lián)免疫技術(shù)(enzyme linked immuno-assay) 化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence),19,三、如何對(duì)核酸探針進(jìn)行標(biāo)記？,20,1. 缺口平移,nick translation: 適用于標(biāo)記雙鏈DNA 控制 DNase I 的用量，可以控制探針的長(zhǎng)度,21,2. 非放探針的酶促標(biāo)記,生物素或地高辛標(biāo)記的核苷酸單體通過酶促反應(yīng)可以參入探針,22,3. 非放探針的化學(xué)標(biāo)記,利用光敏基因經(jīng)可見光照射直接與核酸結(jié)合,23,四、如何進(jìn)行雜交？,樣品(DNA or RNA)吸附于支持物 尼龍膜、硝酸纖維膜、載玻片等 與標(biāo)記的探針雜交 封閉液封閉后雜交，雜交爐中進(jìn)行 緩沖液清洗 控制溫度與變性劑濃度 顯色 放射自顯影/酶聯(lián)顯色,24,五、雜交有哪些不同的方式？,斑點(diǎn)雜交：dot hybridization Southern 印跡雜交：Southern blot Northern 印跡雜交：Northern blot Western blotting：不是雜交 原位雜交：in situ hybridization 反 Northern 印跡雜交：reverse Northern blot 基因芯片/DNA微陣列：Genechip/DNA microarray,25,dot hybridization,將核酸樣品直接點(diǎn)在雜交膜上與探針進(jìn)行雜交 特點(diǎn)：簡(jiǎn)便但特異性不高可探測(cè)核酸含量，但無法得知分子大小,26,Southern blot,Edwin Southern 創(chuàng)立的方法 電泳技術(shù)與雜交結(jié)合，可顯示靶 DNA 序列的長(zhǎng)度 可進(jìn)行毛吸管轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移與電轉(zhuǎn)移,27,,,電泳,轉(zhuǎn)膜,雜交,28,Northern blot,類似于 Southern 印跡雜交的方法，用于 RNA 檢測(cè),29,in situ hybridization,原位雜交：特定 mRNA 的組織細(xì)胞分布,30,FISH,Fluorescence in situ hybridization (FISH)：特定基因的染色體定位,31,反 Northern 雜交與 DNA 芯片,反 Northern 雜交：將探針 DNA 片段固定在雜交膜上，利用標(biāo)記物標(biāo)記的 RNA 進(jìn)行雜交,32,第二節(jié)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),PCR，polymerase chain reaction 在體外選擇性擴(kuò)增特定 DNA 片段的高效手段 70 年代有人提出 PCR 的設(shè)想，因缺乏寡核苷酸的合成手段和適合的酶而無法進(jìn)行 1984 年 Kary Mullis 發(fā)明 PCR，并因此獲得 1993 年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 全自動(dòng)的熱循環(huán)儀和多種 PCR 衍生技術(shù)使其成為重要的科學(xué)研究手段,33,一、PCR 的基本原理,在體外，以特定引物引導(dǎo)，通過 DNA 聚合酶選擇性擴(kuò)增特定區(qū)域 變性(denature) 退火(anneal) 延伸(extension),34,DNA的體內(nèi)復(fù)制,35,引物酶,引物酶,DNA的體內(nèi)復(fù)制,36,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,DNA的體內(nèi)復(fù)制,37,DNA加熱解鏈,38,模板DNA,39,,,,引物1,引物2,40,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,41,第1輪結(jié)束,第2輪開始,42,72℃,,,,,,,,,,,,Taq,Taq,Taq,,Taq,55℃,43,,,,,,,,,,第2輪結(jié)束,44,模板DNA,第1輪擴(kuò)增,第2輪擴(kuò)增,第3輪擴(kuò)增,第4輪擴(kuò)增,第5輪擴(kuò)增,第6輪擴(kuò)增,理想拷貝數(shù)=2nn 循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX 平均效率,約為0.85n 循環(huán)次數(shù),45,,,,,,重復(fù)1-3步 25-30輪,目的DNA片段 擴(kuò)增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈 與引物復(fù)性,新鏈延伸,,,,,DNA的體外擴(kuò)增,熱循環(huán),DNA解鏈,46,,PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物 各200 μmol/L 引物 各0.1-0.5 μmol/L 模板DNA 0.1～2 μg Taq DNA聚合酶 2.5 U Mg2+ 1.5mmol/L,DNA的體外擴(kuò)增,47,PCR 技術(shù)的特點(diǎn),高度的靈敏性：理論上經(jīng) 20 循環(huán)可將目的基因片段擴(kuò)增 220＝1000000 倍 高度的特異性：利用引物與模板的特異性配對(duì)，可保證擴(kuò)增的特異性 一對(duì) 20 堿基長(zhǎng)引物的多樣性為440＝1024 應(yīng)用的廣泛性：目前已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究必不可少的手段 操作的簡(jiǎn)便性：不需要復(fù)雜的設(shè)備和繁瑣的流程,48,二、做 PCR 要有什么條件？,酶：Taq DNA 聚合酶 模板 DNA：可以為基因組 DNA 或 cDNA 引物：人工合成的寡核苷酸片段 dNTP：聚合反應(yīng)的核苷酸單體 緩沖液：包含特定的 pH、離子強(qiáng)度和 Mg2+ 反應(yīng)程序：變性、退火、延伸組成的循環(huán) 儀器：DNA 熱循環(huán)儀，或稱 PCR 儀,49,DNA聚合酶催化的聚合反應(yīng),,dNTP,50,1. 什么是耐熱 DNA 聚合酶,早期 PCR 曾使用 DNA 聚合酶 I 在高溫時(shí)發(fā)生變性，每一循環(huán)都需要重新添加酶 延伸反應(yīng)溫度為 37℃，非特異性太多 目前常用 Taq DNA 聚合酶 純化自嗜熱水生菌 (Thermus aquaticus) 可耐受 95℃ 高溫，最適反應(yīng)溫度為 72℃ 左右,51,Taq DNA polymerase,在 70~75℃ 范圍活性最佳，每秒可延伸 150nt 95℃ 時(shí)的半衰期為 40 min 按變性時(shí)間 1 min 計(jì)，能滿足 30 循環(huán)的反應(yīng) Taq 酶具有 5’ →3’ 聚合活性和 5’ →3’外切活性 不具備校讀活性，錯(cuò)誤率為 2×10－4 左右 錯(cuò)誤合成的 DNA片段可以作為模板，循環(huán)數(shù)越多，最終擴(kuò)增產(chǎn)物錯(cuò)誤率越高 只能用于檢測(cè)，不適合基因克隆,52,有保真性的耐熱 DNA 聚合酶嗎？,Pfu DNA polymerase： 常用的高保真耐熱 DNA聚合酶 有5’ →3’ 外切活性 錯(cuò)誤率約 1×10－6 適應(yīng)于基因克隆,53,2. 如何設(shè)計(jì)寡聚核苷酸引物？,引物(primer)是 PCR 反應(yīng)必備的前提，對(duì) PCR 產(chǎn)物類型、長(zhǎng)度和反應(yīng)的特異性具有決定作用 PCR 需要兩條引物，引物決定擴(kuò)增范圍和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度,54,引物設(shè)計(jì)原則,引物長(zhǎng)度一般為 15~30 核苷酸 引物太短影響雜交體的穩(wěn)定和特異性 引物太長(zhǎng)隨機(jī)匹配序列增多，特異性反而下降 GC 含量一般為 40％ ~ 60％ 應(yīng)充分考慮退火溫度(annealing temperature) GC 含量低，退火溫度低，易出現(xiàn)非特異 GC 含量高，非特異性結(jié)合也會(huì)增加 引物解鏈溫度粗略計(jì)算公式：引物的解鏈溫度Tm＝4(G＋C)＋2(A＋T),55,引物設(shè)計(jì)原則,引物自身不應(yīng)該存在鏈內(nèi)互補(bǔ)序列，以防止出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu),兩條引物間、同一引物的分子間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列 出現(xiàn)互補(bǔ)易導(dǎo)致引物二聚體的出現(xiàn)，影響擴(kuò)增效率,56,引物設(shè)計(jì)原則,避免引物與非特異序列間的同源性 引物的 3，末端必須與模板完全互補(bǔ)，5，末端允許添加非配對(duì)序列 5，末端允許添加非匹配序列，如：酶切位點(diǎn),5’,3’,57,3. 如何選擇 dNTP 和緩沖液?,dNTP 是聚合反應(yīng)的底物 常規(guī)使用濃度：0.2 mM each 探針標(biāo)記時(shí)，可使用同位素或非放標(biāo)記的 dNTP 緩沖液：特定的 pH 和離子強(qiáng)度 Mg2＋濃度一般為 1.5 mM PCR mix：預(yù)制的便捷反應(yīng)體系,58,4. 用什么做模板 DNA？,PCR 的模板(template)可以是基因組 DNA 或 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄-PCR(reverse transcription PCR)：RT-PCR 在利用 DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)純化比較簡(jiǎn)單 血液、病原體、體外培養(yǎng)細(xì)胞、甚至病理標(biāo)本經(jīng)簡(jiǎn)單處理后均可直接進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 RNA 樣品一般要經(jīng)過嚴(yán)格純化，并逆轉(zhuǎn)錄 未經(jīng)純化的 RNA 不穩(wěn)定，無法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)體系中如存在 DNA，將對(duì) RNA 擴(kuò)增產(chǎn)生干擾,59,6. 如何設(shè)計(jì)反應(yīng)程序？,PCR 的循環(huán)數(shù)： 理論上 20 ~ 25 即可滿足擴(kuò)增需要，但實(shí)際循環(huán)數(shù)一般為 25 ~ 35 過多循環(huán)后到達(dá)平臺(tái)期，繼續(xù)延長(zhǎng)循環(huán)數(shù)無效,模板濃度高時(shí)平臺(tái)期出現(xiàn)早，模板濃度低時(shí)平臺(tái)期出現(xiàn)晚，應(yīng)根據(jù)模板濃度調(diào)節(jié)循環(huán)數(shù),60,反應(yīng)程序的關(guān)鍵是退火溫度,退火溫度： 提高退火溫度有助于提高反應(yīng)的特異性 退火溫度過高將導(dǎo)致引物與模板無法配對(duì)，影響擴(kuò)增效率 反應(yīng)的退火溫度主要取決于引物序列,61,三、我們能用 PCR 做什么？,自 PCR 技術(shù)創(chuàng)立以來，經(jīng)近 20 年的發(fā)展，在基本 PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上產(chǎn)生了多種 PCR 的衍生技術(shù)，應(yīng)用于各種不同的目的 基因克隆或亞克?。蚬こ?特定基因表達(dá)量的分析 基因突變的檢測(cè)－－基因診斷 病原體特征性序列的鑒定－－基因診斷 定點(diǎn)誘變－－第 4 節(jié) DNA 序列測(cè)定－－第 3 節(jié),62,最常用的 PCR 是 RT-PCR,RT-PCR：reverse transcription PCR 以 mRNA 為模板 先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行 PCR 為什么要以 mRNA 為模板？ mRNA 無內(nèi)含子，克隆的基因可在原核表達(dá) mRNA 的量代表了基因的表達(dá)水平,63,如何利用 RT-PCR 檢測(cè)基因表達(dá)水平?,定量 PCR(quantitative PCR) PCR 產(chǎn)物的量與起始的模板量有關(guān) 利用 PCR 對(duì)模板 DNA 或 cDNA 進(jìn)行定量測(cè)定 定量 PCR 一般用于特定基因 mRNA 水平的檢測(cè) RT-PCR 可用于基因表達(dá)水平檢測(cè) 需設(shè)定內(nèi)部參照物(reference gene)，如：GAPDH、actin、18s rRNA 等穩(wěn)定表達(dá)基因 定量是相對(duì)的，一般是不準(zhǔn)確的,64,為什么說 RT-PCR 定量是不準(zhǔn)確的？,指數(shù)擴(kuò)增期，產(chǎn)物量與模板量成正比 進(jìn)入平臺(tái)期，產(chǎn)物量不能再反應(yīng)模板量 不同樣品進(jìn)入平臺(tái)期的循環(huán)數(shù)不同，難以選擇測(cè)定的時(shí)間節(jié)點(diǎn),65,有精確定量方法嗎？,實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(real-time PCR)： 以產(chǎn)物量到達(dá)一定閾值所需要的循環(huán)數(shù)為定量標(biāo)準(zhǔn) 需要對(duì) PCR 產(chǎn)物的生成量進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)控,,66,如何進(jìn)行產(chǎn)物量的實(shí)時(shí)檢測(cè)？,需要熒光標(biāo)記探針與兩側(cè) PCR 引物 探針標(biāo)記有報(bào)告熒光與粹滅熒光 反應(yīng)過程中探針被降解，報(bào)告熒光顯色 可通過熒光定量 PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,67,巢式 PCR 可以提高擴(kuò)增效率和特異性,Nested-primer PCR 內(nèi)外兩套引物分兩輪進(jìn)行擴(kuò)增 在克隆一些低豐度基因時(shí)可以采用,經(jīng)過兩輪 PCR 擴(kuò)增，具有更高的靈敏度 四條引物均與模板匹配，因此增加了特異性,68,可以利用多對(duì)引物進(jìn)行多重 PCR,多重 PCR(multi-primer PCR) 多組引物同時(shí)進(jìn)行的 PCR，可大幅度降低 PCR 反應(yīng)的工作量,69,可以在組織切片上進(jìn)行原位 PCR,原位 PCR(in situ PCR) 在組織切片或細(xì)胞涂片上進(jìn)行的 PCR 方法 主要用于特定基因表達(dá)水平的原位分析 組織切片經(jīng)過固定、蛋白酶和 DNase 消化后進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增,70,Sequencing：基因結(jié)構(gòu)分析的最基本方法 主要方式： 化學(xué)降解法 酶法：Sanger 法/雙脫氧鏈末端終止法 二代/三代測(cè)序技術(shù),第三節(jié)：基因測(cè)序,71,適用于寡核苷酸片段測(cè)序的方法 基本反應(yīng)： G：DMS G/A：哌啶 T/C：肼(低鹽) C：肼(高鹽),一、化學(xué)降解法,72,Sanger 在 1977 年建立的方法，也稱酶法測(cè)序 DNA 序列測(cè)定的最常用方法,二、雙脫氧末端終止法,在反應(yīng)體系中加入 2’, 3’ -ddNTP，由于其沒有 3’-OH 而不能與下一個(gè)核苷酸相連，于是DNA鏈的合成便終止。,73,Sanger法測(cè)序,74,模板：?jiǎn)捂湣鷨坞p鏈均可 酶： Klenow →耐熱 DNA 聚合酶 標(biāo)記：同位素標(biāo)記→熒光標(biāo)記 電泳：平板電泳→毛細(xì)管電泳4 泳道→單一泳道,酶法測(cè)序的自動(dòng)化程度越來越高,75,二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing) 1 天完成全基因組測(cè)序 羅氏、Solexa、ABI 等公司各有不同技術(shù) 利用微珠或芯片實(shí)現(xiàn)大通量，邊合成邊測(cè)序 三代測(cè)序技術(shù)(next-next-generation sequencing)： 3 分鐘完成全基因組測(cè)序 基于納米微孔的單分子測(cè)序技術(shù),二代測(cè)序與三代測(cè)序技術(shù),76,第四節(jié)：DNA 定點(diǎn)誘變技術(shù)(自學(xué)）,目前主要用 PCR 方法進(jìn)行定點(diǎn)誘變 也可進(jìn)行突變基于的全合成,77,第五節(jié)：RNA 干擾技術(shù),學(xué)習(xí)基因工程之后，在基因剔除技術(shù)部分介紹,78,第六節(jié)：生物芯片,生物芯片(biochip)：基于微電子技術(shù)和生物信息技術(shù)建立的高度集成化的生物樣本分析方法 生物芯片是后基因組時(shí)代的利器 生物芯片有哪些種類？ DNA microarray Protein microarray Antibody microarray Chemical compound microarray Tissue microarray,79,什么是基因芯片技術(shù)？,基因芯片(gene chip)，一種高通量的核酸雜交方法，又稱 DNA 微陣列 (DNA microarray) 將大量探針固定與固相支持物，與標(biāo)記的待測(cè)樣品進(jìn)行雜交的方法 Affymetrix 公司已經(jīng)將 GeneChip 注冊(cè),80,如何制作基因芯片？,cDNA 芯片：cDNA 片段以顯微打印的方式固定于固相支持物表面，集成度較低 原位合成芯片：以激光蝕刻技術(shù)直接合成寡核苷酸探針，集成度可達(dá) 105 點(diǎn)陣/cm2以上,81,基因芯片能幫助我們干什么？,基因表達(dá)譜芯片(gene expression profile)：基因表達(dá)的大通量分析 SNP 芯片(single nucleotide polymorphism)：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性的大通量檢測(cè) 微小 RNA 芯片(miRNA)：分析 microRNA 甲基化芯片：分析基因組甲基化狀態(tài) ChIP-chip(chromatin immunoprecipitation)：分析 DNA 與蛋白質(zhì)的相互作用,82,芯片的主要工作流程,選擇與購(gòu)買芯片 準(zhǔn)備樣品 標(biāo)記樣品 雜交 檢測(cè)雜交信號(hào) 分析處理結(jié)果,83,第七/八節(jié)：蛋白質(zhì)分析方法,蛋白質(zhì)的定量分析： ELISA(Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) Western blot 蛋白質(zhì)的定位： 免疫組織化學(xué) 熒光蛋白的活細(xì)胞定位 蛋白質(zhì)相互作用的研究 蛋白質(zhì)功能的研究 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),84,Proteomics,蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)： 對(duì)特定組織細(xì)胞總蛋白的整體性研究,85,蛋白質(zhì)組學(xué)研究的目的什么？,解讀基因組：基因組編碼了多少基因？ 蛋白表達(dá)：比研究 RNA 表達(dá)深入了一步 蛋白功能：超過 1/3 的蛋白質(zhì)功能不明確 蛋白質(zhì)修飾：糖基化、磷酸化、酶解等 蛋白質(zhì)定位：subproteome 蛋白-蛋白相互作用：互作是功能的基礎(chǔ),86,蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)是什么？,1975 年，雙向電泳技術(shù)建立 1990 年，更新的 Edman 降解法用于微量蛋白質(zhì)測(cè)序，靈敏度達(dá)到 pmol 級(jí) 質(zhì)譜技術(shù)使蛋白測(cè)序靈敏度達(dá)到 fmol 級(jí) 基因組計(jì)劃提供了大量的生物信息 雙向電泳＋質(zhì)譜＋生物信息分析,87,等電聚焦 ＋ SDS-PAGE,雙向電泳技術(shù),88,雙向電泳,等電聚焦＋SDS-PAGE,89,雙向電泳的優(yōu)點(diǎn)與缺陷,優(yōu)點(diǎn)： 比單向電泳有更高的分辨率 缺點(diǎn)與解決辦法： 無法檢測(cè)低豐度蛋白：分組檢測(cè) 無法檢測(cè)大分子量或脂溶性蛋白：酶解 電泳圖譜解讀困難：自動(dòng)化分析、DIGE,90,Difference gel electrophoresis (DIGE),91,Mass spectrometry,肽質(zhì)譜(MS)：分析混合多肽 只能確定氨基酸組成，不能分析序列 氨基酸質(zhì)譜：分析單一肽的氨基酸序列 串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem mass spectrometry，MS/MS) 可以分析氨基酸序列 通過與數(shù)據(jù)庫(kù)比較確認(rèn)肽的來源,92,MS 與 MS/MS,93,如何進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用的分析？,酵母雙雜交(yeast two-hybridization) 噬菌體展示文庫(kù)(phage display library) 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation) FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer),94,Yeast two-hybridization,蛋白質(zhì)相互作用的篩查方法 以特定蛋白為釣餌，篩選其相互作用蛋白,95,如何利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行功能分析？,蛋白質(zhì)芯片 抗原－抗體 鑒定蛋白質(zhì)相互作用 鑒定蛋白質(zhì)與小分子相互作用：代謝組學(xué) 檢測(cè)酶活性：蛋白質(zhì)功能的高通量分析,96,本章的主要內(nèi)容是什么？,通過本章學(xué)習(xí)了解了哪些核酸和蛋白質(zhì)研究方法？ 什么是分子雜交？ 分子雜交的探針是什么？怎樣進(jìn)行標(biāo)記？ 分子雜交有哪些基本方式？ 什么是 PCR？基本原理是什么？ PCR 反應(yīng)體系是由什么組成的？,97,本章的主要內(nèi)容是什么？,什么是 RT-PCR？能用來干什么？ 如何利用 PCR 進(jìn)行核酸的定量分析？ 什么是基因芯片？ 什么是蛋白質(zhì)組學(xué)？核心方法是什么？ 如何進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用的研究？,