《高中生物一輪復(fù)習(xí) 第45講 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課件》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《高中生物一輪復(fù)習(xí) 第45講 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課件（28頁珍藏版）》請?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、第第45講講 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù) 一、一、DNA的粗提取和鑒定的粗提取和鑒定 1DNA的理化性質(zhì) (1)DNA的溶解性 DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離目的。此外，DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些成分如蛋白質(zhì)等卻溶于酒精，利用這一原理，可將DNA與蛋白質(zhì)等進(jìn)一步地分離。 (2)DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對DNA沒有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受6080的高溫，而DNA在80以上時才會變性，洗滌劑能夠溶解細(xì)胞膜，但對DNA沒有影響。 (

2、3)DNA的熱變性 DNA分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時，在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂，而在體外，DNA在80l00的溫度范圍內(nèi)變性，即雙螺旋解開，成為單鏈；當(dāng)溫度慢慢降低后，兩條彼此分離的單鏈又會重新結(jié)合形成雙鏈。但高溫能使DNA聚合酶變性失活，后來發(fā)現(xiàn)了耐高溫的TaqDNA聚合酶，解決了上述矛盾。 2基本原理 (1)DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，在014 molL的NaCl溶液中的溶解度最低，如下表所示 由上表可以看出，在NaCl溶液物質(zhì)的量濃度為2 mo1L時，DNA溶解，部分蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析而生成沉淀，通過過濾可除去部分蛋白質(zhì)；在NaCl溶液物質(zhì)的量濃度為014 m01L時，DN

3、A析出，過濾可除去溶解的部分蛋白質(zhì)。 (2)DNA不溶于酒精溶液加入體積分?jǐn)?shù)為95的冷卻酒精溶液可使DNA析出，除去溶于酒精的蛋白質(zhì)。 (3)DNA不被蛋白酶所水解嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，加入嫩肉粉可使蛋白質(zhì)水解而DNA不被水解。 (4)DNA可被二苯胺染成藍(lán)色向含DNA的試管中加入二苯胺并沸水浴，溶液呈現(xiàn)藍(lán)色可確認(rèn)DNA。 3方法步驟 (1)實(shí)驗(yàn)材料的選擇 首先選擇含有DNA的生物材料。 選用DNA含量相對較高的生物組織，成功率較大。 (2)破碎細(xì)胞獲取含DNA的濾液 動物細(xì)胞如雞血細(xì)胞在血細(xì)胞液中加入蒸餾水，用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。 植物細(xì)胞用洗滌劑溶解細(xì)胞膜，進(jìn)行充分?jǐn)嚢韬脱心ィ?/p>

4、過濾后收集濾液。 (3)去除濾液中的雜質(zhì) 方案利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，通過控制NaCl溶液的濃度去除雜質(zhì)(用2 molI。NaCl溶液過濾除去不溶的雜質(zhì)，用014 molI。NaCl溶液析出DNA，過濾，除去溶液中的雜質(zhì)，再用2 molL NaCl溶液溶解DNA)。 方案在濾液中加入嫩肉粉，利用其蛋白酶水解蛋白質(zhì)。 方案將濾液放入6075恒溫水浴箱中保溫1015 rain，使蛋白質(zhì)變性。 (4)DNA的析出與鑒定 析出：將處理后的溶液過濾，加入與濾液等體積的冷卻酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95)靜置，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物(此即粗提取的DNA)，用玻璃棒沿一個方向攪拌卷起絲狀物

5、。 鑒定 【例1】關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”的實(shí)驗(yàn)裝置如圖 (1)實(shí)驗(yàn)材料選用雞血細(xì)胞液，而不用雞全血。主要原因是雞血細(xì)胞液中 含量較高。 (2)在圖A所示的實(shí)驗(yàn)步驟中加蒸餾水20 mL的目的是 通過圖B所示的步驟取得濾液，再在濾液中加入2mol/l NaCl溶液的目的是 圖C所示實(shí)驗(yàn)中加蒸餾水的目的是 。 (3)為鑒定實(shí)驗(yàn)所得絲狀物的主要成分是DNA，可滴加 溶液，結(jié)果絲狀物被染成綠色。答案答案 (1)DNA (2)使血細(xì)胞吸水漲破，放出DNA使濾液中的DNA溶于鹽溶液 使DNA析出 (3)甲基綠二、二、PCR技術(shù)技術(shù) 1生物體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR反應(yīng)的區(qū)別 體內(nèi)DNA復(fù)制 PCR反應(yīng)，時

6、期細(xì)胞有絲分裂間期或減數(shù)第一次分裂間期及無絲分裂、二分裂過程 體外隨時進(jìn)行 場所 細(xì)胞內(nèi) 微量離心管內(nèi)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供能量，部分解開加熱至90，雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或單鏈DNA分子片段合成子鏈在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)合成，另一條鏈不連續(xù)合成分別從兩條鏈的引物端開始，都是連續(xù)合成，控制溫度72特點(diǎn)邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制 體外迅速擴(kuò)增DNA聚合酶需DNA聚合酶需耐高溫的Taq DNA聚合酶循環(huán)次數(shù) 受生物體自身控制30多次 相同點(diǎn) 需提供DNA復(fù)制的模板 四種脫氧核苷酸作原料 子鏈延伸的方向都是從5端到3端 2PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA片段 (1)原理：DN

7、A復(fù)制。 (2】需要條件：模板DNA、RNA引物、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)、離子。 (3)方法：DNA受熱變性解旋為單鏈、冷卻后RNA引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合、在DNA聚合酶作用下延伸合成互補(bǔ)鏈。 (4)特點(diǎn)：指數(shù)形式擴(kuò)增。 (5)過程：變性、復(fù)性、延伸、重復(fù)。步驟名稱 需要溫度 過程 第一步變性9095將反應(yīng)體系(包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應(yīng)所需的離子等)加熱至9095，使雙鏈DNA模板兩條鏈之間的氫鍵打開，變成單鏈DNA，作為互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板第二步復(fù)性5560將反應(yīng)體系降溫至5560，使兩種引物分別與模板DNA鏈3端的

8、互補(bǔ)序列互補(bǔ)配對，這個過程稱為復(fù)性第三步延伸合成7075將反應(yīng)體系升溫至7075，在耐高溫的DNA聚合酶催化作用下，將與模板互補(bǔ)的單個核苷酸加到引物所提供的3 7一OH上，使DNA鏈延伸，產(chǎn)生一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈。 (6)結(jié)果：上述三步反應(yīng)完成后，一個DNA分子就變成了兩個DNA分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNA分子就以2”的形式增加。PCR的反應(yīng)過程都是在PCR擴(kuò)增儀中完成的。 【例2】2008年5月20日，民政部制訂汶川大地震遇難人員遺體處理意見時指出，無法確認(rèn)遇難者身份的，由公安部門提取可供DNA檢驗(yàn)的檢材以便后身份辨認(rèn)。事后的遺體辨認(rèn)可借助于DNA雜交技術(shù)，即從遺體細(xì)胞與死者家屬提

9、供的死者生前生活用品中分別提取DNA，然后借助DNA雜交技術(shù)對遺體進(jìn)行確認(rèn)。請回答下列問題： (1)為了確保辨認(rèn)的準(zhǔn)確性，需要克隆出較多的DNA樣品，這需要借助PCR技術(shù)。使用PCR技術(shù)的具體實(shí)驗(yàn)操作順 序是：按配方準(zhǔn)備好各組分 離心使反應(yīng)液集中在離心管底部一設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序一進(jìn)行PCR反應(yīng)。在該操作過程中應(yīng)特別注意的問題是 (2)如表所示為分別從死者遺體和死者生前的生活用品中提取的三條相同染色體上的同一區(qū)段DNA單鏈的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對情況進(jìn)行判斷，A、B、C三組DNA中不是同一人的是 (3)為什么從死者體細(xì)胞與死者家屬提供的其生前生活用品中分別提取的DNA可以完全互補(bǔ)配對?

10、 A組 B組 C組遺體中的DNA堿基序列ACTGACGGTT GGCTTATCGAGCAATCGTGC家屬提供的DNA堿基序列TGACTGCCAA CCGAATAGCACGGTAAGACG答案：答案： (1)用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分PCR實(shí)驗(yàn)使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌 (2)B、C (3)人體所有體細(xì)胞均由一個受精卵經(jīng)有絲分裂產(chǎn)生，其細(xì)胞核中均含有相同的遺傳物質(zhì)三、血紅蛋白的提取和分離三、血紅蛋白的提取和分離 1實(shí)驗(yàn)原理 (1)蛋白質(zhì)各種特性(如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等)的差異，可以用

11、來分離不同種類的蛋白質(zhì)。 (2)有效方法凝膠色譜法：根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)。 凝膠是由多糖類化合物構(gòu)成的微小的多孔球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。 相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)，無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。 (3)電泳：蛋白質(zhì)等生物大分子都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下會帶上正電或負(fù)電。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。故電泳可利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子

12、本身大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 2實(shí)驗(yàn)操作程序 (2)粗分離透析 將盛有1 mL血紅蛋白溶液的透析袋放入盛有300 mL的物質(zhì)的量濃度為20 mm01L的磷酸緩沖液中透析12 h，去除樣品中的小分子雜質(zhì)。 (3)純化采用凝膠色譜法對血紅蛋白進(jìn)行分離和純化 (4)純度鑒定：一般用SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，來測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，即對血紅蛋白進(jìn)行純度鑒定。 【例3】紅細(xì)胞含有大量的血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來提取和分離血紅蛋白，

13、請回答下列有關(guān)問題： (1)以上所述的過程即是樣品處理，它包括 、 、分離血紅蛋白溶液。 (2)收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過透析，這就是樣品的粗分離。 透析的目的是 。 透析的原理是 。 (3)然后通過凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化，最后經(jīng)SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。 樣品純化的目的是 。 血紅蛋白有什么特點(diǎn)? 。這一特點(diǎn)對進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義?答案：答案： (1)紅細(xì)胞的洗滌血紅蛋白的釋放 (2)去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì) 透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子則保留在袋內(nèi) (3)通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜蛋白除去 血紅蛋白呈現(xiàn)紅色，在凝膠色譜分離時，可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液 使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作