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第35講 基因工程 【課下作業(yè)】 1．(2018廣西三市聯(lián)考)小鼠基因靶向敲除技術是采用工程技術手段使小鼠體內的某一基因失去功能，以研究基因在生物個體發(fā)育和病理過程中的作用。例如現(xiàn)有基因型為BB的小鼠，要敲除基因B，可先用體外合成的突變基因b取代正常基因B，使BB細胞改變?yōu)锽b細胞，最終培育成為基因敲除小鼠bb。分析回答下列問題： (1)“基因靶向敲除”技術采用了基因工程的技術手段?；蚬こ淌侵赴凑杖藗兊脑竿?，進行嚴格的設計，并通過________________和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性。 (2)基因表達載體應包括啟動子、___________________________、________________、標記基因。目的基因導入受體細胞后，首先要檢測轉基因生物________________，這是目的基因能否在受體細胞中穩(wěn)定遺傳的關鍵。 (3)為獲得“基因靶向敲除”的小鼠個體，則應將同源目的基因導入小鼠的________________。此外還必須經(jīng)過________________和胚胎移植等胚胎工程的技術手段，最終由受體母鼠生下來。 (4)按上述“基因靶向敲除”操作獲得的多只雌雄小鼠都是雜合子，人們想在此基礎上獲得一個含純合目的基因的個體。簡要的方案是：________________________________。 答案：(1)體外DNA重組　(2)目的基因　終止子　DNA上是否插入了目的基因　(3)受精卵　早期胚胎培養(yǎng)　(4)讓獲得的雜合子雌雄小鼠交配，從后代中篩選出含目的基因的純合小鼠 2．(2018廣州模擬)蟲草中的超氧化物歧化酶(SOD)具有抗衰老作用。研究人員培育了能合成SOD的轉基因酵母菌。請結合圖回答問題： 注：HindⅢ和ApaLⅠ是兩種限制酶，箭頭表示酶的切割位置。 (1)將圖中的重組DNA分子用HindⅢ和ApaLⅠ完全酶切后，可得到________________種DNA片段。圖示的表達載體存在氨芐青霉素抗性基因，不能導入用于食品生產(chǎn)的酵母菌中，據(jù)圖分析，可用________________切除該抗性基因的部分片段使其失效，再用DNA連接酶使表達載體重新連接起來。 (2)作為受體細胞的酵母菌缺失URA3基因，必須在含有尿嘧啶的培養(yǎng)基中才能存活，因此，圖示表達載體上的URA3基因可作為________________供鑒定和選擇；為了篩選出成功導入表達載體的酵母菌，所使用的培養(yǎng)基________________(填“需要”或“不需要”)添加尿嘧啶。 (3)目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為____________。為了確定受體細胞中SOD基因是否轉錄，可用標記的________________作探針進行分子雜交檢測，分子雜交的原理是____________________________________________________。 (4)利用蛋白質工程獲得活性更高的SOD時，需根據(jù)所設計蛋白質的結構推測其__________序列，最終確定相對應的脫氧核苷酸序列并經(jīng)基因修飾獲得所需的基因。 答案：(1)3　ApaLⅠ　(2)標記基因　不需要　(3)轉化　SOD基因　堿基互補配對　(4)氨基酸 3．(2018海淀區(qū)質檢)菊天牛是菊花的主要害蟲之一?？蒲腥藛T將抗蟲基因轉入菊花，培育出抗蟲菊花。下圖是獲得轉基因菊花的技術流程，請據(jù)圖回答下列問題： 注：卡那霉素抗性基因(kanR)作為標記基因，菊花葉片對卡那霉素高度敏感。 (1)為了促進土壤農桿菌吸收重組質粒，可用________處理土壤農桿菌，使其處于感受態(tài)。 (2)將重組質粒導入土壤農桿菌的目的是利用農桿菌能夠__________________________的特點，使目的基因進入受體細胞中，并插入到菊花細胞的________________上，最終形成轉基因植株。 (3)將愈傷組織轉移到添加一定濃度植物激素和________________的培養(yǎng)基中，在適宜條件下進行培養(yǎng)，篩選轉基因菊花。 (4)用PCR方法檢測轉基因菊花是否含有目的基因時，需根據(jù)________________的核苷酸序列設計特異性引物，以________________為模板進行第一輪擴增。 解析：(1)用Ca2＋處理土壤農桿菌，使其處于感受態(tài)，易于吸收外源重組DNA分子。(2)農桿菌能夠感染植物細胞，并將TDNA轉移至受體細胞中，并插入到受體細胞的染色體DNA上，利用這個特點實現(xiàn)導入目的基因。(3)利用添加卡那霉素的培養(yǎng)基可以篩選含卡那霉素抗性基因的轉基因植株。(4)用PCR方法檢測轉基因菊花是否含有目的基因時，需根據(jù)目的基因的核苷酸序列設計特異性引物，以含目的基因的菊花DNA為模板進行第一輪擴增。 答案：(1)Ca2＋(或“CaCl2溶液”)　(2)感染菊花(或“植物”)細胞，并將TDNA轉移至受體細胞　染色體DNA (3)卡那霉素　(4)抗蟲基因(目的基因)　轉基因菊花的DNA(或“含目的基因的菊花DNA”) 4．(2018武漢調研)鐮刀型細胞貧血癥是一種單基因遺傳病，患者的血紅蛋白分子β肽鏈第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸代替，導致功能異常。回答下列問題： (1)異常血紅蛋白的氨基酸序列改變的根本原因是編碼血紅蛋白基因的________________序列發(fā)生改變。 (2)將正常的血紅蛋白基因導入患者的骨髓造血干細胞中，可以合成正常的血紅蛋白達到治療的目的。此操作________(填“屬于”或“不屬于”)蛋白質工程，理由是該操作________________________________。 (3)用基因工程方法制備血紅蛋白時，可先提取早期紅細胞中的________________，以其作為模板，在________________酶的作用下逆轉錄合成cDNA。cDNA與載體需在______________________酶的作用下，拼接構建基因表達載體，導入受體菌后進行表達。 (4)檢測受體菌是否已合成血紅蛋白，可從受體菌中提取________________，用相應的抗體進行______________雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則表明該受體菌已合成血紅蛋白。 解析：(1)基因是具有遺傳效應的DNA片段，遺傳信息儲存在基因堿基對的排列順序中。(2)蛋白質工程是指通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類生產(chǎn)和生活的需求，題中所述不屬于蛋白質工程。(3)利用反轉錄法獲取目的基因時，需先提取mRNA，在逆轉錄酶的作用下反轉錄合成cDNA。cDNA與載體需在限制酶和DNA連接酶的作用下拼接構建成基因表達載體，才可導入受體菌。(4)檢測目的基因是否翻譯成蛋白質，需要從轉基因生物中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原—抗體雜交。 答案：(1)堿基對　(2)不屬于　沒有對現(xiàn)有的蛋白質進行改造　(3)mRNA　逆轉錄　限制酶和DNA連接　(4)蛋白質　抗原—抗體 5．GDNF蛋白是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，對損傷的神經(jīng)細胞具有營養(yǎng)和保護作用。研究人員構建了含GDNF基因的基因表達載體(如圖所示)，并導入到大鼠神經(jīng)干細胞，用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。請回答下列相關問題： (1)在培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細胞時，常先用____________________________把組織分離，獲得單個細胞。當培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞相互接觸后停止分裂，通過分瓶培養(yǎng)可以使細胞繼續(xù)增殖，該過程稱為________________。 (2)除目的基因、啟動子外，基因表達載體通常還含有____________________，在構建GDNF基因的表達載體時，需選擇圖中的________________限制酶進行酶切。 (3)根據(jù)上圖，酶切后的載體和GDNF基因經(jīng)__________酶處理，可獲得____________種含有目的基因的產(chǎn)物。 解析：(1)動物細胞培養(yǎng)時，需要先用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理動物組織，使動物細胞彼此分離成單個細胞。動物細胞培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)接觸抑制的現(xiàn)象。(2)目的基因的表達載體除了含有目的基因、啟動子外，還要含有終止子和標記基因等。從圖中可以看出，目的基因的兩側含有限制酶XhoⅠ的切割位點，所以要用XhoⅠ對質粒和目的基因進行切割。(3)目的基因與質粒的結合要用DNA連接酶處理。從圖中可以看出，獲得的三種質粒中，只有2種含有目的基因。 答案：(1)胰蛋白酶或膠原蛋白酶　傳代培養(yǎng)　(2)終止子和標記基因　XhoⅠ　(3)DNA連接　2 6．(2018山東青島質檢)科學家運用基因工程技術將結核桿菌MPT64基因(能控制合成MPT64蛋白)成功導入胡蘿卜細胞，最終表達出肺結核疫苗。請回答下列問題： (1)為獲取MPT64基因，可從結核桿菌的細胞中提取對應mRNA，在________________的作用下合成雙鏈cDNA片段，獲得的cDNA片段與結核桿菌中該基因堿基序列________(填“相同”或“不同”)。 (2)通常采用PCR技術擴增MPT64基因，前提是要有一段已知MPT64基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成________，在操作步驟中需要加熱至90～95 ℃的目的是________________________________________________________________________。 (3)根據(jù)農桿菌的特點，如果將MPT64基因插入到________________上，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入胡蘿卜細胞，并將其插入到植物細胞中的________________上。要確認MPT64基因是否在胡蘿卜植株中表達，應檢測胡蘿卜植株中是否含有____________。 (4)研究發(fā)現(xiàn)，如果將MPT64蛋白20位和24位的氨基酸改變?yōu)榘腚装彼幔浔４鏁r間將大大延長，科學家可以生產(chǎn)上述耐儲存的MPT64蛋白的現(xiàn)代生物工程技術是__________________。 解析：(1)以mRNA為模板，合成cDNA的過程是逆轉錄，需要逆轉錄酶的催化。由于DNA轉錄形成的mRNA過程中非編碼序列不轉錄，所以形成的cDNA與結核桿菌中該基因堿基序列不同。(2)在PCR技術中，以已知MPT64基因的核苷酸序列為模板，合成引物。在操作步驟中需要加熱至90～95 ℃，以打開目的基因DNA的雙鏈。(3)在農桿菌轉化法中，將MPT64基因插入到農桿菌的Ti質粒的TDNA上，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入胡蘿卜細胞，并將其插入到植物細胞中的染色體的DNA上?；虻谋磉_產(chǎn)物是蛋白質，要確認MPT64基因是否在胡蘿卜植株中表達，應檢測胡蘿卜植株中是否含有MPT64蛋白。(4)蛋白質工程又叫第二代基因工程，可以通過設計改造原有蛋白質的結構和功能，來滿足人類的生產(chǎn)和生活需求。 答案：(1)逆轉錄酶　不同　(2)引物　使目的基因DNA受熱變性解旋為單鏈　(3)Ti質粒的TDNA　染色體DNA　MPT64蛋白　(4)蛋白質工程 7．(2018黑龍江哈爾濱三中模擬)絞股藍細胞中含有抗煙草花葉病毒(TMV)基因，可以合成一種抗TMV蛋白，葉片對 TMV具有抗感染性。煙草是重要的經(jīng)濟作物，由于 TMV 的感染會導致大幅度減產(chǎn)。研究人員利用轉基因技術培育出了抗TMV的煙草，主要流程如圖所示。 (1)科學家首先從絞股藍細胞中提取抗TMV基因轉錄的RNA，然后合成目的基因。圖中過程①表示 ________，獲得的DNA必須在兩側添加________和________。 (2)過程③構建重組Ti 質粒時，必須使用____________和________兩種工具酶。 (3)由圖分析，在過程③構建的重組Ti質粒上應該含有卡那霉素抗性基因作為__________________________，重組Ti質粒導入煙草體細胞的方法是________________________________________________________________________。 (4)在過程⑤培養(yǎng)基中除含有卡那霉素及植物必需的各種營養(yǎng)成分外，還必須添加________________，以保證受體細胞能培養(yǎng)成再生植株。 (5)過程⑥可采取________________的方法，檢測植株是否合成了抗TMV蛋白。在個體水平的鑒定過程中，可通過________________的方法來確定植株是否具有抗性。 解析：利用mRNA獲得目的基因的方法是逆轉錄法，目的基因的兩端要分別有啟動子和終止子。質粒上的抗性基因常用作標記基因。檢測目的基因是否完成了表達常用抗原—抗體雜交的方法檢測是否合成了特定的蛋白質；常用接種實驗從個體水平上檢測植株是否具有抗病性。 答案：(1)逆(反)轉錄　啟動子　終止子 (2)限制性核酸內切酶(限制酶)　DNA連接酶 (3)標記基因　農桿菌轉化法 (4)植物激素(生長素和細胞分裂素) (5)抗原—抗體雜交　接種煙草花葉病毒 8．(2018江西新余聯(lián)考)人參是一種名貴藥材，具有良好的滋補作用?？诜粮蓴_素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。下圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細胞的流程，①～④表示相關的操作，EcoRⅠ、BamHⅠ為限制酶，它們的識別序列及切割位點如表所示。請回答下列問題： 限制酶 識別序列和切割位點 EcoRⅠ ↓　　　 GAATTC BamHⅠ ↓　　　 GGATCC (1)步驟①中，利用PCR技術擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據(jù)是___________________________________________________________________________________________________________________________________________。 科研人員還在兩種引物的一端分別加上了________________和________________序列，以便于后續(xù)的剪切和連接。 (2)過程②所構建的基因表達載體中未標注出的必需結構還有________________，過程③中需先用__________處理農桿菌以便將基因表達載體導入細胞。 (3)過程④中，科研人員提取愈傷組織細胞的RNA后，先通過________________過程獲得DNA，再進行PCR擴增，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是_______________________________________________________________________________________________________________________________________________。 (4)治療中發(fā)現(xiàn)，用于口服的α干擾素在胃中會受到一定程度的破壞影響其功效，需要利用________________技術加以改造，以達到滿意效果。 解析：(1)設計引物序列的主要依據(jù)是干擾素基因兩端的部分核苷酸序列。后期需要用限制酶進行切割，所以在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列。(2)構建的基因表達載體中還需要復制原點。過程③中需先用Ca2＋處理農桿菌以便將基因表達載體導入細胞。(3)RNA通過逆轉錄形成DNA，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是干擾素基因未能導入人參愈傷組織細胞或導入人參愈傷組織細胞的干擾素基因未能轉錄。(4)對α干擾素進行改造需要利用蛋白質工程。 答案：(1)干擾素基因兩端的部分核苷酸序列　GAATTC　GGATCC　(2)復制原點　Ca2＋　(3)逆轉錄　干擾素基因未能導入人參愈傷組織細胞或導入人參愈傷組織細胞的干擾素基因未能轉錄 　(4)蛋白質工程