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第1講 基因工程 1．(2017年全國新課標Ⅰ卷)真核生物基因中通常有內含子，而原核生物基因中沒有，原核生物沒有真核生物所具有的切除內含子對應的RNA序列的機制。已知在人體中基因A(有內含子)可以表達出某種特定蛋白(簡稱蛋白A)。回答下列問題： (1)某同學從人的基因組文庫中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細胞卻未得到蛋白A，其原因是_________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)若用家蠶作為表達基因A的載體，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用____________________作為載體，其原因是___________________________________。 (3)若要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體，因為與家蠶相比，大腸桿菌具有________________________(答出兩點即可)等優(yōu)點。 (4)若要檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用的檢測物質是______________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗體”)。 (5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉化實驗為證明DNA是遺傳物質做出了重要貢獻，也可以說是基因工程的先導，如果說他們的工作為基因工程理論的建立提供了啟示，那么，這一啟示是________________________________________________________________________。 【答案】(1)基因A有內含子，在大腸桿菌中，其初始轉錄產物中與內含子對應的RNA序列不能被切除，無法表達出蛋白A (2)噬菌體　噬菌體的宿主是細菌，而不是家蠶 (3)繁殖快、容易培養(yǎng) (4)蛋白A的抗體 (5)DNA可以從一種生物個體轉移到另一種生物個體 【解析】(1)人的基因A含有內含子，其轉錄出的RNA需切除內含子對應的RNA序列后才能翻譯出蛋白A，大腸桿菌是原核生物，其沒有切除內含子對應的RNA序列的機制，故將人的基因A導入大腸桿菌無法表達出蛋白A。(2)噬菌體是一種專門寄生在細菌體內的病毒，無法寄生在家蠶中。(3)大腸桿菌繁殖快、容易培養(yǎng)，因此常用作基因工程的受體。(4)在分子水平檢測目的基因是否表達應用抗原—抗體雜交法，即用蛋白A與蛋白A的抗體進行雜交。(5)艾弗里的肺炎雙球菌轉化實驗的原理是基因重組，通過重組使得S型細菌的DNA在R型細菌中表達，這種思路為基因工程理論的建立提供了啟示。 2．(2017年全國新課標Ⅱ卷)幾丁質是許多真菌細胞壁的重要成分，幾丁質酶可催化幾丁質水解。通過基因工程將幾丁質酶基因轉入植物體內，可增強其抗真菌病的能力?；卮鹣铝袉栴}： (1)在進行基因工程操作時，若要從植物體中提取幾丁質酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實驗材料，原因是__________________________。提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是__________________________________。 (2)以mRNA為材料可以獲得cDNA，其原理是________________________________。 (3)若要使目的基因在受體細胞中表達，需要通過質粒載體而不能直接將目的基因導入受體細胞，原因是__________________________(答出兩點即可)。 (4)當幾丁質酶基因和質粒載體連接時，DNA連接酶催化形成的化學鍵是__________________。 (5)若獲得的轉基因植株(幾丁質酶基因已經整合到植物的基因組中)抗真菌病的能力沒有提高，根據中心法則分析，其可能的原因是__________________________。 【答案】(1)嫩葉組織細胞易破碎　防止RNA降解 (2)在逆轉錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA (3)目的基因無復制原點；目的基因無表達所需啟動子 (4)磷酸二酯鍵 (5)目的基因的轉錄或翻譯異常 【解析】(1)選取嫩葉為實驗材料提取mRNA的原因是嫩葉細胞的細胞壁易破碎。提取RNA時加入RNA酶抑制劑的目的是防止RNA降解。(2)以mRNA為材料獲得cDNA的過程為逆轉錄，其原理是在逆轉錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA。(3)目的基因無復制原點，無表達所需的啟動子、終止子等，其不能在受體細胞內表達，要使目的基因在受體細胞中表達，需要通過含有這些結構的質粒載體將目的基因導入受體細胞。(4)當幾丁質酶的基因和質粒載體連接時，DNA連接酶催化形成的化學鍵是磷酸二酯鍵。(5)如果目的基因已經整合到植物的基因組中，但植物未表現出相應性狀，可能的原因是目的基因未轉錄，或是轉錄出的mRNA未翻譯出相應的幾丁質酶。 3．(2017年江蘇卷)金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結合蛋白，某研究小組計劃通過多聚酶鏈式反應(PCR)擴增獲得目的基因，構建轉基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴增過程示意圖如下，請回答下列問題： (1)從高表達MT 蛋白的生物組織中提取mRNA，通過______________獲得__________用于PCR擴增。 (2)設計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物(引物1和引物2)，為方便構建重組質粒，在引物中需要增加適當的____________________位點。設計引物時需要避免引物之間形成______________，而造成引物自連。 (3)圖中步驟1代表____________，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個步驟組成一輪循環(huán)。 (4)PCR擴增時，退火溫度的設定是成敗的關鍵。退火溫度過高會破壞____________的堿基配對。退火溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，長度相同但____________的引物需要設定更高的退火溫度。 (5)如果PCR反應得不到任何擴增產物，則可以采取的改進措施有__________(填序號：①升高退火溫度 ②降低退火溫度?、壑匦略O計引物)。 【答案】(1)逆轉錄　cDNA (2)限制性核酸內切酶　堿基互補配對 (3)變性 (4)引物與模板　G—C含量高 (5)②③ 【解析】本題主要考查基因工程中目的基因獲取的相關知識。(1)根據mRNA獲取目的基因的方法是先通過逆轉錄獲得cDNA，然后通過PCR擴增。(2)構建重組質粒時，要用限制性核酸內切酶對質粒和含目的基因的DNA進行酶切，所以為方便構建重組質粒，在引物中需要增加適當的限制性核酸內切酶位點。設計引物時需要避免引物的堿基互補配對，防止引物之間自連。(3)PCR包括三個步驟：變性、復性(退火)和延伸。圖中步驟1代表變性。(4)退火是引物和模板結合的過程，退火溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對。退火溫度一般比Tm值(把DNA雙螺旋結構降解一半時的溫度)低5 ℃。DNA中G—C含量越高，Tm值越高。(5)如果PCR反應得不到任何擴增產物，可能是退火溫度太高，破壞了引物與模板的堿基配對，也可能是引物設計錯誤，改進措施是降低退火溫度和重新設計引物。 4．(2016年全國新課標Ⅰ卷)某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamH Ⅰ酶切后，與用BamH Ⅰ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌。結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}： (1)質粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有_____________________(答出兩點即可)，而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。 (2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的，其原因是____________________________；并且______________和____________的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是__________________________________。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有__________的固體培養(yǎng)基。 (3)基因工程中，某些噬菌體經改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自____________。 【答案】(1)能自我復制、具有標記基因 (2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長　含有質粒載體　含有插入了目的基因的重組質粒(或含有重組質粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長　四環(huán)素 (3)受體細胞 【解析】(1)作為運載體必須具備如下特點：①能自我復制，從而在受體細胞中穩(wěn)定保存；②含標記基因，以供重組DNA的鑒定和選擇；③具一個或多個限制酶切割位點以便外源DNA插入。(2)在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，只有具有Ampr的大腸桿菌才能生長。而Ampr位于質粒上，故未被轉化的和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌細胞中無Ampr，故不能在培養(yǎng)基中生長，而僅含有質粒載體的和含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌均具有Ampr因而能在培養(yǎng)基中生長。目的基因的插入破壞了質粒載體的Tetr，故含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌不能在含有四環(huán)素的平板上生長，從而與僅含有質粒載體的大腸桿菌得以區(qū)分。(3)噬菌體是病毒，無細胞結構，無法自主合成DNA，需借助受體細胞完成DNA復制。 5．(2016年全國新課標Ⅲ卷)圖(a)中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內切酶的識別序列與切割位點，圖(b)為某種表達載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。 圖(a) 圖(b) 根據基因工程的有關知識，回答下列問題： (1)經BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被____________________酶切后的產物連接，理由是____________________________。 (2)若某人利用圖(b)所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖(c)所示。這三種重組子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產物的有____________，不能表達的原因是______________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 圖(c) (3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有____________和____________，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是____________。 【答案】(1)Sau3AⅠ　兩種酶切割后產生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙　甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉錄 (3)Ecoli DNA連接酶　T4DNA連接酶 T4DNA連接酶 【解析】(1)由題圖可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制性內切酶的共同識別序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此經BamHⅠ酶切得到的目的基因可以與圖(b)所示表達載體被Sau3AⅠ酶切后的產物連接。(2)在基因表達載體中，啟動子應位于目的基因的首端，終止子應位于目的基因的尾端，這樣目的基因才能順利地轉錄，再完成翻譯過程。圖中甲所示的目的基因插入在啟動子的上游，丙所示目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉錄，因此目的基因不能表達。(3)常見的DNA連接酶有Ecoli DNA連接酶和T4DNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。 6．(2016年江蘇卷)下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中標注了相關限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復標注。請回答下列問題： 圖1 圖2 (1)用圖中質粒和目的基因構建重組質粒，應選用__________________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過__________酶作用后獲得重組質粒。為了擴增重組質粒，需將其轉入處于________態(tài)的大腸桿菌。 (2)為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加________，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中____________________。 (3)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為________________________，對于該部位，這兩種酶______(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。 (4)若用Sau3AⅠ切圖1質粒最多可能獲得________種大小不同的DNA片段。 【答案】(1)BclⅠ和Hind Ⅲ　DNA連接　感受 (2)四環(huán)素　引物甲和引物丙 (3)　都不能　(4)7 【解析】(1)基因工程中選擇合適的限制酶切割質粒和目的基因時，應保留目的基因和至少一個標記基因結構的完整性，即遵循“目的基因切兩側，標記基因留一個”的基本原則，最好選擇切割產生不同末端的兩種限制酶同時切割質粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入帶來的不正常表達，因此據圖分析應選擇的限制酶為BclⅠ和Hind Ⅲ，切割后質粒上保留的四環(huán)素抗性基因作為標記基因。酶切后的載體和目的基因通過DNA連接酶的作用形成重組質粒，重組質粒需要導入Ca2＋處理后的處于感受態(tài)的大腸桿菌(處于感受態(tài)的大腸桿菌細胞膜的通透性大大增加，便于重組質粒進入)。(2)由上述分析可知，為了篩選出導入重組質粒的大腸桿菌，應先配制含四環(huán)素的選擇培養(yǎng)基，平板上長出的菌落為導入普通質粒或重組質粒的大腸桿菌菌落，進一步鑒定出導入重組質粒的大腸桿菌，可利用PCR擴增的方式，結合電泳技術來分析處理。DNA的兩條鏈是反向平行的，在PCR過程中，當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA聚合酶只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此應選擇引物甲和引物丙。(3)因為BclⅠ和Bam HⅠ酶切產生的黏性末端相同，所以可以被DNA連接酶連接，連接部位的6個堿基對序列為，但是連接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和Bam HⅠ的識別序列，連接部位不能被這兩種酶切開。(4)由圖可知，能被限制酶BclⅠ和Bam HⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ識別并切割，因此圖中質粒上存在3個Sau3AⅠ的切割位點，若將3個切割位點之間的DNA片段分別編號為a、b和c，則完全酶切(3個切割位點均被切割)會產生3種大小的DNA片段，即為a、b和c；考慮只切1個切割位點，有三種情況，都產生一種大小的DNA片段，即大小均為a＋b＋c；考慮切2個切割位點，則會產生a＋b、c、a＋c、b、b＋c、a幾種不同大小的DNA片段。綜上所述，若用Sau3AⅠ識別并切割圖中質粒，最多可獲得7種大小的DNA片段，即為a＋b＋c、a＋b、a＋c、b＋c、a、b、c。 7．(2016年天津卷)人血清白蛋白(HSA)具有重要的醫(yī)用價值，只能從血漿中制備。下圖是以基因工程技術獲取重組HSA(rHSA)的兩條途徑。 (1)為獲取HSA基因，首先需要采集人的血液，提取______合成總cDNA，然后以cDNA為模板，采用PCR技術擴增HSA基因。下圖中箭頭表示一條引物結合模板的位置及擴增方向，請用箭頭在方框內標出另一條引物的位置及擴增方向。 (2)啟動子通常具有物種及組織特異性，構建在水稻胚乳細胞內特異表達rHSA的載體，需要選擇的啟動子是______(填寫字母，單選)。 A．人血細胞啟動子　 B．水稻胚乳細胞啟動子 C．大腸桿菌啟動子　 D．農桿菌啟動子 (3)利用農桿菌轉化水稻受體細胞的過程中，需添加酚類物質，其目的是________________________________________________________________________。 (4)人體合成的初始HSA多肽，需要經過膜系統加工形成正確的空間結構才能有活性。與途徑Ⅱ相比，選擇途徑Ⅰ獲取rHSA的優(yōu)勢是__________________________________ ________________________________________________________________________。 (5)為證明rHSA具有醫(yī)用價值，須確認rHSA與________的生物學功能一致。 【答案】(1)總RNA(或mRNA) (2)B　(3)吸引農桿菌移向水稻受體細胞，有利于目的基因成功轉化　(4)水稻是真核生物，具有膜系統，能對初始rHSA多肽進行高效加工　(5)HSA 【解析】(1)總cDNA是由細胞內mRNA經逆轉錄獲得的。DNA兩條鏈是反向平行的，另一條引物擴增方向應向左。(2)據題意可知，啟動子具有物種特異性，它應與受體細胞啟動子一致，應選B。(3)在農桿菌轉化時，加入某物質，其目的應為“促進”或“有利于”轉化，推測酚類物質可吸引農桿菌侵染水稻受體細胞。(4)水稻是真核細胞，具有對分泌蛋白加工的內質網和高爾基體。Ⅱ途徑受體為大腸桿菌，沒有上述細胞器。(5)制備的rHSA應具有與HSA相同的生物學功能才具有醫(yī)用價值。 8．(2016年海南卷)基因工程又稱為DNA重組技術，回答相關問題： (1)在基因工程中，獲取目的基因主要有兩大途徑，即____________和從______________中分離。 (2)利用某植物的成熟葉片為材料，同時構建cDNA文庫和基因組文庫，兩個文庫相比，cDNA文庫中含有的基因數目比基因組文庫中的少，其原因是 ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)在基因表達載體中，啟動子是________聚合酶識別并結合的部位。若采用原核生物作為基因表達載體的受體細胞，最常用的原核生物是____________。 (4)將目的基因通過基因槍法導入植物細胞時，常用的攜帶目的基因的金屬顆粒有________和________顆粒。 【答案】(1)人工合成　生物材料 (2)cDNA文庫中只含有葉細胞已轉錄(或已表達)的基因，而基因組文庫中含有該植物的全部基因 (3)RNA　大腸桿菌(或細菌) (4)金粉　鎢粉 【解析】(1)獲取目的基因主要有兩大途徑，即人工合成和從自然界已有的物種中分離。(2)植物的成熟葉片中基因選擇性表達，因此由所有RNA逆轉錄形成的cDNA文庫中只含有葉細胞已轉錄(或已表達)的基因，而基因組文庫中含有該植物的全部基因。(3)在基因表達載體中，啟動子是RNA聚合酶識別并結合的部位。采用原核生物作為基因表達載體的受體細胞，由于易于培養(yǎng)，最常選用大腸桿菌(或細菌)。(4)將目的基因通過基因槍法導入植物細胞時，常用的攜帶目的基因的金屬顆粒有金粉和鎢粉顆粒。 9．(2015年全國新課標Ⅱ卷)已知生物體內有一種蛋白質(P)，該蛋白質是一種轉運蛋白，由305個氨基酸組成。如果將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，改變后的蛋白質(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性?；卮鹣铝袉栴}： (1)從上述資料可知，若要改變蛋白質的功能，可以考慮對蛋白質的______________進行改造。 (2)以P基因序列為基礎，獲得P1基因的途徑有修飾________基因或合成________基因。所獲得的基因表達時是遵循中心法則的，中心法則的全部內容包括______________的復制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即：_____________________________________。 (3)蛋白質工程也被稱為第二代基因工程，其基本途徑是從預期蛋白質功能出發(fā)，通過______________和__________，進而確定相對應的脫氧核苷酸序列，據此獲得基因，再經表達、純化獲得蛋白質，之后還需要對蛋白質的生物________進行鑒定。 【答案】(1)氨基酸序列(或結構) (2)P　P1　DNA和RNA(或遺傳物質)　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白質(或轉錄、逆轉錄、翻譯) (3)設計蛋白質的結構　推測氨基酸序列　功能 【解析】(1)蛋白質的功能與結構相關，若要改變蛋白質的功能，需要對其結構進行改造。(2)確定目的基因的堿基序列后，可通過對現有基因進行改造或者重新合成來獲得目的基因。中心法則的內容包括遺傳信息的復制、轉錄、逆轉錄和翻譯。(3)蛋白質工程的基本途徑是從預期蛋白質功能出發(fā)，通過設計蛋白質的結構和推測氨基酸序列，進而確定相對應的脫氧核苷酸序列。獲得蛋白質之后要對蛋白質的生物功能進行鑒定。 10．(2015年四川卷)將蘇云金桿菌Bt蛋白的基因導入棉花細胞中，可獲得抗棉鈴蟲的轉基因棉，其過程如圖所示(注：農桿菌中Ti質粒上只有T－DNA片段能轉移到植物細胞中)。 質粒中“Bt”代表Bt基因，“KmR”代表卡那霉素抗性基因 (1)過程①需用同種________________酶對含Bt基因的DNA和Ti質粒進行酶切。為將過程②獲得的含重組質粒的農桿菌篩選出來，應使用________培養(yǎng)基。 (2)過程③中將棉花細胞與農桿菌混合后共同培養(yǎng)，旨在讓________進入棉花細胞；除盡農桿菌后，還須轉接到含卡那霉素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，目的是_______________________ ________________________________________________________________________。 (3)若過程④僅獲得大量的根，則應在培養(yǎng)基中增加________________以獲得芽；部分接種在無激素培養(yǎng)基上的芽也能長根，原因是_______________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)檢驗轉基因棉的抗蟲性狀，常用方法是_______________________________。 種植轉基因抗蟲棉能減少________的使用，以減輕環(huán)境污染。 【答案】(1)限制性核酸內切　選擇 (2)T－DNA　篩選含有T－DNA片段的植物細胞 (3)細胞分裂素濃度　芽頂端合成的生長素向基部運輸，促進根的分化 (4)投放棉鈴蟲　農藥 【解析】本題考查基因工程與植物細胞工程的相關知識。(1)同種限制性核酸內切酶切割質粒和含目的基因的DNA，可獲得相同的黏性末端，以構建基因表達載體。重組質粒含完整的卡那霉素抗性基因，故應使用含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基篩選含重組質粒的農桿菌。(2)實驗過程中將棉花細胞與農桿菌混合后共同培養(yǎng)，其目的是利用含重組質粒的農桿菌將T－DNA導入棉花細胞中。除去農桿菌后在含卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其目的是篩選出含有目的基因的棉花細胞。(3)培養(yǎng)基中生長素用量與細胞分裂素用量比值高時，利于根的分化，抑制芽的形成，反之，有利于芽的分化，抑制根的形成。因芽頂端可合成生長素，故接種在無激素的培養(yǎng)基上的芽也能長根。(4)可用投放棉鈴蟲的方法檢測抗蟲棉的抗蟲效果。轉基因抗蟲棉的種植可減少農藥使用量，從而減輕環(huán)境污染。