PCR實(shí)用技巧 BIOX.CN 2005-5-13 9:37:19 來(lái)源：互聯(lián)網(wǎng) 　 增加PCR的特異性： 1.primersdesign 這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件 a.足夠長(zhǎng),18-24bp,以保證特異性.當(dāng)然不是說(shuō)越長(zhǎng)越好,太長(zhǎng)的引物同樣會(huì)降低特異性,并且降低產(chǎn)量 b.GC%40%~~~~60%c.5端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性 d.避免3端GCrich,最后3個(gè)BASE不要有GC,或者最后5個(gè)有3個(gè)不要是GC e.避免3端的互補(bǔ),否則容易造成DIMERf.避免3端的錯(cuò)配g.避免內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu) h.附加序列(RTsite,Promotersequence)加到5端,在算Tm值時(shí)不算,但在檢測(cè)互補(bǔ)和二級(jí)結(jié)構(gòu)是要加上它們 i.使用兼并引物時(shí),要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1uM-3uM) j.最好學(xué)會(huì)使用一種designsoftware.PP5,Oligo6,DNAstar,VectorNTI,Online　desginetal. *引物的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度.Tm對(duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。 設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來(lái)源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。 有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法。 根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會(huì)差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€(gè)估算的Tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)。可以通過(guò)分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開(kāi)始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。 為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對(duì)的Tm差異如果超過(guò)5℃，就會(huì)引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃ 或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。 2.stabilityofprimers 定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對(duì)于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。 引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因?yàn)樗膒H經(jīng)常偏酸，會(huì)引起寡核苷的水解。引物的穩(wěn)定性依賴(lài)于儲(chǔ)存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲(chǔ)存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個(gè)月。 3.optimizereactantsconcentration a.magnesiomions Mg離子的作用主要是dNTP-Mg與核酸骨架相互作用并能影響Polymerase的活性，一般的情況下Mg的濃度在0.5-5mM之間調(diào)整，同樣要記住的是在調(diào)整了dNTPs的濃度后要相應(yīng)的調(diào)整Mg離子的濃度，對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液 b.其他的離子 NH4+K+都會(huì)影響PCR，增加K+的濃度后,會(huì)因?yàn)橹泻土撕怂峁羌苌狭姿峄鶊F(tuán)的負(fù)電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的嚴(yán)謹(jǐn)性(stringency)，NH4+也有相同的作用.MBI公司的TAQ酶就提供了兩種BUFFER,一種是加Mg的一種是已經(jīng)混合了(NH4)2SO4的，當(dāng)然,過(guò)高的陽(yáng)離子濃度(KCL>0.2M)時(shí),DNA在94度根本不會(huì)發(fā)生變性,當(dāng)然也就無(wú)從談起PCR了. c.polymerase 不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度，一些高保真沒(méi)的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Taqpolymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.另外,一般的情況下,變性的溫度可以使用90~92度,變性的時(shí)間也可以縮短,從而保證polymerase的活性 d.template 50ulPCRSYSTEM ================================ humangDNA0.1ug-1ug E.Coli10ng-100ng LamadaDNA0.5ng-5ng PlasmidDNA0.1ng-10ng ================================ 4.termperature a.denaturation 常規(guī)是94度5分鐘,GCRich的摸板是95度5分鐘 除了GCRich外,常規(guī)的APPLICATIONS可以將這部分時(shí)間縮短到1到2分鐘,或者在CYCLE1時(shí)給予較長(zhǎng)的時(shí)間,而取消開(kāi)始的denaturation b.annealing 重點(diǎn)到了：一般情況下,是從55度開(kāi)始.根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進(jìn)行調(diào)整.有條件的可以做gradientpcr.退火的時(shí)間在30-60S,時(shí)間短一些可以得到更好的效果.因?yàn)?polymerase在annealingtemp.時(shí)也會(huì)有一些活性.所以在A.T.的時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)極大的增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)，另外,在對(duì)于一些困難戶(hù),比如從gDNA里擴(kuò)增大片段,還可使用twostepPCR. 5.touchdownPCR 原理很簡(jiǎn)單,但的確是一個(gè)很有用的方法。舉個(gè)例子，ANNEALINGTEMP.55度 945min9430s6030s721min2cycles9430s5930s 721min2cycles9430s5830s721min2cycles9430s 5130s721min2cycles9430s5030s 721min20cycles725min 6.hotstartPCR 熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管TaqDNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過(guò)程中，以及在熱循環(huán)剛開(kāi)始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)PCR尤為有效。 限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡(jiǎn)單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。 熱啟動(dòng)通過(guò)抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入TaqDNA聚合酶，在反應(yīng)體系達(dá)到90度時(shí)，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個(gè)方法過(guò)于煩瑣，尤其是對(duì)高通量應(yīng)用，并容易造成污染。其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，入鎂離子或酶，包裹起來(lái)，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開(kāi)。在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來(lái)并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。 ======================= ampliwaxPCRGems(PerkinElmer) TaqBeadHotStartPolymerase(Promega) Magnesiumwaxbeads(Stratagene). ========================= 象手動(dòng)熱啟動(dòng)方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。 還有一種方法是使用inactiveDNAPolymerase.polymerase被抗體抑制失活，當(dāng)變性溫度超過(guò)70度時(shí)，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。 7.BoosterPCR 我們知道1ughumangenomicDNA大約在3X105冪個(gè)模板分子,這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結(jié)合.當(dāng)模板的濃度過(guò)低,比如低于100個(gè)分子時(shí),引物和模板之間就很難發(fā)生反應(yīng).引物容易自身進(jìn)行反應(yīng)形成二聚體.這樣就有來(lái)了個(gè)boosterPCR我一直找不到合適的詞來(lái)翻譯這個(gè)booster. 具體是這樣的.開(kāi)始幾個(gè)cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的molarratio在107~108.以確保開(kāi)始擴(kuò)增的準(zhǔn)確性.然后boostePrimer的濃度到正常的水平 8.循環(huán)數(shù)和長(zhǎng)度 確定循環(huán)數(shù)的基本原理是:產(chǎn)物能夠保證你進(jìn)一步分析操作的最小循環(huán)數(shù).因?yàn)檫^(guò)多的循環(huán)數(shù)容易造成ERRORS和非特異性產(chǎn)物的積累產(chǎn)物的量不夠,優(yōu)化的方法有: 1.增加TEMPLATE 2.增加循環(huán)數(shù) 如何確定循環(huán)數(shù),有一個(gè)方法. 做一個(gè)PCR體系,40循環(huán),50ul,分別在20,25,30,35循環(huán)時(shí)從體系中取5ul,一起跑電泳分析.從而確定最佳的循環(huán)數(shù) 另一個(gè)會(huì)影響PCR特異性的是PCRcycling時(shí)在兩個(gè)溫度間變化的速率(rampingrate).當(dāng)然是越高越好.不過(guò)咱們大部分條件有限,就那么幾臺(tái)PCR儀,也沒(méi)有多少挑選的余地 9.thermalcycler PCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視.長(zhǎng)時(shí)間的使用后需要調(diào)整PCR儀,以保證其能夠到達(dá)正確的溫度.現(xiàn)在的PCR儀基本上都有自檢功能(self-diagnosis). 10.PCRadditives 附加物或者說(shuō)enhancer實(shí)在是多種多樣.基本上包括幾類(lèi),能夠增加反應(yīng)退火效率的化學(xué)因子,DNA結(jié)合蛋白和一些商業(yè)試劑.基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯(cuò)配,增加產(chǎn)物的長(zhǎng)度和產(chǎn)量. 在GCRich情況中,additive可以造成配對(duì)堿基間的的不穩(wěn)定,從而提高擴(kuò)增的效率.而在另一種情況下,additive由于造成錯(cuò)配的primer-template復(fù)合物的極大的不穩(wěn)定,而提高了擴(kuò)增的忠實(shí)性.要注意的是,沒(méi)有萬(wàn)能的enhancer全部通用,需要你根據(jù)自己的情況,最好結(jié)合gradientpcr選擇最優(yōu)條件. ==================================================== dimethylsulfoxide(DMSO)upto10% formamideat5% trimethylammoniumchloride10-100uM detergentssuchasTween200.1-2.5% polyethyleneglycol(PEG)60005-15% glycerol10-15% singlestrandedDNAbindingproteins Gene32protein1nM E.colisingle-strandedDNAbindingprotein5uM 7deaza-dGTP(forGCrich)150uMwith50uMdGTP TaqExtender(stratagene) PerfectMatchPCREnhancer(stratagene) Q-solution(Qiagen) ==================================================== 要注意的是,DMSO,GLYCEROL等會(huì)抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最適的濃度 11.TemplateDNApreparation 提取DNA時(shí)的試劑會(huì)抑制PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行.因此需要對(duì)TEMPLATEDNA進(jìn)行純化.特別是SDS(<0.01%)的情況下就能強(qiáng)烈抑制PCR的進(jìn)行.可以加入一些nonionic試劑,如Tween,Nonid,Trition之類(lèi)的反過(guò)來(lái)抑制SDS.還有proteinaseK也要除干凈,不然會(huì)降解polymerase. 12.NestedPCR 簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,一對(duì)是長(zhǎng)的,一對(duì)是包含在長(zhǎng)引物內(nèi)的,用長(zhǎng)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物作為第二次擴(kuò)增的模板,這樣可以增加產(chǎn)物的量.而且可以減少非特異性帶和錯(cuò)配的情況. 增加PCR的保真性 高保真酶 高溫DNAPOLYMERASE是以單鏈DNA或RNA為模板，在dNTP和一些陽(yáng)離子的存在情況下，在特定的引物指導(dǎo)下按3-5方向合成DNA.包括3種類(lèi)型 a.5-3方向的DNA合成能力,沒(méi)有3-5方向的外切酶特性.如Taq及其突變體.這類(lèi)酶的合成能力強(qiáng),因?yàn)樗患m正合成中出現(xiàn)的突變 b.與a類(lèi)似,有合成活性,沒(méi)有3-5的外切活性.但他們能以RNA為模板,合成DNA.如TthDNAPolymerase c.有DNA聚合活性,沒(méi)有逆轉(zhuǎn)錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfuDNAPolymerase.可以提高忠實(shí)性。但是這些聚合酶的產(chǎn)量比TaqDNA聚合酶低。 酶的混合物 將TaqDNA聚合酶同帶有3到5外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨(dú)TaqDNA聚合酶高的忠實(shí)性，并可以得到高產(chǎn)量及擴(kuò)增長(zhǎng)模板。 其他因素 除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會(huì)降低忠實(shí)性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加精確度如果四種核苷的濃度不同，忠實(shí)性會(huì)受影響。進(jìn)行較少的PCR循環(huán)也會(huì)有助于增加忠實(shí)性，因?yàn)樵黾友h(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長(zhǎng)度就會(huì)增加突變可能性。 1．簡(jiǎn)介 寡聚核苷酸引物的選擇，通常是整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)成功的關(guān)鍵。所選的引物序列將決定PCR產(chǎn)物的大小、位置、以及擴(kuò)增區(qū)域的Tm值這個(gè)和擴(kuò)增物產(chǎn)量有關(guān)的重要物理參數(shù)。好的引物設(shè)計(jì)可以避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，甚至在RNA-PCR中也能識(shí)別cDNA或基因組模板。引物設(shè)計(jì)也極大的影響擴(kuò)增產(chǎn)量：若使用設(shè)計(jì)粗糙的引物，產(chǎn)物將很少甚至沒(méi)有；而使用正確設(shè)計(jì)的引物得到的產(chǎn)物量可接近于反應(yīng)指數(shù)期的產(chǎn)量理論值。當(dāng)然，即使有了好的引物，依然需要進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，比如調(diào)整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。 計(jì)算機(jī)輔助引物設(shè)計(jì)比人工設(shè)計(jì)或隨機(jī)選取更有效。一些影響PCR反應(yīng)中引物作用的因素諸如溶解溫度、引物間可能的同源性等，易于在計(jì)算機(jī)軟件中被編碼和限定。計(jì)算機(jī)的高速度可完成對(duì)引物位置、長(zhǎng)度以及適應(yīng)用戶(hù)特殊條件的其他有關(guān)引物的變換可能性的大量計(jì)算。通過(guò)對(duì)成千種組合的檢測(cè)，調(diào)整各項(xiàng)參數(shù)，可提出適合用戶(hù)特殊實(shí)驗(yàn)的引物。因此通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件選擇的引物的總體“質(zhì)量”（由用戶(hù)在程序參數(shù)中設(shè)定）保證優(yōu)于通過(guò)人工導(dǎo)出的引物。 需要指出的是，引物不必與模板完全同源，因此可包含啟動(dòng)子序列、限制酶識(shí)別位點(diǎn)或5’端的各種修飾，這種對(duì)引物的修飾不會(huì)妨礙PCR反應(yīng)，而會(huì)在以后使用擴(kuò)增子時(shí)發(fā)揮作用。 2．基本PCR引物設(shè)計(jì)參數(shù) 引物設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。特異性是指發(fā)生錯(cuò)誤引發(fā)的頻率。特異性不好或劣等的引物會(huì)產(chǎn)生額外無(wú)關(guān)和不想要的PCR擴(kuò)增子，在EB染色的瓊脂糖凝膠上可見(jiàn)到；引物效率是指在每一PCR循環(huán)中一對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物與理論上成倍增長(zhǎng)量的接近程度。 ①引物長(zhǎng)度； 特異性一般通過(guò)引物長(zhǎng)度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫度設(shè)置在近于引物Tm值（引物/模板雙鏈體的解鏈溫度）幾度的范圍內(nèi)，18到24個(gè)堿基的寡核苷酸鏈?zhǔn)怯泻芎玫男蛄刑禺愋缘摹Ｒ镌介L(zhǎng)，擴(kuò)增退火時(shí)被引發(fā)的模板越少。為優(yōu)化PCR反應(yīng)，使用確保溶解溫度不低于54℃的最短的引物，可獲得最好的效率和特異性。 總的來(lái)說(shuō)，最好在特異性允許的范圍內(nèi)尋求安全性。每增加一個(gè)核苷酸，引物特異性提高4倍；這樣，大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸。引物設(shè)計(jì)時(shí)使合成的寡核苷酸鏈（18～24聚物）適用于多種實(shí)驗(yàn)條件仍不失為明智之舉。 ②引物的二級(jí)結(jié)構(gòu) 包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會(huì)影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對(duì)于引物的3’末端形成的二聚體，應(yīng)控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三個(gè)連續(xù)的堿基互補(bǔ)，因?yàn)榇朔N情形的引物二聚體有進(jìn)一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性，引物中間或5’端的要求可適當(dāng)放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，也以3’端或近3’端對(duì)引物-模板結(jié)合影響更大；影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補(bǔ)配對(duì)的鍵能之外，與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免3’末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。 ③引物GC含量和Tm值 PCR引物應(yīng)該保持合理的GC含量。含有50％的G+C的20個(gè)堿基的寡核苷酸鏈的Tm值大概在56～62℃范圍內(nèi)，這可為有效退火提供足夠熱度。一對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。協(xié)調(diào)性差的引物對(duì)的效率和特異性都較差，因?yàn)榻档土薚m值導(dǎo)致特異性的喪失。這種情況下引物Tm值越高，其錯(cuò)誤引發(fā)的機(jī)率也越大。若采用太高的退火溫度，Tm值低的引物對(duì)可能完全不發(fā)揮作用。在從一批在特定序列范圍內(nèi)已合成好的寡核苷酸中選擇一對(duì)新的引物時(shí)，這種GC含量和Tm值的協(xié)調(diào)非常關(guān)鍵。一般來(lái)說(shuō)，一對(duì)引物的Tm值相差盡量不超過(guò)2～3攝氏度，同時(shí)引物和產(chǎn)物的Tm值也不要相差太大，20攝氏度范圍內(nèi)較好。 ④引物的額外序列與退火溫度 若有額外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、限制酶切位點(diǎn)或者GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以使用加長(zhǎng)的引物。一般說(shuō)來(lái)，引物5’端添加無(wú)關(guān)序列不會(huì)影響引物特異序列的退火。有時(shí)候，引物中添加了大量與模板不配對(duì)的堿基，可以在較低退火溫度的條件下進(jìn)行4到5個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；然后在假定引物5’端序列已經(jīng)加入到模板中，計(jì)算得出的退火溫度下進(jìn)行其余的循環(huán)。 在引物上添加限制酶位點(diǎn)時(shí)一個(gè)重要的考慮是大多數(shù)限制酶的有效切割要求在它們的識(shí)別序列的5’端有2至3個(gè)非特異的額外堿基，這樣就會(huì)增加引物的非模板特異序列的長(zhǎng)度。長(zhǎng)引物序列的另一個(gè)缺點(diǎn)是影響溶解溫度的精確計(jì)算，而這對(duì)于確定PCR反應(yīng)時(shí)的退火溫度又是必須的。對(duì)于低于20個(gè)堿基的引物，Tm值可以根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)計(jì)算。而對(duì)于較長(zhǎng)的引物，Tm值需要考慮動(dòng)力學(xué)參數(shù)、從“最近鄰位”的計(jì)算方式得到，現(xiàn)有的PCR引物設(shè)計(jì)軟件大多數(shù)都采用這種方式。 ⑤引物的3’末端核苷酸組成 引物3’末端和模板的堿基完全配對(duì)對(duì)于獲得好的結(jié)果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6個(gè)核苷酸的錯(cuò)配應(yīng)盡可能的少。如果3’末端的錯(cuò)配過(guò)多，通過(guò)降低反應(yīng)的退火溫度來(lái)補(bǔ)償這種錯(cuò)配不會(huì)有什么效果，反應(yīng)幾乎注定要失敗。 引物3’末端的另一個(gè)問(wèn)題是防止一對(duì)引物內(nèi)的同源性。應(yīng)特別注意引物不能互補(bǔ)，尤其是在3’末端。引物間的互補(bǔ)將導(dǎo)致不想要的引物雙鏈體的出現(xiàn)，這樣獲得的PCR產(chǎn)物其實(shí)是引物自身的擴(kuò)增。這將會(huì)在引物雙鏈體產(chǎn)物和天然模板之間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)PCR狀態(tài)，從而影響擴(kuò)增成功。 引物3’末端的穩(wěn)定性由引物3’末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個(gè)堿基的ΔG。此值的大小對(duì)擴(kuò)增有較大的影響，負(fù)值大，則3’末端穩(wěn)定性高，擴(kuò)增效率更高，同時(shí)也更易于異位引發(fā)。 需要注意的是，引物3’末端應(yīng)盡量避免T。實(shí)驗(yàn)證明，以T結(jié)尾的引物即使與T,G或C錯(cuò)配仍可有效延伸。 ⑥PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度及在耙序列內(nèi)的位置 所有的計(jì)算機(jī)程序都提供對(duì)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍的選擇。一般說(shuō)來(lái)，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度對(duì)擴(kuò)增效率有影響。特定的應(yīng)用情況下，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度部分取決于模板材料。 預(yù)期產(chǎn)物的特定長(zhǎng)度經(jīng)常取決于應(yīng)用的需要。若目的是建立測(cè)定特異DNA片段的臨床檢驗(yàn)方法，120～300bp的小DNA擴(kuò)增產(chǎn)物可能是最好的。產(chǎn)物應(yīng)具有好的特異性和高的產(chǎn)生效率，并含有能用于探針捕捉雜交實(shí)驗(yàn)的足夠信息。這一長(zhǎng)度范圍的產(chǎn)物可以通過(guò)采用兩步擴(kuò)增循環(huán)方法得到，從而減少擴(kuò)增時(shí)間。 其他PCR方法有不同的最佳產(chǎn)物長(zhǎng)度。例如，通過(guò)定量的RNA-PCR檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)，產(chǎn)物應(yīng)該足夠大以便構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)性模板，這樣，產(chǎn)物和競(jìng)爭(zhēng)物都能夠在凝膠上很容易的分辨出來(lái)。這些產(chǎn)物一般在250～750bp范圍內(nèi)。 ⑦補(bǔ)充說(shuō)明 若在cDNA序列內(nèi)找尋PCR引物，需特別注意兩點(diǎn)：首先，盡力將引物和產(chǎn)物保持在mRNA的編碼區(qū)域內(nèi)，因?yàn)檫@是生成蛋白質(zhì)的獨(dú)特序列，不像3’末端非編碼區(qū)域與許多其他mRNA有同源性；第二，盡力把引物放在不同的外顯子上，以便使RNA特異的PCR產(chǎn)物與從污染DNA中產(chǎn)生的產(chǎn)物在大小上相區(qū)別。 若PCR的目的是克隆一個(gè)基因或cDNA的特異序列，產(chǎn)物的大小是根據(jù)具體應(yīng)用預(yù)選的。在這里，計(jì)算機(jī)程序可以提供關(guān)于期望區(qū)域側(cè)翼選擇引物對(duì)的信息。 在選擇用來(lái)擴(kuò)增來(lái)自不同物種DNA的引物時(shí)，應(yīng)避開(kāi)mRNA的5’和3’末端非翻譯區(qū)序列，因?yàn)樗鼈兛赡軟](méi)有任何的同源性。 3．簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì) ①設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物時(shí)，一定要檢查靶擴(kuò)增區(qū)域選定氨基酸遺傳密碼的簡(jiǎn)并度。很顯然，我們期望選擇簡(jiǎn)并度最低的氨基酸，達(dá)到提高特異性的目的。 ②充分注意物種對(duì)于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡(jiǎn)并性。 ③應(yīng)努力避免3’末端的簡(jiǎn)并，對(duì)于大多數(shù)氨基酸殘基來(lái)說(shuō)，意味著引物3’末端不要位于密碼子的第三位。 ④在一些多義位置使用脫氧次黃嘌呤（dI）代替簡(jiǎn)并堿基。 4．測(cè)序引物設(shè)計(jì) 當(dāng)然，測(cè)序引物的設(shè)計(jì)一般都由測(cè)序公司來(lái)完成，如果需要自己設(shè)計(jì)的話；那么除了按照上面所提到的引物設(shè)計(jì)通用標(biāo)準(zhǔn)外，還需要注意兩點(diǎn)： ①測(cè)序引物的特異性的標(biāo)準(zhǔn)掌握應(yīng)該更嚴(yán)格一些，也就是說(shuō)設(shè)計(jì)時(shí)更優(yōu)先考慮特異性。因?yàn)樵跍y(cè)序反應(yīng)中，如果引物與模板在非預(yù)期位置退火并引發(fā)鏈延伸，會(huì)對(duì)結(jié)果對(duì)來(lái)很大的干擾甚至造成結(jié)果無(wú)法識(shí)讀。 ②測(cè)序引物的Tm值適當(dāng)高一些?，F(xiàn)在大部分測(cè)序反應(yīng)均選用耐熱的測(cè)序級(jí)DNA聚合酶來(lái)催化，并采用PCR的熱循環(huán)程序。選用的測(cè)序引物的Tm值稍高一些，有助于使反應(yīng)順利跨過(guò)待測(cè)模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)，也有助于降低非特異反應(yīng)。 5．探針的設(shè)計(jì) 探針的設(shè)計(jì)，根據(jù)不同的用途各有其設(shè)計(jì)特點(diǎn)，這里只是就通用的原則進(jìn)行討論： ①探針的長(zhǎng)短一般在20-50核苷酸之間，過(guò)長(zhǎng)合成成本高，且易出現(xiàn)聚合酶合成錯(cuò)誤，雜交時(shí)間長(zhǎng)。太短則特異性下降。 ②注意G和C的含量努力控制在40-60％，同時(shí)一種堿基連續(xù)重復(fù)不超過(guò)4個(gè)，以免非特異性雜交產(chǎn)生。 ③探針自身序列不能形成二聚體，也不能有“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)存在，這一點(diǎn)上的要求就要比普通引物設(shè)計(jì)嚴(yán)格得多。 ④如果探針地靶目標(biāo)是多個(gè)基因的混合物，就必須控制該探針與無(wú)關(guān)基因之間的相似性在70%以下。 PCR中常見(jiàn)問(wèn)題分析與對(duì)策． PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間 一般認(rèn)為PCR產(chǎn)物應(yīng)在48h以?xún)?nèi)完成電泳檢測(cè)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型就會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則，甚至消失。