大鼠大腦皮層星形膠質細胞原代培養(yǎng)及傳代 南京軍區(qū)總院神經(jīng)內科實驗室 許麗麗 2012-12-01 一、試劑 1) Poly-L-lysine（Sigma,P2636） 2) DMEM（Invitrogen,11995-065） 3) FBS（Invitroge,10099-141） 4) HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112） 5) 0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056） 6) DPBS（HyClone，SH30028.01B） 7) dd H2O 8) 75％酒精 二、器械 1) 手術器械：眼科剪x2、眼科鑷直、彎各x2、顯微鑷x2（金鐘，WA3050）、顯微剪x1 2) 100 ml小燒杯 3) 200目不銹鋼篩 4) 細胞計數(shù)器（求精） 5) 50ml離心管（Corning，430828）、15ml離心管（Corning，430790） 6) 25ml培養(yǎng)瓶（Corning，430639）或75ml培養(yǎng)瓶（Corning，430641） 7) 100ml玻璃瓶（蜀牛） 8) 直徑為60mm的培養(yǎng)皿（LabServ,310109010） 9) 3ml移液管（Biologix, 30-0138A1） 10) 過濾器（Millex-GP, SLGP033RB） 11) 注射器：50ml、5ml各 1 12) Pipette and pipette tips 13) 冰袋、手套、口罩 Day 1 1、消毒 1.1 將解剖器械、槍頭高溫高壓消毒15分鐘，消毒結束后放入烘箱中烘干待第二天使用。 1.2 打開操作臺紫外線燈消毒30分鐘。 2、包被培養(yǎng)板 2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作臺、移液槍，點燃酒精燈。 2.2 取PLL，用DPBS將其稀釋至100μg/ml。 2.3 以PLL包被培養(yǎng)瓶，量以覆蓋培養(yǎng)瓶底面為宜。25ml培養(yǎng)瓶：3ml；75ml培養(yǎng)瓶：8ml。過夜。 3、配置培養(yǎng)基、消化酶 3.1 DMEM with 10% FBS FBS：DMEM=1：10 取FBS 8ml、DMEM 80ml加入100ml高溫高壓過的玻璃瓶中。 3.2 0.125％胰酶 取0.25％Trypsin-EDTA,用DPBS稀釋2倍。 將配置好的培養(yǎng)基、消化酶放入4C冰箱中，待第二天使用。 4、消毒 操作臺使用完畢后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作臺、移液槍，關閉酒精燈，打開紫外線燈消毒30分鐘。 Day 2 1、消毒 打開操作臺紫外線燈消毒30分鐘。 2、洗板 用ddH2O洗滌3 x 5 min，放入培養(yǎng)箱中晾干。 3、解剖新生鼠（所有操作在冰袋上進行） 3.1 將出生24小時之內的新生鼠在100ml燒杯中用75%酒精浸泡5min。 3.2戴手套，用酒精棉球擦拭操作臺、移液槍，點燃酒精燈。 3.3 取2個培養(yǎng)皿，內乘HBSS，放置在冰袋上。 3.4 剪去新生鼠的頭，將頭放入一個培養(yǎng)皿中。 3.5 用眼科剪把新生鼠頭骨剪開，取出腦組織，將腦組織放入另一乘HBSS的培養(yǎng)皿中（將所有的新生鼠都同樣處理）。 3.6 用兩支顯微鑷分離腦膜，盡可能的去掉所有的血管和血管膜，將分離好的腦組織放入另一新的內乘HBSS的培養(yǎng)皿中。 3.7 將分離好的腦膜用顯微剪剪碎腦組織，約1mm3。 4、接種細胞 4.1 用移液管將剪碎的腦組織移入兩個15 ml離心管中。 4.2 每支離心管加入3 ml 0.125％胰酶，搖勻，37℃消化15分鐘（為增加接觸面積消化更充分可將離心管平放，也可以用60 mm培養(yǎng)皿消化。） 4.3 消化期間整理操作臺。 4.4 消化15min后，用移液管除去胰酶，每支離心管加入2 ml 10％ FBS/DMEM終止消化。 4.5 吹打：用1 ml槍頭，吹打40次，靜止2分鐘，將上面液體移入一新的15ml離心管中。下面沉淀的細胞團塊不要丟棄，加入1-1.5ml10％ FBS/DMEM吹打20次，重復上面的步驟。一共這樣分次吹打3次。3次之后如果還有團塊在下面，果斷丟棄。（吹打時候要注意，切忌過快，要緩慢吹打。吸入時候要很緩慢，吹出的時候可以略快，但是也要緩慢。） 4.6 過篩網(wǎng)至60 mm培養(yǎng)皿中。 4.7 將培養(yǎng)皿中液體移入2支15 ml離心管中。 4.8 離心：800g/min,5min。 4.9 棄上清，沉淀的細胞加10％FBS/DMEM 3ml重懸，輕柔吹打100次（具體吹打次數(shù)據(jù)細胞計數(shù)時看到的情況而定，若看到大量細胞團，應加大吹打次數(shù)）。 4.10 用細胞計數(shù)板計數(shù)：細胞濃度 = (4個大格細胞總數(shù)/4) 104 /ml 4.11 調濃度，接種。接種后搖晃培養(yǎng)板搖勻細胞（注意不要圈圈搖晃，圈圈搖晃會導致神經(jīng)元都集中到培養(yǎng)板的孔中間，導致濃度不均，生長不均勻。要左右平行翻轉角度，然后前后平行翻轉角度）。 具體細胞接種數(shù)值： 培養(yǎng)液體積（ml/瓶） 細胞密度（個/ml） 總細胞數(shù)（個/瓶） 25cm2培養(yǎng)瓶 4ml 1x106 4x106 75 cm2培養(yǎng)瓶 15ml 1x106 6-8x106 5、消毒 實驗結束后清理垃圾，清洗器械，用酒精棉球擦拭操作臺、移液槍，關閉酒精燈，打開紫外線燈消毒30分鐘。 6、換液 細胞種植成功后24小時全量換液，以后每天觀察細胞生長狀態(tài)，每 3天半量換液。注意：換液前要將10%FBS/DMEM放入37℃細胞培養(yǎng)箱中預熱半小時。 7、傳代 7.1待細胞長到第10天或看到細胞細胞爬滿培養(yǎng)瓶的90%左右時，在37℃恒溫搖床200g/min震蕩12-14小時，全量換液。 7.2震蕩過后，棄培養(yǎng)基，DPBS洗滌2-3次，加入適量0.25%胰酶，37℃消化1-3min（以鏡下看到細胞突觸回縮為最佳）。 7.3加入2ml培養(yǎng)基中和胰酶，用移液管輕輕吹打細胞壁，使貼壁細胞脫落。 7.4將培養(yǎng)基移入15ml離心管中，200g/min離心5min，棄上清。 7.5加入新的培養(yǎng)基，吹打100次，使細胞散開。 7.6將細胞移入培養(yǎng)皿中，孵箱培養(yǎng)10-15min后，將皿中培養(yǎng)液移至新的培養(yǎng)瓶中（不用包被）。 7.7每天觀察細胞生長狀態(tài)，每3天半量換液，待細胞爬滿培養(yǎng)瓶的90%左右，可繼續(xù)傳代或消化后將細胞接種在爬片中，進行下一步實驗。