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1、硼酸鹽對(duì)馬鈴薯干腐病菌的抑制特性研究 學(xué)生科研訓(xùn)練計(jì)劃（SRTP） 項(xiàng)目論文 項(xiàng)目名稱：培養(yǎng)條件對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響 主 持 人： 李夏妮 所在學(xué)院： 食品科學(xué)與工程學(xué)院 專業(yè)年級(jí)： 生物工程08級(jí) 指導(dǎo)教師： 李永才 副教授 學(xué)生科研訓(xùn)練計(jì)劃（SRTP）項(xiàng)目管理辦公室 二О一二年四月

2、 目錄 前言 2 1 材料與方法 3 1.1 材料 3 1.2 方法 3 1.2.1培養(yǎng)基制作 3 1.2.2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 3 1.2.3酶液的制備 3 1.2.4 PG（多聚半乳糖醛酸酶）的測(cè)定 4 1.2.5 PMG（果膠甲基半乳糖醛酸酶 ）的測(cè)定 4 1.2.6 Cx（纖維素酶）的測(cè)定 4 1.2.7β-葡萄糖苷酶的測(cè)定 4 1.2.8結(jié)果統(tǒng)計(jì) 4 2 結(jié)果與分析 4 2.1 PH值對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響 4 2.1.1 PH對(duì)PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性的影響 5 2.1.2 PH對(duì)PMG（果膠甲基半乳糖醛酸酶）活性的影響 5 2.1.3

3、PH對(duì)Cx（纖維素酶）活性的影響 6 2.1.4 PH對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響 6 2.2培養(yǎng)時(shí)間對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響 7 2.2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性的影響 7 2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PMG（果膠甲基半乳糖醛酸酶）活性的影響 7 2.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Cx（纖維素酶）活性的影響 8 2.2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響 8 2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響 9 2.3.1 培養(yǎng)溫度對(duì)PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性的影響 9 2.3.2 培養(yǎng)溫度對(duì)PMG（果膠甲基半乳糖醛酸酶）活性的影響 9 2.3.3 培養(yǎng)溫

4、度對(duì)Cx（纖維素酶）活性的影響 10 2.3.4培養(yǎng)溫度對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響 10 3 討論 11 4 結(jié)論 11 參考文獻(xiàn) 12 培養(yǎng)條件對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶影響的研究 李夏妮 （甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 蘭州 730070） 摘要：本文通過體外試驗(yàn)，研究了不同培養(yǎng)條件（溫度、pH）和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)馬鈴薯干腐病菌主要細(xì)胞壁降解酶活性的影響。結(jié)果表明，不同培養(yǎng)條件及時(shí)間對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶具有一定的影響。除β-葡萄糖苷酶（最佳 pH 8）外，多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和纖維素酶（Cx）均在pH 6 的條

5、件下活性最高；對(duì)溫度而言，各種細(xì)胞壁降解酶在23-25 ℃下活性最高，低溫對(duì)具有抑制作用；PG、PMG和Cx均在培養(yǎng)前期（第2d）活性最大，而β-葡萄糖苷酶在培養(yǎng)3d時(shí)活性最大，各種酶隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)其活性均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。 因此可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件來抑制病原物的主要致病因子—細(xì)胞壁降解酶的活性，從而有效地控制馬鈴薯塊莖干腐病。 關(guān)鍵詞：馬鈴薯；硫色鐮刀菌；細(xì)胞壁降解酶；培養(yǎng)條件 前言 馬鈴薯是我國(guó)北方的重要經(jīng)濟(jì)作物，甘肅省作為我國(guó)馬鈴薯生產(chǎn)的最佳適宜區(qū)之一，目前全省馬鈴薯種植面積擴(kuò)大到746萬(wàn)畝，居內(nèi)蒙古自治區(qū)之后，列全國(guó)第二；總產(chǎn)量達(dá)到755萬(wàn)噸，居全國(guó)第一[1]。馬鈴薯的種植、

6、發(fā)展越來越引起人們的重視。但是近年來，馬鈴薯貯藏期腐爛問題也日漸突出。據(jù)調(diào)查造成爛窖的主要原因是塊莖攜帶病菌。雖然馬鈴薯塊莖病害有15多種，但是其中Fusarium solani和晚疫病復(fù)合侵染或Fusarium solani誘發(fā)侵染是導(dǎo)致爛窖的主體，有調(diào)查顯示，馬鈴薯貯藏期間，平均病薯率為27.59%，其中88.5%為黑色干腐病型病薯[2]。最終導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)和商品性降低，對(duì)生產(chǎn)者造成極大的損失。 干腐病又名“干腐爛”，染病塊莖長(zhǎng)白色至灰色絨毛物，內(nèi)部薯肉則呈灰褐色至深褐色病變，有的出現(xiàn)空心，空腔內(nèi)充滿菌絲體，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)塊莖僵縮或呈干腐狀，不能食用[3]。干腐病是由鐮刀菌（Fusarium

7、 spp.）[4]所致病的。干腐病是限制馬鈴薯產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的主要采后病害之一，貯藏期間其發(fā)病率高達(dá)30%。目前主要利用化學(xué)殺菌劑進(jìn)行控制，然而化學(xué)殺菌劑的大量使用不僅會(huì)產(chǎn)生環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題，也會(huì)導(dǎo)致病原物產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致了抗藥菌株的產(chǎn)生，使其使用受到越來越多的限制，因而，必須尋求新的安全高效的防腐劑，以逐步取代和減少化學(xué)殺菌劑使用[5]。 病原物產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶（果膠甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶等多種細(xì)胞壁降解酶）在侵入和定殖寄主組織中產(chǎn)生了重要作用，是其主要的致病因子之一[6]。研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)\條件對(duì)酶的產(chǎn)生及活性具有一定的影響，故而本試驗(yàn)以馬鈴薯干腐病菌(Fusarium sulphu

8、reum)為研究對(duì)象，系統(tǒng)研究培養(yǎng)條件(溫度,pH等)對(duì)馬鈴薯干腐病菌(F. sulphureum)產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶種類、活性的影響。進(jìn)而了解不同培養(yǎng)條件下馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶產(chǎn)生的情況，對(duì)有的放矢的進(jìn)行病害控制具有十分重要的意義。 本研究通過體外試驗(yàn)，研究培養(yǎng)條件(溫度，pH)和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)馬鈴薯干腐病菌主要細(xì)胞壁降解酶產(chǎn)生的影響，以期為馬鈴薯干腐病的防治提供新的方法。 1 材料與方法 1.1 材料 馬鈴薯干腐病菌（Fusarium sulphureum ） 超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD）、恒溫培養(yǎng)搖床（THZ-100）、電冰箱（BCD-196TX）、分光光度計(jì)（

9、UV-2450）、巴氏滅菌鍋（YX-280B）、恒溫水浴鍋（HWS24）、烘箱、電磁爐 1.2 方法 1.2.1培養(yǎng)基制作 參照方中達(dá) [9]法進(jìn)行。制作馬鈴薯水瓊脂培養(yǎng)基(PDB)，培養(yǎng)基成分：馬鈴薯250g，蒸餾水1000mL。將馬鈴薯切碎，大約1cm的小方塊，加水煮沸30min后用四層紗布過濾并定容至1000mL。分裝在三角瓶(每個(gè)三角瓶瓶子裝100mL培養(yǎng)基)中進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后制備平板PDB。 1.2.2 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 配置一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，按照3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定還原糖的方法，在540nm 處測(cè)定吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 1.2.3

10、酶液的制備 將培養(yǎng)的5個(gè)硫色鐮刀菌菌柄擴(kuò)于100mL經(jīng)滅菌后的培養(yǎng)基中在三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)數(shù)天后將三角瓶中培養(yǎng)的菌培養(yǎng)液真空抽濾，置濾液于離心管中離心10min備用。 1.2.4多聚半乳糖醛酸酶（PG）的測(cè)定 取兩只具塞刻度試管，每只試管中都分別加入1.0mL50mmol/L,PH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液和0.5mL10g/L的 PG溶液，往其中一只試管中加0.5mL酶液，另一只試管中加0.5mL蒸餾水作為對(duì)照，混勻后置于37℃水浴中保溫反應(yīng)1h。保溫后，迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加熱5min,然后迅速冷卻至室溫，加8mL蒸餾水稀釋，混勻。在波長(zhǎng)540nm處按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲

11、線的方法比色，測(cè)定各試管中溶液的吸光度值。重復(fù)三次。 1.2.5 果膠甲基半乳糖醛酸酶（PMG）的測(cè)定 取兩只具塞刻度試管，每只試管中都分別加入1.0mL50mmol/L,PH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液和0.5mL10g/L的果膠溶液，往其中一只試管中加0.5mL酶液，另一只試管中加0.5mL蒸餾水作為對(duì)照，混勻后置于37℃水浴中保溫反應(yīng)1h。保溫后，迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加熱5min,然后迅速冷卻至室溫，加8mL蒸餾水稀釋，混勻。在波長(zhǎng)540nm處按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法比色，測(cè)定各試管中溶液的吸光度值。重復(fù)三次。 1.2.6纖維素酶（Cx）的測(cè)定 取兩只具塞刻度

12、試管，每只試管中都分別加入1.5mL10g/L的CMC（羧甲基纖維素）溶液，往其中一只試管中加0.5mL酶液，另一只試管中加0.5mL蒸餾水作為對(duì)照，混勻后置于37℃水浴中保溫反應(yīng)1h。保溫后，迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加熱5min,然后迅速冷卻至室溫，加8mL蒸餾水稀釋，混勻。在波長(zhǎng)540nm處按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法比色，測(cè)定各試管中溶液的吸光度值。重復(fù)三次。 1.2.7 β-葡萄糖苷酶的測(cè)定 取兩只具塞刻度試管，每只試管中都分別加入1.5mL10g/L的水楊苷溶液，往其中一只試管中加0.5mL酶液，另一只試管中加0.5mL蒸餾水作為對(duì)照，混勻后置于37℃水浴中保溫反應(yīng)1

13、h。保溫后，迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加熱5min,然后迅速冷卻至室溫，加8mL蒸餾水稀釋，混勻。在波長(zhǎng)540nm處按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法比色，測(cè)定各試管中溶液的吸光度值。重復(fù)三次 1.2.8結(jié)果統(tǒng)計(jì) 所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差（±SE）并作圖。 2 結(jié)果與分析 2.1 pH值對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響 2.1.1 pH對(duì)PG活性的影響 圖1 不同pH對(duì)F. sulphureum PG 酶活性的影響 由圖1可見，不同pH的培養(yǎng)液對(duì)F. sulphureum PG活性的影響存在差異，其中pH為6時(shí)其活性最大，pH為8時(shí)PG活性

14、最低。當(dāng)pH大于6時(shí)，其活性呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)。 2.1.2 PH對(duì)PMG活性的影響 圖2 不同pH對(duì)F. sulphureum PMG 酶活性的影響 由圖2可見，不同pH的培養(yǎng)液對(duì)F. sulphureum PMG活性表現(xiàn)出不同的影響，當(dāng)pH大于6時(shí)，其活性呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)，其中pH為6時(shí)，PMG活性最大，pH為8時(shí)PMG（果膠甲基半乳糖醛酸酶）活性最低。 2.1.3 PH對(duì)Cx活性的影響 圖3 不同pH對(duì)F. sulphureum Cx 酶活性的影響 由圖3可見，不同pH的培養(yǎng)液對(duì)F. sulphureum Cx活性表現(xiàn)出不同的影響，隨著pH的增加，呈

15、現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中pH為6時(shí)，Cx活性最大， pH為8時(shí)Cx活性最低。 2.1.4 PH對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響 圖4 不同pH對(duì)F. sulphureum β-葡萄糖苷酶活性的影響 由圖4可見，不同pH的培養(yǎng)液對(duì)F. sulphureumβ-葡萄糖苷酶活性表現(xiàn)出不同的影響，隨著pH的增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中pH為8時(shí)，β-葡萄糖苷酶活性最大， pH為5時(shí)β-葡萄糖苷酶活性最低。 2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響 2.2.1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PG活性的影響 圖5 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum PG 酶活性的影響 由圖5可見不同培養(yǎng)

16、時(shí)間對(duì)F. sulphureum PG活性的影響存在差異，其中2d時(shí)其活性最大，培養(yǎng)時(shí)間為5d時(shí)PG活性最低。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于6天時(shí)PG活性基本保持在0.16mg/min.mL左右，其活性呈現(xiàn)先上升后降低后上升的趨勢(shì)。。 2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PMG活性的影響 圖6 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum PMG 酶活性的影響 由圖6可見不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum PMG活性的影響存在差異，其中2d時(shí)其活性最大，培養(yǎng)時(shí)間為5d時(shí)PMG活性最低。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于6天時(shí)PMG活性基本保持在0.17mg/min.mL左右，其活性呈現(xiàn)先上升后降低后上升的趨勢(shì)。 2.2.

17、3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Cx活性的影響 圖7不同p培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum Cx 酶活性的影響 917