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臨床檢測樣本RNA提取方法的比較研究生物技術專業(yè)

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1、 臨床檢測樣本 RNA 提取方法的比較研究 摘要:選擇市售的三種細胞裂解液(Liaison Plus、Troll Plus 和RNAOUT)和兩種 DNA\RNA共提試劑盒(柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒),分別對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)和乙型腦炎病毒(JEV)三種病毒 RNA 進行提取,通過瓊脂糖凝膠電泳和 Real-time PCR 間接評價所提取的 RNA 質量。結果表明:對于瓊脂糖凝膠電泳,上述三種細胞裂解液和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應的組均可見清晰且高亮的條帶,

2、可用于臨床 RNA 病毒檢測以及定性分析。對于Real-time PCR,Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒 CT 值最低,Liaison Plus、Troll Plus 兩種細胞裂解液其次,以上三種試劑可用于臨床 RNA 病毒檢測以及定量分析。 關鍵詞:RNA;提取方法;比較;臨床 Comparison of Methods of clinical test samples RNA extraction Abstract:Three commercially available cell sates (Liaison Plus, Troll Plus and RNAOU

3、T) and two DNA / RNA co-kits (ALCMENA double-kit, Queasy rapid DNA / RNA co-kit) were selected to extract three animal RNA viruses(PRRSV, CSFV and JEV). The RNA quality was evaluated indirectly by agaric gel electroplate and Real-time PCR. The result shows, for agaric gel electroplate, the clearly

4、 and highlight bands can be seen above the groups of the three cell sates and Queasy rapid DNA / RNA co-kit, which can be used for clinical RNA virus detection and qualitative analysis. For Real-time PCR, the CT value of the Queasy rapid DNA / RNA co-kit group is the lowest, and the two cell sates g

5、roups(Liaison Plus, Troll Plus) followed. The above three reagents can be used for clinical RNA virus detection and quantitative analysis. Key words: RNA;Extraction Method;Comparison;Clinical RNA 是生物體重要的遺傳物質[1]。近年來,越來越多的科研結果表明,RNA 在生命進程中的作用遠不止于此,在 2002 年度 Science 評選的 10 大科學成就中 RNA 名列榜首。 RNA 分子

6、提取是生物學研究中的一項基本內容,是進行基因表達分析的基礎[2]。對于 DNA 文庫構建、熒光定量 PCR、CRT、Northern 雜交等下游分子生物學實驗來說,都需要質量好的,完整性高的 RNA[3]。 在所有 RNA 試驗中最關鍵的因素是分離得到全長 RNA。分離出純度高且完整的 RNA 是進行基因表達分析及 RNA 結構功能研究的基礎。在所有 RNA 實驗中,最關鍵的步驟是分離得到純度高且完整的 RNA。,從組織細胞中分離純粹完整的 RNA 對于分子克隆和基因表達分析等試驗是至關重要的[4,5] Chomsky 和 Sac chi 第一次提出了用異硫氰酸胍法提取細胞內的 RNA

7、[6], 使得 RNA 的提取過程變得簡便快捷。常見的 RNA 提取方法有強變性劑法[7]、CTAB 法[8]、ADS-Phenol 法[9]以及熱硼酸法[10]等。在商品化的今天,國內外生物試劑公司研發(fā)出了許多 RNA 提取試劑盒。比如 Tamara 公司的 Liaison Plus; Inviting 公司的 Tripoli 總 RNA 提取試劑盒以及 Pure Link? RNA Mini Kit;上海生工的 UNlQ-10 柱式 Tripoli 總 RNA 抽提試劑盒;Omega 公司的 RNA 小量提取試劑盒(Bacteria RNA kit)以及高純 RNA 抽提試劑盒(HP

8、 total RNA kit); Engage 公司的 RN easy Protect Bacteria Mini and Midi Kits 等。都可以從病料組織或者培養(yǎng)細胞中快速有效地提取出高質量高純度的 RNA。 實時熒光定量 PCR 的原理是以熒光共振能量轉移原理為基礎[11,12]。熒光共振能量轉移原理是當一個熒光分子(供體分子)的熒光光譜與另一個熒光分子(受體分子)的激發(fā)光譜重疊時,供體熒光分 子自身的熒光強度衰減,受體熒光分子的熒光強度增強。Ct 值是指每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct 值是實時熒光 PCR 中一個很關鍵的因素,C 代表循環(huán)(Cycl

9、e), t 代表閾值(Threshold)。每個模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系,起始拷貝數(shù)越多,Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可做出標準曲線[13-15]。因此,根據(jù)熒光探針的發(fā)光基團所發(fā)出的熒光強度與 PCR 產(chǎn)物的數(shù)量呈對應關系,只要對熒光信號進行“實時”檢測并獲得未知樣品的 Ct 值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。與普通 PCR 相比,實時熒光定量 PCR 可以利用熒光信號實時監(jiān)測 PCR 反應過程中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物的變化, 可以對初始模板量進行定量分析。簡單地說,實時熒光定量 PCR 的基本原理就是樣本核酸擴增呈指數(shù)增長,在反應體系

10、和條件完全一致的情況下,樣本 DNA 含量與擴增產(chǎn)物的對數(shù)成正比,由于反應體系中的熒光染料或熒光標記物(熒光探針)與擴增產(chǎn)物結合發(fā)光,其熒光量與擴增產(chǎn)物量成正比,因此通過熒光量的檢測就可以測定樣本核酸量[16-18]。 大量的研究實驗證明:雖然提取 RNA 的方法很多,但是其基本都是把細胞破碎以后,以除去材料中糖、蛋白質、DNA 等雜質為目標。而且材料自身物理化學性質的不同,不同的材料需要不同的提取方法[19 ,20]。因此,需要通過對比試驗,針對不同細胞組織,選擇更加合適的 RNA 提取方法。 1 材料與方法 1.1 試劑 高致病性豬繁殖于呼吸綜合癥活疫苗(JXA1-R 株,中

11、牧實業(yè)股份有限公司),豬瘟耐熱保護劑活疫苗(成都天邦生物制品有限公司,),日本乙型腦炎弱毒活疫苗 (SA14-14-2 株),Troll Plus 總 RNA 提取試劑(南京天為生物科技有限公司),動物 RNAOUT(北京天恩澤基因科技有限公司),Liaison Plus(寶生物工程有限公司),柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司), Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒(上??祆`生物科技有限公司),氯仿(),乙醇(),異丙醇(上海申博化工有限公司),逆轉錄試劑盒(),Mixture() 1.2 總 RNA 提取 1.2.1 細胞裂解液法提取

12、RNA (1) Liaison Plus 法 取疫苗稀釋液 100μL,加 dH2O 稀釋到 500uL,加 700μL 細胞裂解液;劇烈振蕩,靜置 5—15min,充分反應,期間振蕩搖勻;加氯仿 200μL,劇烈振蕩,靜置 5min; 12000rpm/min,4℃離心 5min;吸取 600μL 上清,加入等體積的異丙醇,沉淀RNA,緩慢搖勻;-20℃保存 30min 以上;12000rpm/min 離心 15min,棄上清; 加入 400μL,75%的乙醇,顛倒 4 次;12000rpm/min 離心 5min,棄上清; 12000rpm/min,瞬離,吸干;吹干;每空加入

13、 30—40μL Release free dH2O,-80℃ 保存?zhèn)溆谩? 其中,疫苗稀釋液有三種(PRRSV、CSFV 和 JEV)。每組試驗設立三個重復。 (2) RNAOUT 法 取疫苗稀釋液 100μL,加 dH2O 稀釋到 500uL,加 700μL 細胞裂解液;劇烈振蕩,靜置 5—15min,充分反應,期間振蕩搖勻;加氯仿 200μL,劇烈振蕩,靜置 5min; 12000rpm/min,4℃離心 5min;吸取 600μL 上清,加入等體積的異丙醇,沉淀RNA,緩慢搖勻;-20℃保存 30min 以上;12000rpm/min 離心 15min,棄上清; 加入 400μ

14、L,75%的乙醇,顛倒 4 次;12000rpm/min 離心 5min,棄上清; 12000rpm/min,瞬離,吸干;吹干;每空加入 30—40μL Release free dH2O,-80℃ 保存?zhèn)溆谩? 其中,疫苗稀釋液有三種(PRRSV、CSFV 和 JEV)。每組試驗設立三個重復。 (3) Troll Plus 法 取疫苗稀釋液 100μL,加 dH2O 稀釋到 500uL,加 700μL 細胞裂解液;劇烈振蕩,靜置 5—15min,充分反應,期間振蕩搖勻;加氯仿 200μL,劇烈振蕩,靜置 5min; 12000rpm/min,4℃離心 5min;吸取 600μL

15、 上清,加入等體積的異丙醇,沉淀RNA,緩慢搖勻;-20℃保存 30min 以上;12000rpm/min 離心 15min,棄上清; 加入 400μL,75%的乙醇,顛倒 4 次;12000rpm/min 離心 5min,棄上清; 12000rpm/min,瞬離,吸干;吹干;每空加入 30—40μL Release free dH2O,-80℃ 保存?zhèn)溆谩? 其中,疫苗稀釋液有三種(PRRSV、CSFV 和 JEV)。每組試驗設立三個重復。 1.2.2 柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒法提取 RNA 在 1.5mL 離心管中加入 100μL 疫苗稀釋液,加入 600μL 溶液 A

16、,振蕩 30s 混勻后室溫放置 10min(溶液 A 在 4℃放置后可能產(chǎn)生沉淀,使用前必須放入 65℃水浴使沉淀徹底溶解并充分搖勻后再取用);短暫離心后,將 500μL 溶液轉移到離心吸附柱中,室溫放置 2min;12000rpm 室溫離心 1min,棄收集管中的的穿透液,把離心柱放回到收集管中;將剩余的溶液短暫離心后全部轉移到上一步的離心柱中,室溫放置 2min;12000rpm 室溫離心 1min,棄收集管中的的穿透液,把離心 柱放回到收集管中;加入 700μL 的通用洗柱液到離心吸附柱中,12000rpm 室溫離心 1min,棄收集管中的穿透液,把離心柱放回到收集管中;12000

17、rpm 室溫離心 1min(干甩),棄含穿透液的離心管;將干甩后的離心吸附柱套入到一個自備的 Freebase 的 1.5mL 離心管中,在離心吸附柱的中心加入 30—40μL 的洗脫液,然后室溫放置 2min;12000rpm 離心 1min,離心管中為 RNA 溶液,-80℃保存?zhèn)溆谩? 其中,疫苗稀釋液有三種(PRRSV、CSFV 和 JEV),每組試驗設立三個重復。 1.2.3 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒法提取 RNA 在 1.5mL 了離心管中加入 100μL 處理好的樣本液,然后加入 300μL 核酸提取液,振蕩混勻,室溫靜置 2—3min;加入 400μL

18、 異丙醇,振蕩混勻,12000rpm 離心 5min,棄凈溶液;加入 600μL 50%異丙醇,振蕩混勻,12000rpm 離心 1min,棄凈溶液; 加入 600μL 75%乙醇,振蕩混勻,12000rpm 離心 1min,棄凈溶液;離心管短暫離心 5—10s 后,用 10μL 槍頭棄凈溶液,若管底出現(xiàn)少量沉淀,可開蓋室溫干燥2—3min;加入 10—30uL 洗脫液,振蕩混勻后短暫離心,置于-80℃保存?zhèn)溆?。其中,疫苗稀釋液有三種(PRRSV、CSFV 和 JEV),每組試驗設立三個重復。 1.3 RNA 質量檢測 1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測 分別取 RNA 樣品 6μL,加入

19、Ac Curt Reaction Mix(4X)2μL,混勻后室溫放置 2min;加入 Ac Curt Reaction Shoppe(r 5X)2μL,5X All-in-One RT Choirmaster 4μL, Antinuclear H2O 6μL,總體系為 20μL 進行 CRT(25℃ 10min,42℃ 50min, 85℃ 5min)。將反應生成的 DNA 分別用于普通 PCR,分別取 RNA 4—5 μL,在 1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測,85 V 恒壓 25 min。紫外燈下照射觀察條帶,并拍照記錄結果。 其中,RNA 樣品有三種(PRRSV、CSFV

20、 和 JEV),每組試驗設立三個重復。 1.3.2 Real-time PCR 分別取 RNA 樣品 6μL,加入 Ac Curt Reaction Mix(4X)2μL,混勻后室溫放置 2min;加入 Ac Curt Reaction Shoppe(r 5X)2μL,5X All-in-One RT Choirmaster 4μL, Antinuclear H2O 6μL,總體系為 20μL 進行 CRT(25℃ 10min,42℃ 15min, 85℃ 5min)。 其中,RNA 樣品有三種(PRRSV、CSFV 和 JEV),每組試驗設立三個重復。而后配置 Real-time

21、 PCR 體系,如下: 體系: SYBR Premix EX Ta Ⅱ(2x): 10 AL PCR Forward Primer: 0.6 AL PCR Reverse Primer: 0.6 AL DNA 模板 2 AL 三蒸水 6.8 AL 總 20 AL 兩步法 PCR 擴增標準程序: Stage1:預變性Reps:1 95℃ 30 秒 Stage2:PCR 反應 Reps:40 95℃ 5 秒 60℃ 30 秒 反應結束后確認 Real-time PCR 的擴增曲線和融解曲線,按照內參基因和目的基因的擴增結果,應用 2ΔΔCT 的方法技術最終的 CT 值;

22、評價擴增的效果,間接評價核酸的提取效果。 上述反應應用 ABI 7300 熒光定量 PCR 儀(美國 Applied Bio systems 公司)進行。其中,每組試驗設立三個重復。 2.結果 2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果 2.1.1 高致病性豬繁殖于呼吸綜合癥活疫苗(JXA1-R 株)檢測結果 從圖 1 可以看出,Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus 和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應的組,電泳條帶亮度和清晰度很高,彼此之間無肉眼可見差距;柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對應的組未發(fā)現(xiàn)條帶,表現(xiàn)不理想。 圖 1 PRRS

23、V DNA 瓊脂糖凝膠電泳結果 (M 為 Marker,0 為空白對照,1-3、4-6、7-9、10-12、13-15 分別為 3 個平行組,依次對應Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒) 2.1.2 豬瘟耐熱保護劑活疫苗檢測結果 從圖 2 可以看出,Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus 和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應的組,電泳條帶亮度和清晰度很高。其中,Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應的組條帶最清晰、亮度

24、最高;Liaison Plus 和 RNAOUT 對應的組條帶中度清晰、亮度中等,但兩組之間無肉眼可見差距; Troll Plus 對應的組清晰度較低,亮度低;柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對應的組未發(fā)現(xiàn)條帶,表現(xiàn)不理想。 圖 2 CSFV DNA 瓊脂糖凝膠電泳結果 (M 為 Marker,0 為空白對照,1-3、4-6、7-9、10-12、13-15 分別為 3 個平行組,依次對應Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒) 2.1.3 日本乙型腦炎弱毒活疫苗檢測

25、結果 從圖 3 可以看出,Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus 和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應的組之間,電泳條帶亮度和清晰度很高。其中, Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應的組條帶最清晰、亮度最高;Liaison Plus 和 RNAOUT 對應的組條帶中度清晰、亮度中等,但兩組之間無肉眼可見差距;Troll Plus 對應的組清晰度較低,亮度低;柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對應的組未發(fā)現(xiàn)條帶,表現(xiàn)不理想。 圖 3 JEV DNA 瓊脂糖凝膠電泳結果 (M 為 Marker,0 為空白對照,1-3、4-6

26、、7-9、10-12、13-15 分別為 3 個平行組,依次對應 Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒) 2.2 Real-time PCR 檢測結果 2.2.1 高致病性豬繁殖于呼吸綜合癥活疫苗(JXA1-R 株)檢測結果 從圖 4 可以看出,Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應的組 CT 值均較低。其中,Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應的組

27、CT 值最低;Liaison Plus 和RNAOUT 對應的組 CT 值其次,但兩組間差距不明顯;Troll Plus 對應的組 CT 值稍高;柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對應的組 CT 值最高。 圖 4 PRRSV Real-time PCR 檢測結果 (Tamara、天恩澤、天為、天恩澤盒、快靈盒依次對應 Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒) 2.2.2 豬瘟耐熱保護劑活疫苗檢測結果 從圖 5 可以看出,Liaison Plus、RNAOUT、Troll Pl

28、us、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應的組 CT 值均較低。其中,Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應的組 CT 值最低;Liaison Plus 和 RNAOUT 對應的組 CT 值其次,但兩組間差距不明顯;Troll Plus 和柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對應的組 CT 值稍最高,但兩組間差距不明顯。 圖 5 CSFV Real-time PCR 檢測結果 (Tamara、天恩澤、天為、天恩澤盒、快靈盒依次對應 Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DH

29、ARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒) 2.2.3 日本乙型腦炎弱毒活疫苗檢測結果 從圖 6 可以看出,Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應的組 CT 值均較低。其中,Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應的組 CT 值最低;Liaison Plus 和 RNAOUT 對應的組 CT 值其次,但兩組間差距不明顯;Troll Plus 對應的組 CT 值稍高;柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對應的組 CT 值最高。 圖 6

30、JEV Real-time PCR 檢測結果 (Tamara、天恩澤、天為、天恩澤盒、快靈盒依次對應 Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒) 3 討論 RNA 的提取是分子生物學的基礎[21],如何提取從動物細胞和組織中提取高質量的 RNA 更是科研研究和病原診斷的關鍵。只有獲得高純度、高濃度和完整性好的 RNA 才能更好的進行下游反應,如 DNA 文庫構建、熒光定量 PCR、CRT、 Northern 雜交等下游分子生物學實驗。 RNA 的提取關鍵在于組織細胞裂解。組織

31、裂解方法有很多,包括胍鹽裂解法、堿裂解法、CTAB 裂解法和酚油抽提法等,這類方法雖然具有提取高純度核酸的優(yōu)點,但是普遍存在實驗步驟多、操作繁瑣、耗時長以及部分存在毒性等缺點[22]。隨著生物產(chǎn)業(yè)的商業(yè)化發(fā)展,很多試劑公司根據(jù)組織裂解的方法設計出了很多商品化試劑,比如 Tamara 公司的 Liaison Plus、天為生物科技有限公司的 Troll Plus,天恩澤基因科技有限公司的動物 RNAOUT 等。這些試劑可以從動物組織、培養(yǎng)細胞和微生物中簡單、快速的提取 RNA,且獲得的 RNA 完整性好,純度高操作過程簡單,并且毒性小,實驗危險性小。 通常情況下,分子生物學試驗只需單獨提取一

32、種類型的核酸(DNA/RNA)或蛋白質。如果想要同時獲得 DNA、RNA 以及蛋白質,則需要分別提取。顯然這種方式效率不高,因此,隨著科技的進步,出現(xiàn)了很多商品化試劑盒,如天恩澤基因科技有限公司的柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒法、快靈生物科技有限公司的 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒等。此類方法操作起來簡便,時間短,可以同時提取 DNA 和 RNA,毒性小,且獲得的核酸完整性好,純度高等。 筆者所在實驗室選取了市售的三種細胞裂解液(Liaison Plus、Troll Plus 和 RNAOUT)和兩種 DNA\RNA 共提試劑盒(柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、

33、 Queasy 快速DNA/RNA 共提試劑盒)。分別對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)和乙型腦炎病毒(JEV)三種疫苗毒的 RNA 進行提取,而后進行 CRT 將所提取的 RNA 轉換成 DNA,分別用于普通 PCR 并進行瓊脂糖 凝膠電泳和 Real-time PCR,之后分別通過瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰度、亮度和Real-time PCR CT 值來間接對所提取 RNA 質量作評價和比較。 瓊脂糖凝膠電泳結果表明,對于 PRRSV,Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus 和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒所對應的組均可見清

34、晰度高,亮度高的條帶,表明對應 DNA 質量好,間接表明所提取的 RNA 質量好。因此,上述試劑可用于臨床 PRRSV 的病毒檢測以及定性分析。對于 CSFV,Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒所對應的組條帶最清晰、亮度最高,其次是 Liaison Plus 和 RNAOUT,Troll Plus 稍差。因此,對于臨床 CSFV 的病毒檢測以及定性分析,首選 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒、Liaison Plus 和 RNAOUT。對于 JEV,Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒所對應的組條帶最清晰、亮度最高, 其次是 Liaison Plus

35、 和 RNAOUT,Troll Plus 稍差。因此,對于臨床 JEV 的病毒檢測以及定性分析,首選 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒、Liaison Plus 和 RNAOUT。 Real-time PCR 結果表明,對于 PRRSV,Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應的組 CT 值最低,表明對應的 DNA 濃度和純度最好,間接說明所提取的 RNA 質量最好。其次是 Liaison Plus 和 RNAOUT,柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Troll Plus 表現(xiàn)不理想。因此,對于臨床 PRRSV 的病毒檢測以及定量分析, 首選 Queasy 快速

36、DNA/RNA 共提試劑盒、Liaison Plus 和RNAOUT。對于 CSFV, Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應的組 CT 值最低,表明對應的 DNA 濃 度和純度最好,間接說明所提取的 RNA 質量最好。其次是 Liaison Plus 和 RNAOUT,柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Troll Plus 表現(xiàn)不理想。因此, 對于臨床 CSFV 的病毒檢測以及定量分析,首選 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒、Liaison Plus 和 RNAOUT。對于 JEV,Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應的組 CT 值最

37、低,表明對應的 DNA 濃度和純度最好,間接說明所提取的 RNA 質量最好。其次是 Liaison Plus 和 RNAOUT,柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Troll Plus 表現(xiàn)不理想。因此,對于臨床 JEV 的病毒檢測以及定量分析,首選 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒、Liaison Plus 和 RNAOUT。 本次實驗僅僅對 PRRSV,CSFV 和 JEV 三種 RNA 病毒的疫苗毒 RNA 進行提取比較。以上三種病毒均為臨床常見的 RNA 病毒,具有代表性。通過比較分析實驗結果,筆者認為當臨床需要對 PRRSV,CSFV 和 JEV 三種 RNA 病

38、毒進行檢測時,可首選 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒和 Liaison Plus 和 RNAOUT 兩種細胞裂解液,獲得的 RNA 質量好,利于后續(xù)實驗的進行。 隨著科學技術的進步,市面上已經(jīng)出現(xiàn)自動核酸提取儀,如 ABI 公司的 ABI PRISMTM 6100 核酸提取儀,半個小時即可完成 96 個樣品的純化工作,并且可純化來自多種生物樣本的總 RNA 和基因組 DNA[23]。隨著科技的發(fā)展,類似的儀器也在不斷出現(xiàn)和升級,但由于成本較高,且有時并不需要同時提取 96 個樣本,因此多數(shù)高校和科研機構并未普及。 每種 RNA 提取方法均有其各自的優(yōu)勢,如何選擇合適的 RN

39、A 提取方法應根據(jù)提取對象、所需濃度和數(shù)量、時間以及純度等來綜合選擇。隨著科學技術的進步, 相信動物組織 RNA 提取的方法會越來越簡便、快速、高效。 致謝 參考文獻: [1] Jun H L, Chan H T. A simple rapid and effective method for total RNA extraction from Tendentiousness [J]. Biotechnology, 2006, 28: 1193-1197 [2] Brooks,Joseph,Edward F Kitsch,Thomas Mannerist.Molec

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