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,,1,第四章 衛(wèi)生微生物研究和檢測的方法,1,,2,衛(wèi)生微生物檢測的特點及基本原則 衛(wèi)生指示微生物 衛(wèi)生微生物研究和檢測的方法 衛(wèi)生微生物研究和檢測方法的前景,2,,3,第一節(jié),衛(wèi)生微生物檢測的特點及基本原則,3,4,1.衛(wèi)生微生物檢驗與醫(yī)學(xué)微生物檢驗的區(qū)別與特點 ? 2.樣品的采集原則 ？ 3.影響采樣代表性的因素有哪些？ 4.怎樣使采樣具有針對性？ 5.樣品采集后為什么要盡快送檢？ 6.怎樣保護樣品中的待檢微生物？ 7.樣品中抑菌物質(zhì) 去除方法有哪些？ 8.樣品的處理策略（目的）與方法 9.怎樣濃縮樣品中的微生物？ 10.環(huán)境中的微生物數(shù)量低，怎樣提高檢出率？,4,5,衛(wèi)生微生物檢測的特點,1．檢測的對象多 病原微生物+非致病和條件致病微生物 特別是能反映環(huán)境、食品、健康相關(guān)產(chǎn)品等樣品衛(wèi)生質(zhì)量的衛(wèi)生指示微生物。,5,,6,,2．檢測的范圍廣，標本的來源不僅局限于人體，也來源于空氣、水、食品等環(huán)境。,6,,7,,3．檢測的方法更敏感，以檢測環(huán)境標本中數(shù)量很低的致病微生物。 問題：你知道哪些方法？你認為什么方法更敏感？,7,,8,,4．定量測定和分型檢測，以探明感染性疾病的傳染源、傳播途徑、流行情況等。,8,9,衛(wèi)生微生物檢測的基本原則,采集、保存、運送、檢測,9,10,總原則,生物安全 代表性/針對性 防污染 防殺菌 細標記,10,11,生物安全,防人員感染：個人防護（？） 防標本和環(huán)境的污染 ：無菌操作、恰當(dāng)處理污染廢棄物,11,裴曉方 xxpei@,12,注意采樣的代表性,影響采樣代表性的因素包括: 采樣量 采樣部位 采樣時間 采樣的隨機性和均勻性 以及按批號抽樣,12,13,注意采樣的針對性,樣品種類 恰當(dāng)時間 采樣量,13,14,避免采樣時外界微生物對樣品的新污染：所有采樣用具、容器需嚴格滅菌，并以無菌操作采樣。,14,15,,避免采樣時對微生物的殺滅作用和引入新的抑菌物質(zhì)：如容器是否有消毒劑的殘留，或使用剛燒灼未冷卻的采樣工具。,15,裴曉方 xxpei@,16,,注意對樣品的詳細標記： 樣品名稱 編號 采樣時間 采樣者 檢測項目,16,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,17,樣品的運送原則,盡快送檢 采集的樣品，應(yīng)在規(guī)定的時間內(nèi)（一般不超過3~4小時）送到實驗室，盡快送檢。 一方面可減少待測微生物的死亡。 另一方面可防止微生物的繁殖對計數(shù)結(jié)果的影響,17,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,18,保護待檢微生物,溫度調(diào)節(jié) 加入保護劑 去除其他不利于待測微生物生存的因素,18,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,19,pH 蛋白質(zhì) 抑制劑抑制非目的微生物 滲透壓 氣體,19,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,20,遵循完善的樣品交接制度,送往實驗室的樣品，必須附有樣品送檢單，實驗室收到樣品應(yīng)按送檢單逐項核對，檢查樣品是否符合檢驗要求，確證無誤方可簽收待檢。,20,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,21,實驗室檢驗原則,21,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,22,,相應(yīng)的硬件條件和設(shè)備 具有合格的檢驗人員 標準/公認的檢驗方法 實驗室質(zhì)量控制,22,環(huán)境,實驗室環(huán)境不應(yīng)影響檢驗結(jié)果的準確性 工作區(qū)與辦公區(qū)分開 工作面積應(yīng)滿足檢驗工作的需要 溫度、濕度、照度、噪聲和潔凈度等應(yīng)符合工作要求 整體布局應(yīng)采用單方向工作流程，避免交叉污染 一般樣品檢驗：潔凈區(qū)（超凈工作臺或潔凈實驗室） 病原微生物分離鑒定： BSL-2,23,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,24,,應(yīng)有檢測不同病原菌的 相應(yīng)的條件和設(shè)備 微生物按其是否致病、致病力強弱、危害人體的嚴重性、傳染性的大小、當(dāng)?shù)厝巳旱拿庖咚?、有無免疫制劑和特效治療藥物等可分成不同的危害等級。 在不同生物安全級別實驗室進行,24,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,25,,實驗室生物安全與管理 很重視 ?,25,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,26,病毒滅活不徹底引發(fā)實驗室感染,2004北京、安徽發(fā)生非典疫情原因調(diào)查結(jié)果。調(diào)查組認為，本起疫情來自中國疾控制中心實驗室內(nèi)感染，而引起實驗室感染的環(huán)節(jié)，是腹瀉病毒室工作人員進行實驗時，對SARS病毒滅活不徹底。,26,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,27,實驗室生物安全與管理,生物危害 非工作人員嚴禁入內(nèi),27,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,28,實驗室生物危害,在微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗室研究過程中生物因子（病原微生物）對人、環(huán)境、生態(tài)和社會造成的危害和污染。,28,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,29,實驗室生物安全,為了避免微生物和醫(yī)學(xué)實驗室中在進行各種有危害或有潛在危害的生物因子活動過程中，可能對人、環(huán)境和社會造成的危害或潛在危害，而采取的防護措施（硬件）和管理措施（軟件），達到對人、環(huán)境和社會的安全防護目的,29,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,30,微生物實驗室生物安全,主要考慮實驗室生物安全防護，即實驗室工作人員所處理的實驗對象含有致病的微生物及其毒素時，通過在實驗室設(shè)計建造、使用個體防護設(shè)施、嚴格遵從標準化的工作及操作程序和規(guī)程等方面采取綜合措施，確保實驗室工作人員不受實驗對象的感染，確保周圍環(huán)境不受實驗對象的污染。,30,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,31,實驗室生物安全級別,,31,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,32,感染性微生物的危險度等級分類,危害等級I (低個體危害，低群體危害) 不會導(dǎo)致健康工作者和動物致病的細菌、真菌、病毒和寄生蟲等生物因子。 危害等級Ⅱ (中等個體危害，有限群體危害) 能引起人或動物發(fā)病，但一般情況下對健康工作者、群體、家畜或環(huán)境不會引起嚴重危害的病原體。實驗室感染不導(dǎo)致嚴重疾病，具備有效治療和預(yù)防措施，并且傳播風(fēng)險有限。,32,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,33,感染性微生物的危險度等級分類,危害等級III (高個體危害，低群體危害) 能引起人類或動物嚴重疾病，或造成嚴重經(jīng)濟損失，但通常不能因偶然接觸而在個體間傳播，或能使用抗生素、抗寄生蟲藥治療的病原體。 危害等級Ⅳ (高個體危害，高群體危害) 能引起人類或動物非常嚴重的疾病，一般不能治愈，容易直接或間接或因偶然接觸在人與人，或動物與人，或人與動物，或動物與動物間傳播的病原體。,33,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,34,實驗室可以分為,基礎(chǔ)實驗室 —— 一級生物安全水平（BSL-1) 基礎(chǔ)實驗室 —— 二級生物安全水平（BSL-2) 防護實驗室 —— 三級生物安全水平（BSL-3) 最高防護實驗室 —— 四級生物安全水平（BSL-4) 根據(jù)操作不同危險度等級微生物所需的實驗室設(shè)計特點、建筑構(gòu)造、防護設(shè)施、儀器、操作以及操作程序來決定實驗室的生物安全水平。,34,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,35,傳染病分類——傳染病防治法,甲類傳染病是指：鼠疫、霍亂。（2） 乙類傳染病是指：傳染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰質(zhì)炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、流行性乙型腦炎、登革熱、炭疽、細菌性和阿米巴性痢疾、肺結(jié)核、傷寒和副傷寒、流行性腦脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生兒破傷風(fēng)、猩紅熱、布魯氏菌病、淋病、梅毒、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾。（25）,35,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,36,傳染病分類 —— 傳染病防治法,丙類傳染病是指：流行性感冒、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、急性出血性結(jié)膜炎、麻風(fēng)病、流行性和地方性斑疹傷寒、黑熱病、包蟲病、絲蟲病，除霍亂、細菌性和阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉病、手足口病。（11） 對乙類傳染病中傳染性非典型肺炎、炭疽中的肺炭疽和人感染高致病性禽流感，采取本法所稱甲類傳染病的預(yù)防、控制措施。,36,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,37,傳染病分類 ——,根據(jù)病原微生物的傳染性、感染后對個體或者群體的危害程度，將病原微生物分為四類： 第一類病原微生物，是指能夠引起人類或者動物非常嚴重疾病的微生物，以及我國尚未發(fā)現(xiàn)或者已經(jīng)宣布消滅的微生物。 第二類病原微生物，是指能夠引起人類或者動物嚴重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動物與人、動物與動物間傳播的微生物。,病原微生物實驗室 生物安全管理條例,37,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,38,傳染病分類 ——,第三類病原微生物，是指能夠引起人類或者動物疾病，但一般情況下對人、動物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴重危害，傳播風(fēng)險有限，實驗室感染后很少引起嚴重疾病，并且具備有效治療和預(yù)防措施的微生物。 第四類病原微生物，是指在通常情況下不會引起人類或者動物疾病的微生物。 第一類、第二類病原微生物統(tǒng)稱為高致病性病原微生物。,病原微生物實驗室 生物安全管理條例,38,人員-食品微生物檢驗,具有微生物專業(yè)背景和相應(yīng)資質(zhì) 掌握生物安全知識和消毒知識，能夠理解并正確實施檢驗（防止人為污染樣品、保護環(huán)境、自身安全） 顏色視覺障礙 涉及到辨色的實驗,,39,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,40,具有合格的檢驗人員 必須經(jīng)常接受專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)， 掌握檢驗項目的基本原理及技術(shù)方法 技術(shù)質(zhì)量考核：可用幾種基本技術(shù)作考核評價的指標。①細菌計數(shù)：可使用分散性和穩(wěn)定性好的枯草菌CMCC（B）63501株制作芽孢懸液。請幾名被試人員用直徑9cm~10cm的普通營養(yǎng)瓊脂平板，作表面涂沫接種計數(shù)，重復(fù)作5次，求平均數(shù)和標準差，以標準差小，和顯微鏡直接計數(shù)折算值接近的為佳。②生化試驗重現(xiàn)性：用銅綠色假單胞菌CMCC（B）1012株，。③模擬樣品檢出考核：選合適的基質(zhì)如奶粉，加入指標菌，如普通變形桿菌CMCC（B）49001株?？己饲跋茸黝A(yù)備試驗。指定檢驗方法，確定檢出最小菌數(shù)。然后用最小菌數(shù)的5倍量、10倍量加入模擬基質(zhì)中，進行檢出試驗，從盲檢結(jié)果的正誤進行評定。,,40,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,41,采用標準/公認的檢驗方法進行檢測,凡有國家標準、部頒標準或行業(yè)檢查方法的均按標準方法檢驗。沒有國家或部頒標準，按上級疾病預(yù)防控制中心的要求，參照共同協(xié)定的方法檢驗,41,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,42,加強實驗室質(zhì)量控制,儀器設(shè)備的質(zhì)控： 培養(yǎng)基、試劑的質(zhì)量控制： 消毒滅菌效果的控制： 建立良好的實驗記錄制度： 建立良好的核查、校對制度 報告與核查制度,42,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,43,根據(jù)衛(wèi)生檢驗的特點采取特殊措施,做好應(yīng)對突發(fā)事件的準備 如果一個樣品需做多種分析，檢測微生物 優(yōu)先 樣品處理：均質(zhì)化、乳化后再行稀釋；抑菌物質(zhì)去除；目的菌濃縮 (樣品的處理策略（目的）與方法?) 微生物的復(fù)蘇,43,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,44,避免微生物實驗室感染,氣溶膠 避免微生物污染操作環(huán)境 作好培養(yǎng)廢棄物、用具和樣品等的處理 作好個人防護,44,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,45,,第二節(jié),衛(wèi)生指示微生物,45,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,46,,指示微生物 indicator microorganism 是在常規(guī)衛(wèi)生監(jiān)測中，用以指示樣品衛(wèi)生狀況及安全性的（非致?。┪⑸铮ɑ蚣毦?。,46,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,47,分為四種類型,①菌落總數(shù)（細菌、霉菌和酵母菌數(shù)） ②大腸菌群、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌 ③其它指示菌：特定菌、某些致病菌 ④病毒（包括噬菌體）,47,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,48,,,選擇指示微生物的總原則,數(shù)量大易于檢出 檢驗方法簡單、經(jīng)濟、方便 有一定的代表性，其數(shù)量變化能反映樣品衛(wèi)生狀況及安全性,,,48,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,49,,,衛(wèi)生微生物檢驗中最重要的指示微生物,,大腸菌群 指示糞便污染,,,49,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,50,作為糞便污染指示菌的條件有哪些？,①大量存在于人及溫血動物腸道，未被糞便污染的樣品中無此種菌存在； ②在外環(huán)境中的抵抗力，包括對消毒劑的抵抗力與腸道致病菌大致相似或稍強； ③在外環(huán)境中不繁殖，存活時間與腸道致病菌大致相似或稍長； ④檢驗方法簡便，易于定量計數(shù)。,,,50,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,51,,為什么常常通過檢測指示微生物 反映樣品衛(wèi)生安全性？,51,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,52,,,與人類健康密切的樣品，如直接進口的食品、飲用水，除檢測衛(wèi)生指示微生物外，還要求直接檢測某些致病菌如： 沙門菌 志賀菌 金黃色葡萄球菌,,52,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,53,常用的指示微生物,53,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,54,菌落總數(shù)Aerobic Plate Count,概念：菌落總數(shù)是指被檢樣品的單位重量(g)、容積(ml)、表面積(cm2)或體積(m3)內(nèi)，所含有的能在某種培養(yǎng)基上經(jīng)一定條件、一定時間培養(yǎng)后長出的菌落數(shù)量。以菌落形成單位數(shù)（colony forming unit ，cfu）表示。,54,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,55,種類：菌落總數(shù)包括細菌菌落總數(shù)、霉菌菌落總數(shù)和酵母菌菌落總數(shù)。 衛(wèi)生學(xué)意義：用于判定檢樣被微生物污染的程度或動態(tài)觀察，也是某些樣品的衛(wèi)生限量標準。 測定方法：常用標準平板計數(shù)法(standard plate-counting method)和表面涂布法（Spatula Method ）,55,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,56,,標準平板計數(shù)法(standard plate-counting method),又稱為 傾注平板計數(shù)法 At what temperature should pour plates be dispensed? Desired temperature is 45 ± 1°C.,56,,生長在固體培養(yǎng)基上，來源于一個?細胞，肉眼可見的細胞群體。,57,,,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,58,58,菌落計算方法 （1）菌落計數(shù)方法 做平板菌落計數(shù)時，可用肉眼觀查，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落總數(shù)。,59,（2）菌落計數(shù)的報告 ①平板菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在30～300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標準。一個稀釋度使用兩個平板，應(yīng)采用兩個平板平均數(shù)，其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。平皿內(nèi)如有鏈狀菌落生長時（菌落之間無明顯界線），若僅有一條鏈，可視為一個菌落數(shù)；如果有不同來源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個菌落計。,60,②稀釋度的選擇 應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告之。若有兩上稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30～300之間，則視兩者之比如何來決定。若其比值小于或等于2，應(yīng)報告其平均數(shù)；若大于2則報告其中較小的數(shù)字。 若所有稀釋度平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。 若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之。,61,若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，其中一部分大于300或小于30時，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。 ③菌落數(shù)的報告 菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按其實有數(shù)報告，大于100時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算。為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來表示。,62,63,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,64,,表面涂布法（ Spatula Method ）,,,傾注平板計數(shù)法,表面涂布法,,,64,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,65,65,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,66,糞便污染指示菌,大腸菌群（coliform group）：是一群能在35~37?C、24小時內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的、需氧或兼性厭氧的、革蘭陰性的無芽胞桿菌。是存在于人和溫血動物腸道中的一大群菌。,66,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,67,,,,,主要包括：四個屬的菌 埃希氏菌屬(Escherichae) 克雷伯氏菌屬(Klebsiella) 腸桿菌屬(Enterobacter) 枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter）,67,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,68,根據(jù)生長溫度的差異，將能在37?C生長的稱為總大腸菌群，而在44.5?C仍能生長的大腸菌群稱為耐熱大腸菌群(thermo-tolerant coliform group) 或糞大腸菌群（faecal coliform Fc），耐熱大腸菌群的主要成員是埃希氏菌屬的菌。,68,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,69,大腸桿菌（Escherichae coli）：,普遍存在于人和動物的腸道內(nèi)（新鮮糞便中每克可達109 CFU），近年來隨著測定新方法的發(fā)現(xiàn)和建立，大腸桿菌作為糞便污染的指示菌的應(yīng)用越來越多。 利用大腸桿菌產(chǎn)生的葡萄糖苷酸酶，分解吲哚葡萄糖苷酸，產(chǎn)生有色物質(zhì)，而使大腸桿菌菌落顯色，對大腸桿菌數(shù)進行測定。,,69,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,70,,作為糞便污染的指示菌，大腸桿菌檢出的意義最大，其次是耐熱大腸菌群，總大腸菌群的檢出意義略差一些。,70,GB/T 4789.3-2008大腸菌群MPN計數(shù),,初發(fā)酵,,,,,,復(fù)發(fā)酵,71,大腸菌群月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯發(fā)酵結(jié)果,,初發(fā)酵,陽性,陽性,陽性,陰性,72,復(fù)發(fā)酵,煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯,,接種,樣本,陰性,陽性,大腸菌群煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯發(fā)酵結(jié)果,73,08版大腸菌群MPN計數(shù)較03版的優(yōu)勢有：,⑴ 08版操作更簡單，適合批量檢測 ⑵ 08版檢出的概率大 乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基基本上不具備修復(fù)已損傷的細胞的作用，而月桂基硫酸鹽胰蛋白胨則可以。 ⑶ 08版減少了人為的誤差 03版需要挑選菌落，受人主觀的影響很大，沒有挑對或挑取的不夠多都會導(dǎo)致假陰性結(jié)果，而08版采取增菌液接種，會減少假陰性。,74,GB/T 4789.3-2008新增大腸菌群平板計數(shù),,,,平板計數(shù),,,,證實試驗,75,,,典型菌落： 紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大,,大腸菌群在結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）上的生長情況,76,GB/T 4789.3-2008新增大腸菌群PetrifilmTM測試片法,,77,,,,,,準備PetrifilmTM測試片,接種1ml樣本液,緩慢蓋上上層膜,用壓板輕壓培養(yǎng)基,樣本接種結(jié)果,,,紅色有氣泡的菌落確認為大腸菌群,78,大腸桿菌MPN計數(shù),,,初發(fā)酵,,,復(fù)發(fā)酵,,,伊紅美藍平板分離培養(yǎng),,,營養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng),,,生化試驗,79,大腸桿菌VRB-MUG平板計數(shù)法,,,檢驗時用已知MUG陽性菌株（如大腸桿菌ATCC25922）和產(chǎn)氣腸桿菌（如ATCC13048）做陽性和陰性對照,80,大腸桿菌PetrifilmTM測試片計數(shù)法,與大腸菌群PetrifilmTM測試片計數(shù)法方法一致 結(jié)果判讀 大腸桿菌 大腸菌群,,,藍色帶氣泡的菌落,紅色帶氣泡的菌落,81,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,82,糞鏈球菌 （fecal Strptococcus Fs）,82,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,83,產(chǎn)氣莢膜梭菌 （Clostirdia）,是一類能還原亞硫酸鹽為硫化物、厭氧生長的、革蘭陽性梭狀芽胞桿菌。是人和動物，特別是食草動物腸道內(nèi)的常住菌，數(shù)量少于大腸桿菌，每克糞便約為105~106。由于該菌能形成芽孢，對含氯消毒劑及外界不良環(huán)境有較強的抵抗力，在外環(huán)境中存活時間較長。所以若樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌被大量檢出而大腸菌群數(shù)量很少時，則表示樣品曾受過糞便污染，即有陳舊性污染。常被作為水或土壤衛(wèi)生細菌學(xué)檢驗中的指標菌。,83,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,84,其它指示微生物,（1）不得檢出的致病菌 （2）腸道病毒的指標微生物 1）大腸桿菌噬菌體f2(coli phage) 2）脊髓灰質(zhì)炎病毒(polio virus)減毒疫苗株I,,84,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,85,第三節(jié)衛(wèi)生微生物研究和檢測的方法,85,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,86,衛(wèi)生微生物樣品特點： 目的菌數(shù)量低 細菌受損 雜菌多,數(shù)量低——濃縮 細菌受損——復(fù)蘇 雜菌多——選擇性增菌和分離,86,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,87,（一）樣品處理,1．樣品混勻： 2．樣品濃縮：,87,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,88,（一）樣品處理,1．樣品混勻：液體樣品常通過電動、手搖或敲打震蕩，使之混勻；固體樣品需通過置滅菌乳缽內(nèi)研磨均勻，或于高速組織搗碎機或勻漿器中在少量液體存在下，搗碎混勻后再取樣，或使用商品化的均質(zhì)器混合待檢樣品。,88,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,89,,,,2．樣品濃縮：,常用的樣品濃縮方式有 沉淀法 過濾法 吸附法,89,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,90,,（1）沉淀法：細菌可通過普通離心機離心沉淀而濃縮，或者通過差速離心，去除雜質(zhì)，收集菌體，達到濃縮的目的。病毒濃縮需采用高速或超速離心機。,90,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,91,,,91,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,92,,92,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,93,,93,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,94,,（2）過濾法：是將樣品在負壓或正壓作用下，通過孔徑為0.45μm的濾膜，細菌被阻留在膜上，而達到濃縮的目的。樣品中的病毒可通過膜的靜電吸附濃縮。過濾法不但可濃縮微生物，還可消除樣品中的抑制劑對后續(xù)培養(yǎng)的影響。,94,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,95,,95,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,96,,96,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,97,,97,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,98,,98,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,99,,99,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,100,（3）吸附沉淀法：可分為特異性和非特異性吸附兩類。非特異性吸附如利用加入化學(xué)制劑，形成沉淀，細菌被共沉淀的方法；而特異性吸附則是利用配體與受體的親和力，吸附待檢微生物，如為濃縮檢樣中的流感病毒，利用該病毒具有血凝素，可與紅細胞結(jié)合的特點，將檢品中加入紅細胞吸附病毒，低速離心收集紅細胞，而達到濃縮病毒的目的。,100,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,101,（二）損傷菌的復(fù)蘇,環(huán)境樣品中的微生物，因經(jīng)受冷、熱、脫水干燥、輻照、高滲透壓或消毒劑的作用，可能引起亞致死性損傷，受損傷的微生物用一般的培養(yǎng)方法不易培養(yǎng)，需預(yù)先進行復(fù)蘇（resuscitation）或修復(fù)（repair）后，才能進行常規(guī)的檢測。修復(fù)的基本方法是在細菌繁殖之前，將其置于無選擇性壓力的培養(yǎng)環(huán)境中，一般降低培養(yǎng)溫度培養(yǎng)一定時間后，再進行常規(guī)檢驗。,101,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,102,（三）選擇性增菌與分離,1．物理方法：主要通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)的溫度、氣體條件和光照，進行選擇性增菌與分離的方法。 2．化學(xué)方法：利用目的微生物的特定生理功能在分離培養(yǎng)基中加入抑制其他微生物生長和顯示目的微生物的化學(xué)制劑，配制成選擇性鑒別培養(yǎng)基，達到對目的微生物增菌分離的目的。學(xué)習(xí)后應(yīng)能舉例說明。,102,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,103,（四）定量計數(shù)方法,1．傾注平板計數(shù)法 2．表面涂布計數(shù)法 3．MPN法：即最可能數(shù)法(most probable number, MPN) 4．其它方法：包括顯微鏡直接計數(shù)法、比濁計數(shù)法、微菌落快速計數(shù)法、生化方法間接推算微生物量，以及半定量法（semi-quantitative method）等。,,,,,,103,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,104,分型鑒定的方法,噬菌體分型 細菌素分型 耐藥譜分型 血清學(xué)分型 質(zhì)粒圖譜分型,104,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,105,其他方法,微生物鑒定系統(tǒng) 免疫 核酸雜交 PCR G+C含量 基因芯片 蛋白質(zhì)芯片,105,2019/9/28,裴曉方 xxpei@,106,第四節(jié) 衛(wèi)生微生物研究 和檢測方法的前景,106,