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實(shí)驗(yàn)一瓊脂糖凝膠電泳 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求 學(xué)習(xí)與掌握DNA電泳的概念、分類以及技術(shù)方法，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度、含量以及分子量，及分離不同大小DNA片段。 二、實(shí)驗(yàn)原理 帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其相反的電極移動(dòng)，稱為電泳。DNA 分子是兩性電解質(zhì)， 在高于其等電點(diǎn)的溶液（ pH8.0-pH8.3 ）中 ，堿基幾乎不解離，磷酸基團(tuán)全部解離， DNA 分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，但主要為分子篩效應(yīng)。因此，核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定：（1）DNA的分子大小線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動(dòng)，因而遷移得越慢。 （2）DNA分子的構(gòu)象。當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速度是不一樣的，超螺旋DNA移動(dòng)得最快，而開環(huán)狀DNA移動(dòng)最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí)，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收，用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。 （3）電源電壓。在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)，片段越大，因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率達(dá)到最大，所加電壓不得超過5v/cm。 （4）離子強(qiáng)度影響。電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動(dòng)；在高離子強(qiáng)度的緩沖液中（如誤加10電泳緩沖液），則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。 溴化乙啶(Ethidium bromide, EB) 溴化乙淀（EB）是核酸的染色劑，DNA分子中形成熒光結(jié)合物， EB在紫外線照射下的發(fā)射熒光。熒光的強(qiáng)度與DNA的含量成正比，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置及估計(jì)出待測(cè)樣品的濃度。 三、實(shí)驗(yàn)試劑與器材 （一）材料 電泳儀，電泳槽，樣品梳子、瓊脂糖等 （二）試劑及藥品 TAE試劑、瓊脂糖、GoldView 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1、瓊脂糖凝膠的制備：稱取1g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入100ml TAE緩沖液中，將該三角瓶置于微波爐中加熱使瓊脂糖溶解，冷卻至50~60℃時(shí)，加入5μl GoldView，充分混勻。 2、膠板的制備： ①取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈、晾干。 ②將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一水平位置模具上，安好擋板。 ③將溫?zé)岘傊侨芤旱谷肽z膜中，使膠液緩慢地展開，直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層。在凝膠槽中放入梳子，注意調(diào)節(jié)好數(shù)字之間的距離。凝膠的厚度在3～5mm之間。 ④室溫下靜置30min左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機(jī)玻璃內(nèi)槽放在含有0.5～1TAE（Tris-乙酸）工作液的電泳槽中使用，沒過膠面1mm以上。 3、點(diǎn)樣：用移液槍取5ul待測(cè)DNA樣品，與loading buffer液混合均勻，小心地加入到凝膠上樣孔中。 4、打開電泳儀，插好導(dǎo)線，電壓110V，電泳30min。也可根據(jù)指示染料移動(dòng)的位置，確定電泳是否終止。 5、電泳完成后切斷電泳，取出凝膠，置于紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果，并照相記錄。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 圖. DNA瓊脂糖凝膠電泳圖 圖中，1.泳道代表的是Marker 5.6.7.8.9 泳道是本組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 六、討論 由圖可知，本組DNA條帶還可以，不過還可以更清晰。主要可以從以下幾條來改進(jìn)： 1） 點(diǎn)樣的時(shí)候要小心，不要戳到點(diǎn)樣孔。 2） 稱量的時(shí)候嚴(yán)格按照配方。 3） 制膠的時(shí)候要等膠降到低于60℃之后再加入EB。