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聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離血清蛋白質(zhì) 【目的】 1 ． 掌握圓盤電泳分離血清蛋白的操作技術(shù)。 2 ．熟悉 聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理。 【原理】 帶電粒子在電場中向著與其自身電荷方向相反的電極移動，稱為電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝膠作為電泳介質(zhì)的電泳。在電泳時，蛋白質(zhì)在介質(zhì)中的移動速率與其分子的大小，形狀和所帶的電荷量有關(guān)。 聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，是由丙烯酰胺（ Acr ）單體和少量交聯(lián)劑 N,N- 亞甲基雙丙烯酰胺（ Bis ）在催化劑 過硫酸銨（ Ap ） 和加速劑 四甲基乙二胺（ TEMED ） 的作用下發(fā)生聚合反應(yīng)而制得的（其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見第 2 篇第 1 章）。 聚丙烯酰胺凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)眼的孔徑大小可用改變凝膠液中單體的濃度或單體與交聯(lián)劑的比例來加以控制。根據(jù)血清蛋白分子量的大小，學(xué)生實(shí)驗(yàn)一般選用 7 ％聚丙烯酰胺凝膠分離血清蛋白質(zhì)。 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳利用濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)的三重作用分離物質(zhì)（見第 2 篇第 1 章）， 使樣品分離效果好， 分辨率較高。一般醋酸纖維薄膜電泳只能把血清蛋白質(zhì)分離出 5 ～ 7 條帶，而聚丙烯酰胺凝膠電泳卻能分離出十幾條到幾十條來（圖 3-4 ），是 目前較好的支持介質(zhì)， 應(yīng)用十分廣泛。 圖 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜 根據(jù)凝膠支持物的形狀不同，分為垂直板電泳和盤狀電泳兩種，二者原理相同。本實(shí)驗(yàn)采用的盤狀電泳是在直立的玻璃管中，以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠作為支持物，采用電泳基質(zhì)的不連續(xù)體系，使樣品在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮（濃縮效應(yīng)）成厚 度 為 10 -2 cm 的起始區(qū)帶，然后再利用 分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)的雙重作用在分離膠中 進(jìn)行電泳分離。 【器材】 1 ．電泳儀 直流穩(wěn)壓電源，電壓 400 ～ 500V ，電流 50mA 。 2 ．垂直管型圓盤電泳裝置 目前這類裝置的種類很多，可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求選擇其中的一種。這類裝置均由兩個基本的部分組成，一部分為載膠玻璃管，須選用內(nèi)徑均勻（ 5 ～ 6mm ） , 外徑 7 ～ 8mm ，長 80 ～ 100mm 的玻璃管作為材料，也可以使用更細(xì)的玻璃管。另一部分為電泳液槽，可分為上下兩槽 。電泳時，上下兩槽通過凝膠柱溝通電流（圖 3-5 ）。 圖 3-5 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖 (A 為正面， B 為剖面 ) 3 ．大號試管和中號試管 4 ．微量移液器 5 ． 5ml 注射器和 9 號注射針頭 6 ．洗耳球、濾紙條、封口膜等 【試劑】 1 ．丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺 一般性的分析工作，用分析純的 Acr 和 Bis 即可，精細(xì)的分析工作，尤其是分子量的測定和定量分析，需商品 Acr 和 Bis 進(jìn)行重結(jié)晶，進(jìn)一步純化。 2 ． N ， N ， N ＇， N ＇ — 四甲基乙二胺（ TEMED ） 商品 TEMED 即可，低溫，避光保存。 3 ． 10% 過硫酸銨溶液（ AP ， W/V ） 10g 過硫酸銨定容到 10ml ，最好使用新鮮配制的溶液。 4 ．染色液 取三氯乙酸 200 g 加水 500ml ，然后加入 10 g 考馬斯亮藍(lán) R 250 用玻璃棒攪拌，待完全溶解后，再加入蒸餾水加至 1000ml 。 5 ．脫色液的配制 取三氯乙酸 100 g 加蒸餾水溶解后加至 1000ml 。 6 ．儲備液的配制 電極緩沖液、凝膠緩沖液及凝膠儲備液配制見下表： 濃縮膠 緩沖液 Tris 5.98g 1mol/L HCl 48ml 加蒸餾水至 100ml PH 6.7 凝膠儲液 Acr 30.0g Bis 0.8g 加蒸餾水至 100ml 分離膠 緩沖液 Tris 36.3g 1mol/LHCl 48ml 加蒸餾水至 100ml PH 8.9 凝膠儲液 Acr 30.0g Bis 0.8g 加蒸餾水至 100ml 10 電極緩沖液 Tris 6g Gly 28.8g 加蒸餾水至 1000ml PH 8.3 儲液配制好后放冰箱 4 ℃ 冷藏備用，用時 10 倍稀釋，學(xué)生用時大約 3 天需更換一次。 7 ．凝膠液的配制 分離膠和濃縮膠的配制見下表： 7% 分離膠配制（ ml ） 3% 濃縮膠配制（ ml ） 雙蒸水 13.5 雙蒸水 5.7 凝膠儲液 7 凝膠儲液 1 PH 8.9 緩沖液 7.5 PH 6.7 緩沖液 1.3 1%TEMED 2 1%TEMED 2 總體積 30 總體積 10 8 ． 20% 蔗糖 100ml 取蔗糖 20g ，加少許蒸餾水溶解，最后加至 100 ml 。 9 ．加樣緩沖液的配制 ( PH6.7 ) 取 1mol 鹽酸 4.8 ml ， Tris 0.6g ， 20% 蔗糖溶液 40ml ，加水至 80ml 充分混勻后，再加入 0.02g 溴酚藍(lán)， 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩? 【操作】 1 ．凝膠系統(tǒng)的聚合和制備 一般先制備分離膠，然后再在分離膠上面制作濃縮膠。 （ 1 ）電泳玻璃管的準(zhǔn)備 取一根潔凈的電泳玻璃管，垂直放在青霉素瓶蓋的凹穴中或用封口膜密封，備用。 （ 2 ）分離膠（小孔膠）的制備 取分離膠 3ml 放入試管，加入 100μl 10% Ap 溶液混勻后使用。 用微量移液器抽取膠液小心迅速加入到玻璃管內(nèi)，當(dāng)加到液面距離電泳玻璃管上口 2cm 時停止（約 1.6ml ）。注意在加的過程中不要混進(jìn)空氣，用過的注射器和針頭要及時用水清洗，防止堵塞。 再在其上面小心覆蓋 0.5cm 高的蒸餾水層（約 0.2ml ）以隔絕空氣，并防止柱表面的彎月面。加水過程中不要用力過猛，防止將液面膠液沖起。剛加入水層時在水層和膠面的交接處可見一明顯的折光面，此折光面會逐漸消失，等再次出現(xiàn)時標(biāo)志分離膠聚合已經(jīng)開始，應(yīng)使玻璃管垂直靜置約 15~20 分鐘后，完成凝膠的聚合過程。然后用濾紙小心吸去表面的水層，切勿破壞膠面的完整性。 （ 3 ）濃縮膠（大孔膠）的制備 取濃縮膠 1ml 放入試管，加入 50μl 10%Ap 溶液混勻后使用。 用微量移液器吸取少量濃縮膠緩沖液漂洗一下分離膠的膠面，用濾紙吸取殘留的緩沖液，濾紙盡量不要接觸膠表面。 再加入約 1cm 高的濃縮膠（約 0.25ml ），表面也覆蓋一層蒸餾水。剛加入水層時在水層和膠面的交接處可見一明顯的折光面，此折光面會逐漸消失，等再次出現(xiàn)時標(biāo)志濃縮膠聚合已經(jīng)開始，聚合 20~30 min 后除去上面的水層，同樣不要破壞膠面的完整性。 吸去水層后用電泳緩沖液漂洗膠面，再用電泳緩沖液注滿至管口，在室溫下放置 10~20 min 后即可使用了。 2 ．樣品的制備和點(diǎn)樣 （ 1 ）樣品的準(zhǔn)備：取兔血清 0.5ml ，加入 3ml 加樣緩沖液混合?？稍?4 ℃ 冰箱保存 2 周。 （ 2 ）點(diǎn)樣：將制好的膠管裝入電泳槽中調(diào)節(jié)高度并塞緊，防止電泳中產(chǎn)生漏液。然后分別在電泳槽的上下槽體內(nèi)注入電泳緩沖液，下槽的液面應(yīng)沒過玻璃管的下管口（注意不要有氣泡存在）和電極絲；上槽的液面應(yīng)沒過玻璃管口 0.5~ 1cm 。用微量注射器吸取 50μl 樣品；標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品 1 份（蛋白質(zhì)含量 1mg/ml ，溶于加樣緩沖液中）小心的加入玻璃管內(nèi)，注意不要讓樣品溢出管口。 4 ．電泳 （ 1 ）電流電壓條件 圓盤電泳：直流穩(wěn)流電流強(qiáng)度通常為 4mA/ 管 。 （ 2 ）電泳時間 一般約需 3 小時。樣品中溴酚藍(lán)電泳至距分離膠前緣約 1cm 處時即可停止電泳。 5 ．剝膠 電泳結(jié)束后，取下玻璃管，用帶長針頭的注射器（內(nèi)盛蒸餾水）從濃縮膠一端緊貼玻璃管壁緩慢插入針頭，一面注入蒸餾水一面緩慢旋轉(zhuǎn)玻璃管?？克鞯膲毫蜐櫥饔檬鼓z和玻璃管的內(nèi)壁分開，待水流從另一端流出時，再慢慢將針頭退出（注意操作中不要把膠條攪碎）。然后用洗耳球輕輕在膠管的一端加壓，將膠條從玻璃管中緩慢滑出。 6 ．染色和脫色 剝膠完畢后，將膠條放入染色液中過夜（ 16 小時以上）。 將膠條以自來水沖洗兩次，然后在脫色液中脫色約 5 分鐘，共兩次。 7 ．結(jié)果分析 脫色完全后，從脫色槽中取出凝膠（小心折斷或撕裂），觀察區(qū)帶的數(shù)量及遷移率。如果需定量，可進(jìn)行區(qū)帶掃描，計(jì)算出各區(qū)帶中蛋白質(zhì)的含量。 【注意事項(xiàng)】 1 ．制膠時必須以封口膜將管下口封嚴(yán)密，加 AP 后立即灌膠。 2 ．灌凝膠時不能有氣泡，以免影響電泳時電流的通過。 3 ．電泳時，電泳儀與電泳槽間正、負(fù)極不能接錯，以免樣品反方向泳動，電泳時應(yīng)選用合適的電流、電壓，過高或者過低都會影響電泳效果。 4 ．電泳時，為保證電泳結(jié)果滿意，最好使用新稀釋的緩沖液。 5 ．丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺均為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，操作時宜帶手套，純化應(yīng)在通風(fēng)柜中進(jìn)行。 【思考題】 1 ． 聚丙烯酰胺凝膠作為電泳支持物，有何優(yōu)缺點(diǎn)？ 2 ． 哪些因素可以影響凝膠的聚合？ 3 ． 為什么在樣品中加含有少許溴酚藍(lán)的 40 ％蔗糖溶液？蔗糖及溴酚藍(lán)各有何用途？ 附： 1 ． 不同濃度 聚丙烯酰胺 凝膠的配制，見表 3 -2 。 表 3-2 不同濃度 聚丙烯酰胺 凝膠的配制 分離膠濃度 試劑名稱 配制 30ml 不同濃度分離膠液所需試劑量（ ml ） 配制 10ml 3% 濃縮膠 7% 10% 12% 15% 20% 分離膠 儲備液 緩沖液 7 7.5 10 7.5 12 7.5 15 7.5 20 7.5 濃縮膠 儲備液 緩沖液 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 1.0 1.25 1%TEMED 蒸餾水 2 13.3 2 10.3 2 8.3 2 5.3 2 0.3 2 5.65 以上各液加入后，為了去除抑制凝膠聚合的氧，在加入 Ap 之前應(yīng)進(jìn)行抽氣處理。 10% 過硫酸胺 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 2 ．幾種染料的性能及染色原理 （ 1 ）氨基黑 10B(amino black 10B) C 22 H 13 O 12 N 6 S 3 Na 3 ， MW=715,λmax=620 ～ 630mm 。氨基黑是酸性染料，其磺酸基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽。是最常用的蛋白質(zhì)染料。缺點(diǎn)是靈敏度不太高，對 SDS— 蛋白質(zhì)染色效果不好，對不同的蛋白質(zhì)著色度不同，色調(diào)不一（有藍(lán)、黑、棕等）。 （ 2 ）考馬斯亮藍(lán) R 250 (Comassie brilliant blue R 250 ) ： C 45 H 44 O 7 H 3 S 2 Na ， MW=824 ， λmax=560 ～ 590mm ，原理與氨基黑相似，靈敏度比氨基黑高 5 倍。尤其適用于 SDS 電泳微量蛋白質(zhì)染色。但蛋白質(zhì)濃度超出一定范圍時，對高濃度蛋白質(zhì)的染色不合乎 Beer 定律。 （ 3 ）考馬斯亮藍(lán) G 250 ： 比考馬斯亮藍(lán) R 250 多 2 個甲基， MW=854 ， λmax=590 ～ 610mm 。染色的靈敏度不如 R 250 ，但比氨基黑高 3 倍，優(yōu)點(diǎn)在于它在三氯乙酸中不溶解成膠體，能選擇地染蛋白質(zhì)而幾乎無本底色。所以常用于需重復(fù)性染色和穩(wěn)定性的染色，適于定量分析。 聚丙烯酰胺不連續(xù)盤狀電泳和垂直板電泳基本原理是相同的。后者適用于需要對比性分析的樣品的電泳分析。這項(xiàng)電泳技術(shù)（ PAGE ）由于能夠使樣品區(qū)帶濃縮變窄，所以分辨力高、設(shè)備簡單、樣品量?。?1 ～ 100μg ）；時間短，操作方便，可分離生物大分子的分子大小范圍廣泛，可結(jié)合 SDS 后進(jìn)行亞基分析和分子量測定。這種方法目前幾乎代替了超速離心沉降法。 PAGE 的用途較廣，對生物大分子能進(jìn)行分離、定性、定量分析，又能用于制備 mg 水平的材料 。 3 ．蛋白質(zhì)染色方法（表 3-3 ） 表 3-3 蛋白質(zhì)染色方法 方 法 固 定 液 染 液 染 色 時 間 脫 色 氨基黑 10B 甲醇或 7% 乙酸 0.1mol/L 氫氧化鈉 - 1% 氨基黑 或 7% 乙酸 - 1% 氨基黑 5 min （室溫） 2 h （室溫）或 10min （ 96 ℃ ） 5% 乙醇，過夜 7% 乙酸，過夜 考馬斯亮藍(lán) R 250 10% 三氯乙酸 20% 三氯乙酸 -1%R 250 過夜 10% 三氯乙酸 考馬斯亮藍(lán) G 250 10% 乙酸 20% 乙酸 - 1%G 250 10 min （室溫） 甲醇 - 水 - 濃氨水 64 ∶ 36 ∶ 1