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第十二章細胞增殖及其調(diào)控,細胞增殖(cellproliferation)的意義,◆細胞增殖(cellproliferation)是細胞生命活動的重要特征之一,是生物繁育的基礎?！魡渭毎锛毎鲋硨е律飩€體數(shù)量的增加?！舳嗉毎镉梢粋€單細胞(受精卵)分裂發(fā)育而來，細胞增殖是多細胞生物繁殖基礎。◆成體生物仍然需要細胞增殖，主要取代衰老死亡的細胞，維持個體細胞數(shù)量的相對平衡和機體的正常功能?！魴C體創(chuàng)傷愈合、組織再生、病理組織修復等，都要依賴細胞增殖。,第一節(jié)細胞周期概述,一、什么是細胞周期,細胞周期指由細胞分裂結束到下一次細胞分裂結束所經(jīng)歷的過程，所需的時間叫細胞周期時間。其間細胞遺傳物質(zhì)和其他內(nèi)含物分配給子細胞?？煞譃樗膫€階段（圖13-1）：①G1期(gap1)，指從有絲分裂完成到期DNA復制之前的間隙時間；②S期(synthesisphase)，指DNA復制的時期，只有在這一時期H3-TDR才能摻入新合成的DNA中；③G2期(gap2)，指DNA復制完成到有絲分裂開始之前的一段時間；④M期又稱D期(mitosisordivision)，細胞分裂開始到結束。,,細胞周期可劃分為四個階段,細胞周期時間,不同細胞的細胞周期時間差異很大S+G2+M的時間變化較小，細胞周期時間長短主要差別在G1期有些分裂增殖的細胞缺乏G1、G2期,從增殖的角度來看，可將高等動物的細胞分為三類：①連續(xù)分裂細胞，在細胞周期中連續(xù)運轉因而又稱為周期細胞，如表皮生發(fā)層細胞、部分骨髓細胞。②休眠細胞暫不分裂，這類細胞可長期停留在G1早期而不越過R點，處于增殖靜止狀態(tài)。它們合成具有特殊功能的RNA和蛋白質(zhì)，使細胞的結構和功能發(fā)生分化，但這類細胞并未喪失增殖能力，在一定條件下可以恢復其增殖狀態(tài)，但需要經(jīng)過較長的恢復時間，稱G0期細胞，如淋巴細胞、肝、腎細胞等。③不分裂細胞，指不可逆地脫離細胞周期，不再分裂的細胞，又稱終端細胞，如神經(jīng)、肌肉、多形核細胞等等。,二、細胞周期時間的測定,標記有絲分裂百分率法（percentagelabeledmitoses，PLM）是一種常用的測定細胞周期時間的方法。其原理是對測定細胞進行脈沖標記、定時取材、利用放射自顯影技術顯示標記細胞，通過統(tǒng)計標記有絲分裂細胞百分數(shù)的辦法來測定細胞周期。,有關名詞：,TG1：G1期的持續(xù)時間TG2：G2期的持續(xù)時間TS：S期的持續(xù)時間TM：M期的持續(xù)時間TC：一個細胞周期的持續(xù)時間PLM：標記的有絲分裂細胞所占的比例TDR：胸腺嘧啶核苷，是DNA的特異前體，能被S期細胞攝入，而摻進DNA中。通常使用的是3H或者14C標記的TDR。,測定原理（圖13-2）：,①待測細胞經(jīng)3H-TDR標記后，所有S期細胞均被標記。②S期細胞經(jīng)G2期才進入M期，所以一段時間內(nèi)PLM=0。③開始出現(xiàn)標記M期細胞時，表示處于S期最后階段的細胞，已渡過G2期，所以從PLM=0到出現(xiàn)PLM的時間間隔為TG2。④S期細胞逐漸進入M期，PLM上升，到達到最高點的時候說明來自處于S最后階段的細胞，已完成M，進入G1期。所以從開始出現(xiàn)M到PLM達到最高點（≈100%）的時間間隔就是TM。⑤當PLM開始下降時，表明處于S期最初階段的細胞也已進入M期，所以出現(xiàn)PLM到PLM又開始下降的一段時間等于TS。⑥從PLM出現(xiàn)到下一次PLM出現(xiàn)的時間間隔就等于TC，根據(jù)TC=TG1+TS+TG2+TM即可求出的TG1長度。,細胞周期各階段的時間與PLM的關系,◆流式細胞儀測定法(FlowCytometry),DNA的含量隨細胞周期(G1，S，G2，M)的各個時期呈現(xiàn)出周期性的變化：G1期，是細胞RNA和蛋白質(zhì)的合成期，即DNA合成前期,此時細胞核內(nèi)DNA含量保持二倍體；進入S期后，DNA開始合成，即DNA合成期,細胞核內(nèi)DNA的含量介于二倍體至四倍體之間；細胞進入G2期，即細胞分裂前期，DNA含量為四倍體,直到進入M期，即細胞分裂期,細胞分成兩個子細胞,M期結束進入下一個細胞周期。G1期:DNA的含量為二倍體S期:DNA的含量為二倍體至四倍體混合G2,M期:DNA的含量為四倍體,三、細胞同步化,細胞同步化(synchronization)是指在自然過程中發(fā)生或經(jīng)人為處理造成的細胞周期同步化，前者稱自然同步化，后者稱為人工同步化。,（一）自然同步化,1．多核體如粘菌只進行核分裂，而不發(fā)生胞質(zhì)分裂，形成多核體。數(shù)量眾多的核處于同一細胞質(zhì)中，進行同步化分裂，使細胞核達108，體積達5~6cm。瘧原蟲也具有類似的情況。2．某些水生動物的受精卵如海膽卵可以同時授精，最初的3次細胞分裂是同步的，再如大量海參卵受精后，前9次細胞分裂都是同步化進行的。3．增殖抑制解除后的同步分裂如真菌的休眠孢子移入適宜環(huán)境后，它們一起發(fā)芽，同步分裂。,（二）人工同步化,1．選擇同步化,1）有絲分裂選擇法：使單層培養(yǎng)的細胞處于對數(shù)增殖期，此時分裂活躍，MI高。有絲分裂細胞變圓隆起，與培養(yǎng)皿的附著性低，此時輕輕振蕩，M期細胞脫離器壁，懸浮于培養(yǎng)液中，收集培養(yǎng)液，再加入新鮮培養(yǎng)液，依法繼續(xù)收集，則可獲得一定數(shù)量的中期細胞。其優(yōu)點是，操作簡單，同步化程度高，細胞不受藥物傷害，缺點是獲得的細胞數(shù)量較少。（分裂細胞約占1%～2%）2）細胞沉降分離法：不同時期的細胞體積不同，而細胞在給定離心場中沉降的速度與其半徑的平方成正比，因此可用離心的方法分離。其優(yōu)點是可用于任何懸浮培養(yǎng)的細胞,省時，效率高，成本低，缺點是同步化程度較低。,2．誘導同步化,1）DNA合成阻斷法：選用DNA合成的抑制劑，可逆地抑制DNA合成，而不影響其他時期細胞的運轉，最終可將細胞群阻斷在S期或G/S交界處。5-氟脫氧尿嘧啶、羥基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高濃度ADR、GDR和TDR，均可抑制DNA合成使細胞同步化。其中高濃度TDR對S期細胞的毒性較小，因此常用TDR雙阻斷法誘導細胞同步化：在細胞處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)基中加入過量TDR。S期細胞被抑制，其它細胞繼續(xù)運轉，最后停在G1/S交界處。移去TDR。洗滌細胞并加入新鮮培養(yǎng)液、細胞又開始分裂。當釋放時間大于TS時，所有細胞均脫離S期，再次加入過量TDR，細胞繼續(xù)運轉至G1/S交界處，被過量TDR抑制而停止。優(yōu)點是同步化程度高，適用于任何培養(yǎng)體系。可將幾乎所有的細胞同步化。缺點是產(chǎn)生非均衡生長，個別細胞體積增大。2）中期阻斷法：利用破壞微管的藥物將細胞阻斷在中期，常用的藥物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性較少。優(yōu)點是無非均衡生長現(xiàn)象，缺點是可逆性較差。,3.條件依賴性突變株在細胞周期同步化中的應用,將與細胞周期調(diào)控有關的條件依賴性突變株轉移到限定條件下培養(yǎng)，所有細胞便被同步化在細胞周期中某一特定時期。,四、特異的細胞周期,特異的細胞周期是指那些特殊的細胞所具有的與標準的細胞周期相比有著鮮明特點的細胞周期。,⑴爪蟾早期胚胎細胞的細胞周期,細胞分裂快,無G1期,G2期非常短,S期也短(所有復制子都激活),以至認為僅含有S期和M期無需臨時合成其它物質(zhì)子細胞在G1、G2期并不生長，越分裂體積越小細胞周期調(diào)控因子和調(diào)節(jié)機制與一般體細胞標準的細胞周期基本是一致的,⑵酵母細胞的細胞周期,酵母細胞的細胞周期與標準的細胞周期在時相和調(diào)控方面相似，酵母細胞周期明顯特點:酵母細胞周期持續(xù)時間較短；封閉式細胞分裂，即細胞分裂時核膜不解聚；紡錘體位于細胞核內(nèi)；在一定環(huán)境下，也進行有性繁殖,⑶植物細胞的細胞周期,植物細胞的細胞周期與動物細胞的標準細胞周期非常相似，含有G1期、S期、G2期和M期四個時期。植物細胞不含中心體，但在細胞分裂時可以正常組裝紡錘體。植物細胞以形成中板的形式進行胞質(zhì)分裂,中期(metaphase),◆所有染色體排列到赤道板(MetaphasePlate)上，標志著細胞分裂已進入中期◆是什么機制確保染色體正確排列在赤道板上？著絲粒微管動態(tài)平衡形成的張力,關于細胞分裂：,.,,MTbehaviorduringformationofthemetaphaseplate.Initially,MTfromoppositepolesaredifferentinlength.,,Experimentaldemonstrationoftheimportanceofmecha-nicaltensioninmetaphasecheckpointcontrol.,后期(anaphase),◆排列在赤道面上的染色體的姐妹染色單體分離產(chǎn)生向極運動◆后期(anaphase)大致可以劃分為連續(xù)的兩個階段，即后期A和后期B后期A，動粒微管去裝配變短，染色體產(chǎn)生兩極運動后期B，極間微管長度增加，兩極之間的距離逐漸拉長，介導染色體向極運動,第二節(jié)細胞周期調(diào)控,,◆在適當時候激活細胞周期各個時相的相關酶和蛋白,然后自身失活(正調(diào)控)◆確保每一時相事件的全部完成(負調(diào)控)◆對外界環(huán)境因子起反應(如多細胞生物對增殖信號的反應),細胞周期調(diào)控系統(tǒng)的主要作用,一、研究背景,Rao和Johnson(1970、1972、1974)將Hela細胞同步于不同階段，然后與M期細胞混合，在滅活仙臺病毒介導下，誘導細胞融合，發(fā)現(xiàn)與M期細胞融合的間期細胞產(chǎn)生了形態(tài)各異的早熟凝集染色體(prematurelycondensedchromosome，PCC)，這種現(xiàn)象叫做早熟染色體凝集(prematurechromosomecondensation)。,G1期PCC為單線狀，因DNA未復制。S期PCC為粉末狀，因DNA由多個部位開始復制。G2期PCC為雙線染色體，說明DNA復制已完成。,不同形態(tài)的PCC,不僅同類M期細胞可以誘導PCC，不同類的M期細胞也可以誘導PCC產(chǎn)生，如人和蟾蜍的細胞融合時同樣有這種效果，這就意味著M期細胞具有某種促進間期細胞進行分裂的因子，即成熟促進因子(maturationpromotingfactor，MPF)。,早在1960s，YoshioMasui發(fā)現(xiàn)成熟蛙卵的提取物能促進未成熟卵的胚胞破裂(GerminalVesicleBreakdown，GVBD)，后來Sunkara將不同時期Hela細胞的提取液注射到蛙卵母細胞中，發(fā)現(xiàn)G1和S期的抽取物不能誘導GVBD，而G2和M期的則具有促進胚胞破裂的功能，它將這種誘導物質(zhì)稱為有絲分裂因子(MF)。后來在CHO細胞，酵母和粘菌中也提取出相同性質(zhì)的MF。這類物質(zhì)被統(tǒng)稱為MPF。,處于第六期的爪蟾卵母細胞（RD前期I），具GV。,Masui和Markert用孕酮誘導卵母細胞成熟，并用成熟卵母細胞的細胞質(zhì)注射到卵母細胞，發(fā)現(xiàn)可以促進卵母細胞成熟，繼續(xù)用該卵母細胞細胞質(zhì)誘導新的卵母細胞，仍然可以促進卵母細胞成熟。因而他們推測成熟卵母細胞中必然有一種物質(zhì)可以誘導卵母細胞成熟，即MPF。,1960sHartwell以芽殖酵母（圖13-16）為實驗材料，利用阻斷在不同細胞周期階段的溫度敏感突變株（在適宜的溫度下和野生型一樣），分離出了幾十個與細胞分裂有關的基因(celldivisioncyclegene，CDC)。如芽殖酵母的cdc28基因，在G2/M轉換點發(fā)揮重要的功能。Hartwell還通過研究酵母菌細胞對放射線的感受性，提出了checkpoint（細胞周期檢驗點）的概念，意指當DNA受到損傷時，細胞周期會停下來。,芽殖酵母細胞周期,1970sPaulNurse等人以裂殖酵母（圖13-17）為實驗材料，同樣發(fā)現(xiàn)了許多細胞周期調(diào)控基因，如：裂殖酵母cdc2、cdc25的突變型在限制的溫度下無法分裂；wee1突變型則提早分裂，而cdc25和wee1都發(fā)生突變的個體卻會正常地分裂（圖13-18）。進一步的研究發(fā)現(xiàn)cdc2和cdc28都編碼一個34KD的蛋白激酶，促進細胞周期的進行。而weel和cdc25分別表現(xiàn)為抑制和促進CDC2的活性。這也解釋了為何cdc25和wee1雙重突變的個體可以恢復野生型的表型。,Cdc25表達不足，細胞長得過長而不分裂；Wee1表達不足，細胞很小就開始分裂了,1983年TimothyHunt首次發(fā)現(xiàn)海膽卵受精后，在其卵裂過程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細胞周期劇烈振蕩，在每一輪間期開始合成，G2/M時達到高峰，M結束后突然消失，下輪間期又重新合成，故命名為周期蛋白(cyclin)。后來在青蛙、爪蟾、海膽、果蠅和酵母中均發(fā)現(xiàn)類似的情況，各類動物來源的細胞周期蛋白mRNA均能誘導蛙卵的成熟。用海洋無脊椎動物和兩棲類的卵為實驗材料進行這類實驗，好處在于卵的量比較大，而且在胚胎發(fā)育的早期，細胞分裂是同步化的。,◆MPF是一種使多種底物蛋白磷酸化的蛋白激酶；由M期Cyclin-Cdk(Cyclin-dependentproteinkinase)形成的復合物。MPF=p34cdc2蛋白激酶+cyclinB周期蛋白,?MPF的作用,◆促進染色體凝集●H1組蛋白磷酸化●H3組蛋白磷酸化◆核纖層磷酸化◆核被膜裝配◆細胞相關的酶與蛋白質(zhì)磷酸化,1988年M.J.Lohka純化了爪蟾的MPF，經(jīng)鑒定由32KD和45KD兩種蛋白組成，二者結合可使多種蛋白質(zhì)磷酸化（圖13-19）。后來PaulNurse（1990）進一步的實驗證明P32實際上是CDC2的同源物，而P45是cyclinB的同源物，從而將細胞周期三個領域的研究聯(lián)系在一起。2001年10月8日美國人LelandHartwell、英國人PaulNurse、TimothyHunt因對細胞周期調(diào)控機理的研究而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學獎（圖13-20）。,2001年諾貝爾生理醫(yī)學獎獲得者,二、CDK,CDC2與細胞周期蛋白結合才具有激酶的活性，稱為細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependentkinase，CDK)，因此CDC2又被稱為CDK1，激活的CDK1可將靶蛋白磷酸化而產(chǎn)生相應的生理效應，如將核纖層蛋白磷酸化導致核纖層解體、核膜消失，將H1磷酸化導致染色體的凝縮等等。這些效應的最終結果是細胞周期的不斷運行。因此，CDK激酶和其調(diào)節(jié)因子又被稱作細胞周期引擎。,目前發(fā)現(xiàn)的CDK在動物中有7種。各種CDK分子均含有一段相似的激酶結構域，這一區(qū)域有一段保守序列，即PSTAIRE，與周期蛋白的結合有關。,三、CKI,細胞中還具有細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CDKinhibitor，CKI）對細胞周期起負調(diào)控作用，目前發(fā)現(xiàn)的CKI分為兩大家族,①Ink4(Inhibitorofcdk4)，如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特異性抑制cdk4cyclinD1、cdk6cyclinD1復合物。,②Kip(Kinaseinhibitionprotein)：包括P21cip1(cyclininhibitionprotein1)、P27kip1(kinaseinhibitionprotein1)、P57kip2等，能抑制大多數(shù)CDK的激酶活性，P21cip1還能與DNA聚合酶δ的輔助因子PCNA（proliferatingcellnuclearantigen）結合，直接抑制DNA的合成,四、Cyclin,周期蛋白不僅僅起激活CDK的作用，還決定了CDK何時、何處、將何種底物磷酸化，從而推動細胞周期的前進。目前從芽殖酵母、裂殖酵母和各類動物中分離出的周期蛋白有30余種，在脊椎動物中為A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分為G1型、G1/S型S型和M型4類（見表13-1）。各類周期蛋白均含有一段約100個氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白框，介導周期蛋白與CDK結合。,表13-1不同類型的周期蛋白,*包括D1-3，各亞型cyclinD，在不同細胞中的表達量不同，但具有相同的功效,細胞在生長因子的刺激下，G1期cyclinD表達，并與CDK4、CDK6結合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，磷酸化的Rb釋放出轉錄因子E2F，促進許多基因的轉錄，如編碼cyclinE、A和CDK1的基因。,圖13-22CyclinD與CDK結合使Rb釋放結合的轉錄因子E2F,在G1-S期，cyclinE與CDK2結合，促進細胞通過G1/S限制點而進入S期。向細胞內(nèi)注射CyclinE的抗體能使細胞停滯于G1期，說明細胞進入S期需要CyclinE的參與。同樣將CyclinA的抗體注射到細胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能抑制細胞的DNA合成，推測CyclinA是DNA復制所必需的。,在G2-M期，cyclinA、cyclinB與CDK1結合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如將組蛋白H1磷酸化導致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體等下游細胞周期事件。,圖13-23Cyclin的周期性變化,在中期當MPF活性達到最高時，通過一種未知的途徑，激活后期促進因子APC，將泛素連接在cyclinB上，導致cyclinB被蛋白酶體（proteasome）降解，完成一個細胞周期（圖13-24）。,APC介導選擇性降解的靶蛋白與Ubiquitin結合(通過泛素依賴性途徑降解)APC主要介導兩類蛋白降解:AnaphaseInhibitors和MitoticCyclin.前者維持姐妹染色單體粘連,抑制后期啟動；后者的降解意味著有絲分裂即將結束，即染色體開始去凝集，核膜重建。Cdc20和Mad2蛋白位于動粒上，在染色體結合有絲分裂紡錘體前將不能從動粒上釋放，由于Mad2與Cdc20結合而抑制APC的活性。所以只有所有染色體都與紡錘體結合后，APC才有活性，才啟動細胞向后期轉換。,圖13-24CyclinB的降解途徑,分裂期周期蛋白N端有一段序列與其降解有關，稱降解盒(destructionbox，圖13-25)。當MPF活性達到最高時，通過泛素連接酶催化泛素與cyclin結合，cyclin隨之被26S蛋白酶體水解。G1周期蛋白也通過類似的途徑降解，但其N端沒有降解盒，C端有一段PEST序列與其降解有關。,泛素由76個氨基酸組成，高度保守，普遍存在于真核細胞，故名泛素。共價結合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識別和降解，這是細胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑，泛素相當于蛋白質(zhì)被摧毀的標簽。26S蛋白酶體是一個大型的蛋白酶，可將泛素化的蛋白質(zhì)分解成短肽。,圖13-25細胞周期蛋白的降解盒與降解途徑,在蛋白質(zhì)的泛素化過程中（圖13-25），E1（ubiquitin-activatingenzyme，泛素激活酶）水解ATP獲取能量，通過其活性位置的半胱氨酸殘基與泛素的羧基末端形成高能硫酯鍵而激活泛素，然后E1將泛素交給E2（ubiquitin-conjugatingenzyme，泛素結合酶），最后在E3（ubiquitin-ligase，泛素連接酶）的作用下將泛素轉移到靶蛋白上。參與細胞周期調(diào)控的泛素連接酶至少有兩類，其中SCF（skp1-cullin-F-boxprotein，三個蛋白構成的復合體）負責將泛素連接到G1/S期周期蛋白和某些CKI上，APC(anaphasepromotingcomplex)負責將泛素連接到M期周期蛋白上。,五、DNA復制當且僅當一次(P408),DNA的復制是由起始復制點（originsofreplication）開始的，起始復制點也就是上一章提到的自主復制序列，散布在染色體上。在整過細胞周期中，起始復制點上結合有起始識別復合體（Originrecognitioncomplex,ORC），其作用就象一個停泊點，供其它調(diào)節(jié)因子?？俊?CDC6是其中的一個調(diào)節(jié)因子，在G1期CDC6含量瞬間提高，CDC6結合在ORC上，在ATP供能下，促進6個亞單位構成的MCM復合體和其他一些蛋白結合到ORC上，形成前復制復合體（pre-replicativecomplex，pre-RC），MCM實際上就是DNA解旋酶（helicase）。,S-CDK觸發(fā)pre-RC的啟動，同時阻止了DNA再次進行復制，因為S-CDK將CDC6磷酸化，使其脫離ORC，磷酸化的CDC6隨后被SCF參與的泛素化途徑降解；S-CDK還可以將某些MCM磷酸化，使其被輸出細胞核。其它一些CDK也參與阻止pre-RC的再次形成，從而保證了DNA的復制當且僅當一次（圖13-26）。,微小染色體維持蛋白(Minichromosomemaintenanceproteins,Mcm),六、M期CDK的激活,M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的積累，有絲分裂周期中，cyclin的積累是因為在G2-M期M-cyclin基因轉錄的增強。,隨著M-cyclin的積累，結合周期蛋白的M-CDK（CDK1）增加，但是沒有活性，這是因為Wee1激酶將CDK1的Thr14和Tyr15磷酸化的緣故，這種機制保證了CDK-cyclin能夠不斷積累，然后在需要的時候突然釋放。,在M期，一方面Wee1的活性下降，另一方面CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障礙。CDC25可被兩種激酶激活，一是polo激酶，另一個是M-CDK本身。激活的M-CDK還可以抑制它的抑制因子Wee1的活性，形成一個反饋環(huán)。因此不難想象只要有少量的CDK被CDC25或polo激活，立即就會有大量的CDK被活化。,CDK的激活還需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDKactivatingkinaseCAK)的作用下完成的。,CDK1的調(diào)節(jié)與活化;CAK=CDK1-ActivitingKinase,Tyr15Inhibitory:AddedbyWee1RemovedbyCdc25,,Thr160Activating:CDKaddsafterCyclinbinding,,七、細胞周期檢驗點,細胞要分裂，必須正確復制DNA和達到一定的體積，在獲得足夠物質(zhì)支持分裂以前，細胞不可能進行分裂。細胞周期的運行，是在一系列稱為檢驗點（checkpoint）的嚴格檢控下進行的，當DNA發(fā)生損傷，復制不完全或紡錘體形成不正常，周期將被阻斷。,細胞周期檢驗點由感受異常事件的感受器、信號傳導通路和效應器構成，主要檢驗點包括（圖13-28）：,G1/S檢驗點:在酵母中稱start點，在哺乳動物中稱R點(restrictionpoint)，控制細胞由靜止狀態(tài)的G1進入DNA合成期，相關的事件包括：DNA是否損傷？細胞外環(huán)境是否適宜？細胞體積是否足夠大？,S期檢驗點：DNA復制是否完成？,G2/M檢驗點：是決定細胞一分為二的控制點，相關的事件包括：DNA是否損傷？細胞體積是否足夠大？,中-后期檢驗點（紡錘體組裝檢驗點）：任何一個著絲點沒有正確連接到紡錘體上，都會抑制APC的活性，引起細胞周期中斷。,Fourcheckpoints,ATM（ataxiatelangiectasia-mutatedgene）是與DNA損傷檢驗有關的一個重要基因。最早發(fā)現(xiàn)于毛細血管擴張性共濟失調(diào)癥患者，人類中大約有1%的人是ATM缺失的雜合子，表現(xiàn)出對電離輻射敏感和易患癌癥。正常細胞經(jīng)放射處理后，DNA損傷會激活修復機制，如DNA不能修復則誘導細胞凋亡，總之不會形成變異的細胞。,ATM編碼一個蛋白激酶，結合在損傷的DNA上，能將某些蛋白磷酸化，中斷細胞周期。其信號通路有兩條。,一條是激活Chk1（checkpointkinase）,Chk1引起CDC25的Ser216磷酸化，通過抑制CDC25的活性，抑制M-CDK的活性，使細胞周期中斷。,另一條是激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作為轉錄因子，導致P21的表達，P21抑制G1-S期CDK的活性，從而使細胞周期阻斷。,八、生長因子對細胞增殖的影響,生長因子是一大類與細胞增殖有關的信號物質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)的生長因子多達幾十種，多數(shù)有促進細胞增殖的功能，故又稱有絲分裂原（mitogen），如表皮生長因子（EGF）、神經(jīng)生長因子（NGF），少數(shù)具有抑制作用如抑素(chalone)，腫瘤壞死因子（TNF），個別如轉化生長因子β(TGF-β)具有雙重調(diào)節(jié)作用，能促進一類細胞的增值，而抑制另一類細胞。,生長因子不由特定腺體產(chǎn)生，主要通過旁分泌作用于鄰近細胞。各種生長因子分子量大小不同，如：肝細胞生長因子(HGF)由674個氨基酸組成，分子量達80KD，內(nèi)皮素僅由21個氨基酸組成。大多數(shù)生長因子僅由一條肽鏈組成，如EGF、TGF-α、FGF，而PDGF、NGF、TGF-β，肝細胞生長因子HGF由兩條肽組成。,生長因子的信號通路主要有：ras途徑，cAMP途徑和磷脂酰肌醇途徑。如通過ras途徑，激活MAPK，MAPK進入細胞核內(nèi)，促進細胞增殖相關基因的表達。如通過一種未知的途徑激活c-myc，myc作為轉錄因子促進cyclinD、SCF、E2F等G1-S有關的許多基因表達，細胞進入G1期（圖13-29）。,