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第四章 細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù),1,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)平臺(tái),基因治療 基因診斷 試管嬰兒 組織工程 藥物篩選 致病機(jī)理,,2,主要內(nèi)容,基本操作技術(shù)和要求 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)和細(xì)胞系的維持 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇 細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)和排除,3,細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位,1665年英國(guó)學(xué)者Robert Hooke，用自制的顯微鏡觀察軟木的薄片，第一次發(fā)現(xiàn)植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并首次借用拉丁文Cella（小室）詞. 1983-39德國(guó)植物學(xué)家施萊登和動(dòng)物學(xué)家施旺確立了“細(xì)胞學(xué)說(shuō)”的基本原則。 （１）細(xì)胞是有機(jī)體，動(dòng)植物都是由細(xì)胞發(fā)育來(lái)的； （２）每個(gè)細(xì)胞都作為一個(gè)相對(duì)的獨(dú)立單位，有自己 的“生命”。 （３）新的細(xì)胞可以通過(guò)老的細(xì)胞繁殖產(chǎn)生。 進(jìn)化論，遺傳學(xué)和細(xì)胞學(xué)說(shuō)定為現(xiàn)代生物學(xué)的三大基 石，而細(xì)胞學(xué)說(shuō)又是后二者的“基石“。,4,組織（細(xì)胞）培養(yǎng),從生物體內(nèi)取出細(xì)胞（組織），模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存、生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法 。 細(xì)胞（組織），包括器官培養(yǎng)終歸是離體培養(yǎng)，缺少生物整體的嚴(yán)密聯(lián)系，不能代表整個(gè)機(jī)體。在進(jìn)行醫(yī)學(xué)生物實(shí)驗(yàn)過(guò)程及對(duì)結(jié)果的評(píng)估是都必須考慮這些。,5,1 基本操作技術(shù)和要求,由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞沒(méi)有抗感染能力， 因此防污染是決定培養(yǎng)成功的首要條件。 一切操作需要保證無(wú)菌和有條不紊。,6,1 .1 培養(yǎng)室內(nèi)的無(wú)菌技術(shù),培養(yǎng)前的準(zhǔn)備：按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和程序 準(zhǔn)備 物品，作到心中有數(shù) 培養(yǎng)室和超凈臺(tái)：定期全面徹底消毒 培養(yǎng)用品的無(wú)菌處理：高壓滅菌、過(guò)濾、酒精消毒 實(shí)驗(yàn)中無(wú)菌培養(yǎng)操作：均在火焰近處進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)用品需火焰滅菌，冷卻后接觸培養(yǎng)細(xì)胞，以防燒死細(xì)胞。,7,1.2 培養(yǎng)細(xì)胞的 取材,基本要求： 取材組織用培養(yǎng)液浸泡，4度運(yùn)送，24h內(nèi)盡快培養(yǎng)。 取材無(wú)菌操作，避免對(duì)組織的機(jī)械損傷，盡量去除脂肪、神經(jīng)、結(jié)締、壞死組織，污染組織可用青鏈霉素和制霉菌素漂洗。 原代取材同時(shí)保留組織學(xué)和電鏡標(biāo)本，對(duì)供體來(lái)源、部位及一般情況做記錄。,8,1.2.3 皮膚和粘膜的取材,皮膚和粘膜是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的重要來(lái)源。 取材方法似斷層皮片手術(shù)，面積2-3mm2. 盡可能去除皮下和粘膜下組織。 因分布在體表，故細(xì)菌、霉菌很多，需嚴(yán)格消毒，可用較高濃度抗菌素漂洗。,9,1.2.4 內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材,內(nèi)臟除消化道和泌尿管道外基本是無(wú)菌的，明確取材部位，去除結(jié)締組織。 腫瘤組織取材避免壞死液化和結(jié)締組織， 標(biāo)本應(yīng)按污染組織處理。,10,1.2.5 血細(xì)胞的取材,血細(xì)胞培養(yǎng)可用于造血干細(xì)胞移植、免疫活性細(xì)胞的治療和染色體分析等。 取血抗凝劑量過(guò)大易導(dǎo)致溶血，肝素常用濃度為20U/ml, 針管用較高濃度肝素500U/ml濕潤(rùn)。,11,1.3 組織材料的分離,欲從組織中獲得大量生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，須將組織分散開(kāi)，使細(xì)胞解離出來(lái)。 常用方法有機(jī)械法和化學(xué)法。,12,1.3.1 細(xì)胞懸液的分離方法,離心法：血液和體液等細(xì)胞懸液500-1000rpm 轉(zhuǎn)速 5-10分鐘。離心速度過(guò)大、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)造成細(xì)胞損傷和死亡。 密度梯度離心法：用離心法將細(xì)胞分到不同密度的梯度介質(zhì)中，再分別吸出各層細(xì)胞。適于分離密度不等的的細(xì)胞。常用介質(zhì)有Ficoll 400, Percoll, 泛影葡胺等。。,13,1.3.2.1 機(jī)械分散法,適于較柔軟的組織，如腦、肝、脾、淋巴結(jié)、胸腺、胚胎組織和腫瘤組織等。 剪切組織為1mm3碎塊 后，置于組織勻漿研磨，或用吸管反復(fù)吹打分散組織細(xì)胞 組織液放在注射器內(nèi)通過(guò)針頭壓出。 注射器針芯擠壓后，用PBS液洗滌，分別通過(guò)不銹鋼篩網(wǎng)80,150,400目孔徑篩網(wǎng)。 記數(shù)活細(xì)胞數(shù)，制成細(xì)胞懸液接種。,14,1.3.2.3 消化分離法,消化法是結(jié)合生化和化學(xué)手段把已剪切成較小體積的組織進(jìn)一步分化，獲得細(xì)胞懸液直接進(jìn)行培養(yǎng),15,1.3.2.3.1 胰蛋白酶法,主要作用是對(duì)細(xì)胞間蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散。 活性以消化酪蛋白的能力測(cè)定，常用1：250 消化效果與pH值、溫度、酶濃度和組織塊大小與硬度有關(guān)， 對(duì)細(xì)胞分離作用與細(xì)胞的類型與性質(zhì)關(guān)系密切 鈣鎂離子和血清抑制活性 常用劑量為0.25% （0.1-0.5%），pH值 8（8-9）溫度 37。 4度配制應(yīng)用液。,16,1.3.2.3.2 膠原酶法,只對(duì)細(xì)胞間質(zhì)膠原組織起消化作用，使上皮細(xì)胞與膠原成份分離 產(chǎn)品有I-V VII -IX等型，分別適用于分離肝細(xì)胞、胰島、脂肪細(xì)胞腎及纖維組織 鈣鎂離子和血清不影響活性, pH.6.5-7 常用劑量為200單位/ml或0.1μg/ml ~0.3 μg/ml,17,1.3.2.3. 3 EDTA法,EDTA（二乙烯四乙酸二鈉）作用較緩和。 主要作用：能從組織生長(zhǎng)環(huán)境中吸取維持組織完整的鈣鎂離子。 單獨(dú)使用不能使細(xì)胞完全分散， 常用1:1的EDTA（0.02%）和胰蛋白酶0.25%混合液,18,2 原代培養(yǎng),也稱初代培養(yǎng), 是從供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)。 細(xì)胞保持原有的基本性質(zhì)，仍具二倍體遺傳物性。最接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性。適合作藥物測(cè)試，細(xì)胞分化研究。 原代培養(yǎng)細(xì)胞部分生物學(xué)特征尚不穩(wěn)定，供體和細(xì)胞間有很大差異。,19,2. 1 組織塊培養(yǎng)法,將組織剪成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶，24小時(shí)貼壁后，細(xì)胞就從組織周圍長(zhǎng)出。 培養(yǎng)瓶底預(yù)先涂以膠原薄層，以利上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。 如需做組織染色或電鏡檢查，可將組織可放入小蓋玻片上后再放進(jìn)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。 換液需輕巧，以免組織塊漂起，細(xì)胞死亡,20,2. 2 消化培養(yǎng)法,采用前述的組織消化分散法。將妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞間質(zhì)去除，使細(xì)胞分散，形成懸液，按不同濃度接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。,21,3 傳代培養(yǎng)和細(xì)胞系的維持,培養(yǎng)細(xì)胞增殖長(zhǎng)滿瓶壁時(shí)，既達(dá)到所謂的飽和密度。此時(shí)正常細(xì)胞則不再生長(zhǎng)；惡性細(xì)胞重疊生長(zhǎng)，易于從瓶壁上成片脫落,，為此傳代勢(shì)在必行。,22,培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程,1） 原代（初代）培養(yǎng)期：從機(jī)體取下組織培養(yǎng)到第一次傳代，此代細(xì)胞保持異質(zhì)性，細(xì)胞種類較多，接近原組織細(xì)胞種類。維持時(shí)間，因細(xì)胞種類不同，一般1-4周。 2） 傳代期培養(yǎng)：初代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)到一定程度，即可連接傳代，使其連續(xù)生長(zhǎng)。 一般正常二倍體細(xì)胞，不加附加條件，可傳代30-50代，此時(shí)可發(fā)生染色體丟失、突變、細(xì)胞增殖變慢、停止分裂，進(jìn)入衰退期，我們稱之有限細(xì)胞系。這一轉(zhuǎn)折點(diǎn)有人稱之危象臨界點(diǎn)（crisis） 有些細(xì)胞的少數(shù)后代，或通過(guò)人工條件轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可通過(guò)這一期，獲得持久的增殖傳代能力，我們稱細(xì)胞系，或無(wú)限細(xì)胞系，即一般通稱的細(xì)胞系。,23,,（3） 衰退期：傳代細(xì)胞到達(dá)一定代數(shù)，即發(fā)生增殖緩慢，逐 漸停止，進(jìn)而發(fā)生衰退、死亡，多數(shù)傳代細(xì)胞（或叫有限細(xì)胞系），不能通過(guò)所謂的“crisis（危象臨界點(diǎn)），導(dǎo)致最終死亡，這一現(xiàn)象可能說(shuō)明生物學(xué)衰老的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。 人胚胎成纖維細(xì)胞可以進(jìn)行60代增殖，而80歲老人的肺成纖維細(xì)胞僅傳代了16代后便死亡。表皮細(xì)胞壽命4-10天；紅細(xì)胞3周-3個(gè)月，白細(xì)胞5-7天，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)年或更多。,24,密度抑制（Density inhibition）或接觸抑制（Ccontact inhibition）,1958年Abercrombie 等學(xué)者提出的一種現(xiàn)象，培養(yǎng)細(xì)胞再生長(zhǎng)過(guò)程中多發(fā)生分裂增殖，細(xì)胞移動(dòng)而相互靠近，這時(shí)某些細(xì)胞可移向其他方向，保證細(xì)胞不會(huì)重疊，一但接觸，這種活動(dòng)即可停止。 所謂接觸抑制實(shí)際使細(xì)胞匯合形成單層時(shí)，細(xì)胞變得擁擠，與培養(yǎng)液接觸的表面區(qū)域也相應(yīng)減少，營(yíng)養(yǎng)成分消耗，其分裂也將停止。,25,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,細(xì) 胞 數(shù) 量,生長(zhǎng)天數(shù),緩慢生長(zhǎng)期,對(duì) 數(shù) 生 長(zhǎng) 期,平 衡 期,26,,（1） 遲緩期（或延遲期） 當(dāng)細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶后，細(xì)胞逐漸貼附于瓶底，并恢復(fù)貼壁形狀，代謝開(kāi)始旺盛，出現(xiàn)細(xì)胞分裂及增殖，但生長(zhǎng)緩慢。 （2） 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：此期幾乎所有的細(xì)胞都在進(jìn)行分裂，細(xì)胞數(shù)目迅速增長(zhǎng)。期細(xì)胞倍增時(shí)間（TD）等于細(xì)胞周期時(shí)間（TC）長(zhǎng)度。這一期常用細(xì)胞倍增時(shí)間及細(xì)胞分裂指數(shù)來(lái)判定。 （3） 平衡期（平坦期）這期細(xì)胞數(shù)目雖然在增加，但其增加速度在減慢，直至細(xì)胞數(shù)量不再增加，處于平衡狀態(tài)。,27,3.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)的傳代,細(xì)胞由培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離再培養(yǎng)稱之為傳代, 進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代。 原代培養(yǎng)的首次傳代是建系的關(guān)鍵時(shí)期，細(xì)胞需覆蓋大部分瓶底后再傳代。 首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增殖。,28,3.2 細(xì)胞傳代方法,貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代； 部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用直接吹打即可傳代； 懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞采用離心分離后傳代，,29,3.2.1 貼壁細(xì)胞傳代步驟,吸除瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液；加入1ml消化液；37C或室溫25 C消化2 ~ 5分鐘 顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后； 直接加少許含血清的培養(yǎng)液，終止消化； 細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。,30,3.2.2 懸浮細(xì)胞的傳代,直接傳代即讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清洗掉1/2 ~ 1/3，然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后，再傳代。 離心法：離心800 ~ 1000rpm，5min，除上清，加新的培養(yǎng)液，然后傳代接種。 部分貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞直接吹打傳代或需消化后傳代,31,3.3 細(xì)胞系的維持,是通過(guò)換液、傳代和細(xì)胞凍存實(shí)現(xiàn)的： 建立檔案：記錄組織來(lái)源，生物學(xué)特性，培養(yǎng)液要求、傳代、換液時(shí)間和規(guī)律，細(xì)胞的遺傳學(xué)標(biāo)志，生長(zhǎng)形態(tài)，常規(guī)病理染色的標(biāo)本等。,32,3.3 細(xì)胞系的維持,防細(xì)胞之間的交叉污染，傳代時(shí)所用器械要編號(hào)或做好標(biāo)記 每一種細(xì)胞系都應(yīng)有充足的凍存儲(chǔ)備，以防絕種； 另外二倍體細(xì)胞等有限細(xì)胞系如果暫時(shí)不用最好凍存以免傳代太多，造成細(xì)胞衰老或發(fā)生改變,33,4.3.4 培養(yǎng)細(xì)胞的純化,自然純化 自然純化 即利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，而排除其它細(xì)胞生長(zhǎng)，靠自然的增殖潛力最后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，去除其它細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。,34,4.3.4.2 人工純化,利用人為手段造成對(duì)某一細(xì)胞生長(zhǎng)有利的環(huán)境條件，抑制其它細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的。,35,3.4.2.1 酶消化法,酶消化法：由于上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同,，成纖維細(xì)胞先脫壁，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才脫壁，利用這種差異采用多次差別消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開(kāi)。,36,3.4.2 .2 機(jī)械劃除法,機(jī)械劃除法：上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞多數(shù)都同時(shí)出現(xiàn)，混雜生長(zhǎng)常常分區(qū)呈片，采用機(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域，而保留需要的細(xì)胞。,37,3.4.2 .3 反復(fù)貼壁法,成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞相比，其貼壁過(guò)程快，大部分細(xì)胞常能在短時(shí)間內(nèi)大約10 ~ 30min完成附著過(guò)程（但不一定完全伸展）；而上皮細(xì)胞大部分細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，這樣可以利用此差別來(lái)純化細(xì)胞,38,3.4.2 .4 克隆法,將細(xì)胞分成單個(gè)細(xì)胞，使之分別生長(zhǎng)成克隆，然后對(duì)每一克隆進(jìn)行測(cè)試，選擇出所需要的克隆。,39,3.4.2 .5 培養(yǎng)基限定方法,某些細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中必須存在或必須去除某種物質(zhì)，否則將無(wú)法生長(zhǎng)。而其它細(xì)胞與之相反，可以利用這種技術(shù)來(lái)純化細(xì)胞。如雜交瘤技術(shù)常用的HAT培養(yǎng)液，就用來(lái)篩選雜交瘤細(xì)胞而抑制其它細(xì)胞。,40,4.1 細(xì)胞的凍存,凍存細(xì)胞要緩慢冷凍。 減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成是減少細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。 冷凍保護(hù)劑的使用，可使細(xì)胞免受冰晶形成和滲透壓改變而致的損傷。常用二甲基亞砜和甘油。 凍存細(xì)胞最好每三個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測(cè)細(xì)胞原特性是否改變。,41,細(xì)胞凍存步驟,取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞消化成細(xì)胞懸離心 細(xì)胞記數(shù) 2.5x106/ml凍存液 加含10%DMSO凍存液熔封 置4度數(shù)小時(shí)，負(fù)20度過(guò)夜 或 -70°C放置2-3h 移入液氮罐中 記錄,42,細(xì)胞復(fù)蘇步驟,取出安瓶立即放入37°C水中 消毒安瓶開(kāi)封后將細(xì)胞 移入離心管中加培養(yǎng)液離心 記數(shù) 接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng),43,4.3培養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)輸,冷凍儲(chǔ)存運(yùn)輸，即利用特殊容器內(nèi)盛液氮或干冰凍存 充液法：（1）選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞。一般以生長(zhǎng)1/3 ~ 1/2瓶底壁為宜，換新液，保留微量空氣，擰緊瓶蓋（2）用棉花等做防震防壓處理,44,5細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)和排除,培養(yǎng)細(xì)胞的污染概念包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存生存有害的成份和造成細(xì)胞不純的異物（真菌、細(xì)菌、病毒和支原體）、化學(xué)物質(zhì)及細(xì)胞,45,微生物污染的途徑,空氣：一般培養(yǎng)室環(huán)境中每立方米含菌數(shù)不應(yīng)超過(guò)1 ~ 5個(gè) 器材：CO2溫箱 操作 血清 組織樣本,46,微生物污染的檢測(cè),真菌污染 細(xì)菌污染 支原體污染：可做如下檢測(cè) （1）相差顯微鏡檢測(cè) （2）熒光染色法 （3）電鏡檢查 （4）DNA分子雜交或支原體培養(yǎng)等方法,47,微生物污染的防治,防止的關(guān)鍵在于嚴(yán)格無(wú)菌操作，把好每一個(gè)關(guān)口，盡可能禁止其它污染的物品進(jìn)入培養(yǎng)操作環(huán)節(jié)：,48,微生物污染的防治,抗生素：一般用常用量的5 ~10倍作沖擊療法。用藥24 ~ 48h后，再換常規(guī)培養(yǎng)液。 加溫處理：根據(jù)支原體對(duì)熱敏感的特點(diǎn)，將受支原體污染的細(xì)胞放置在41 °C作用5 ~ 10h，最長(zhǎng)不超過(guò)18h，以殺滅支原體。 動(dòng)物體內(nèi)接種：將支原體污染的細(xì)胞接種在同種動(dòng)物的皮下或腹腔，借動(dòng)物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)消滅支原體。待一定時(shí)間后取出細(xì)胞，做原代培養(yǎng)再進(jìn)行繁殖。,49,細(xì)胞交叉污染,有效防止細(xì)胞交叉污染： 所有器具要嚴(yán)格區(qū)分 不要觸及培養(yǎng)液瓶瓶口 細(xì)胞系都要在早期留有充足的凍存儲(chǔ)備，可以復(fù)蘇早期凍存細(xì)胞使用。,50,流式細(xì)胞儀分離法,流式細(xì)胞儀可根據(jù)細(xì)胞核酸含量、某些物質(zhì)含量或細(xì)胞結(jié)構(gòu)大小等參數(shù)來(lái)將細(xì)胞分離成不同的群體。,51,培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察,貼附生長(zhǎng)型 為能附著于底物表面生長(zhǎng)的細(xì)胞， 懸浮生長(zhǎng)型 懸浮狀態(tài)即可生長(zhǎng)，如血、骨髓 脾細(xì)胞。,52,培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性,貼附：附著于底物如其它細(xì)胞、膠元、玻璃或塑料，促細(xì)胞附著物質(zhì)如基膜素、纖維連接素、膠元、血清擴(kuò)展因子可能參加細(xì)胞的粘附過(guò)程。 接觸抑制：當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞相互接觸時(shí)，細(xì)胞不再移動(dòng)，細(xì)胞膜皺褶樣活動(dòng)停止。 密度依賴性：細(xì)胞稀少時(shí)生長(zhǎng)迅速，融合成片后，分裂停止。,53,常規(guī)觀察,需每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的變化： 1. 培養(yǎng)液的顏色與透明度 2 .細(xì)胞形態(tài)變化 3.細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài) 4. 微生物污染,54,細(xì)胞形態(tài)變化的觀察,相差顯微鏡：利用光通過(guò)不同物質(zhì)時(shí) 的折射和物體厚度差別，產(chǎn)生衍射而引起光程改變，產(chǎn)生相位差的特性，用于觀察培養(yǎng)細(xì)胞的附著、貼壁、伸展、移動(dòng)、有絲分裂等形態(tài)活動(dòng)。 狀態(tài)好的細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓清楚，分裂期細(xì)胞多見(jiàn)。 狀態(tài)差的細(xì)胞，失去原來(lái)的特點(diǎn)，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡、顆粒，細(xì)胞變形，出現(xiàn)死亡。,55,細(xì)胞計(jì)數(shù),它是 了解細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的量化指標(biāo)。 制備細(xì)胞懸液，密度不低于10000細(xì)胞/ ml，用10x物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角大方格的細(xì)胞數(shù) 計(jì)數(shù)：細(xì)胞數(shù)/ml原液＝（4大格細(xì)胞數(shù)之合/4）X 10000 注意：細(xì)胞分散均勻制成單個(gè)細(xì)胞懸液。,56,活細(xì)胞的染料排除檢測(cè)法,細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，某些染料可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色，而活細(xì)胞能排出進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的染料，或阻止這類染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因而不易著色。借此可以鑒別死活細(xì)胞。,57,細(xì)胞活力測(cè)定的MTT比色法,原理：活細(xì)胞的線粒體脫氫酶能將染料MTT（二甲基噻唑二笨基四唑溴鹽）轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙滋骖w粒，后者被酸性異丙醇溶解后所呈現(xiàn)的色度（用OD值表示）反映出生活細(xì)胞的代謝水平。死亡細(xì)胞則無(wú)此酶活性。,58,,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的商業(yè)化：對(duì)于生物技術(shù)所使用的各種細(xì)胞株的價(jià)值，很難作出評(píng)價(jià)。1998年，美國(guó)市場(chǎng)就達(dá)3.5-4億美元，而且還以6-8%的速度在增長(zhǎng)。下邊介紹幾家美國(guó)細(xì)胞株供應(yīng)公司和機(jī)構(gòu)。,59,美國(guó)細(xì)胞株供應(yīng)公司和機(jī)構(gòu),名 稱 網(wǎng) 址 Invitrogan www.I 有關(guān)不同細(xì)胞株的用戶論壇 ATCC www.atcc.org 各種細(xì)胞株的主要供應(yīng)者 www.nci.nih.gov 提供有關(guān)細(xì)胞株的篩選 Cellsalive 生產(chǎn)各種細(xì)胞感染、 凋亡其它細(xì)胞過(guò)程的錄象和圖片 Gentest 藥物代謝試驗(yàn)用的酶和肝細(xì)胞主要供應(yīng)者 Expession Systems 桿病毒細(xì)胞株的主要供應(yīng)者 Life Tech 供應(yīng)基礎(chǔ)研究用的特異化細(xì)胞株,60,方法與結(jié)果,96孔板培養(yǎng)細(xì)胞， 加入20ul MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸去上清液， 加入100ul二甲基亞楓 酶標(biāo)儀測(cè)定光吸收，波長(zhǎng)490nm.,61,細(xì)胞分裂指數(shù),計(jì)算分裂細(xì)胞占全部細(xì)胞中比例的方法， 以表示細(xì)胞的增值程度。一般要計(jì)算和觀察1000個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞分裂相數(shù)。 方法：細(xì)胞接種于放置小玻片的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每24h取出一個(gè)小玻片，95％酒精固定，吉姆薩染色。計(jì)算出1000個(gè)細(xì)胞中分裂相平均數(shù)值和所占百分比。按所測(cè)的百分?jǐn)?shù)逐日順序繪制成圖。,62,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行 同一種密度準(zhǔn)確接種細(xì)胞，以7－10天能長(zhǎng)滿而不發(fā)生生長(zhǎng)抑制為度 每天取三瓶細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)1－2周， 以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸（對(duì)數(shù)）， 生長(zhǎng)曲線上細(xì)胞數(shù)量增加1倍時(shí)間為細(xì)胞倍增時(shí)間,63,