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______________________________________________________________________________________________________________ 微 生 物 實(shí) 驗(yàn) 教 案 實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡油鏡的使用和細(xì)菌形態(tài)的觀察 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 以染色玻片為例，熟練掌握顯微鏡油鏡的使用方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 1 顯微鏡油鏡使用的原理 1普通光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造 （1）光學(xué)部分: 接目鏡、接物鏡、照明裝置(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)。它使檢視物放大, 造成物象。 （2）機(jī)械部分: 鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、載物臺轉(zhuǎn)移器、粗調(diào)節(jié)器、細(xì)調(diào)節(jié)器等部件。它起著支持、調(diào)節(jié)、固定等作用。 2顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率 （1）放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù) （2）顯微鏡的分辨率：表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點(diǎn)之間距離的能力，可用公式表示為： D=λ/2n·sin(α/2 ) 式中D：物鏡分辨出物體兩點(diǎn)間的最短距離。 λ：可見光的波長（平均0.55μm） n: 物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。 a：鏡口角（即入射角）。 3油鏡使用的原理 油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時(shí)，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更加清晰。 三、實(shí)驗(yàn)材料 1顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、火柴、玻璃鉛筆、蒸餾水等。 2枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的玻片染色標(biāo)本。 四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 （1）用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。 （2）調(diào)節(jié)光亮度。 （3）低倍鏡觀察：先粗調(diào)再微調(diào)至物象清晰。 （4）轉(zhuǎn)入中倍、高倍觀察，每一不只需調(diào)微調(diào)旋紐即可看到清晰的物象。 （5）油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，在標(biāo)本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物象為止。 （6）繪出所觀察到的細(xì)菌形態(tài)圖像。 （7）、換片：另換新片觀察，必須從（3）步開始操作。 （8）、用后復(fù)原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去油鏡頭上的香柏油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 油鏡使用的原理 繪制細(xì)菌形態(tài) 六、思考題 1油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應(yīng)特別注意些什么？ 2使用油鏡時(shí)，為什么必須用鏡頭油？ 七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 1不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。 2鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度。 3觀察標(biāo)本時(shí)，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時(shí)，特別在使用油鏡時(shí)，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。 4觀察時(shí)，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時(shí)，右眼注視繪圖。 5拿顯微鏡時(shí)，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。 6顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。 八、教學(xué)反饋 實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的簡單染色 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 熟練掌握顯微鏡油鏡的使用方法。學(xué)習(xí)染色的基本技術(shù)， 二、實(shí)驗(yàn)原理 簡單染色的原理 大多數(shù)微生物細(xì)胞質(zhì)是帶負(fù)電荷，簡單染色時(shí)采用已知的、帶正電荷的堿性染料。染料適用于熱固定的涂片，染料與菌體細(xì)胞質(zhì)黏附使菌體著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明對比。 三、實(shí)驗(yàn)材料 1顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、火柴、玻璃鉛筆、蒸餾水等。 2、培養(yǎng)12-18h的枯草芽孢桿菌和大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌。 3、簡單染色液（美藍(lán)染色液、黑色素液或炭素墨水） 四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 1、活菌制片觀察 取一張干凈的載玻片，在其中央滴上一滴干凈的蒸餾水，取培養(yǎng)12-18h的枯草芽孢桿菌一小環(huán)，在水滴上反復(fù)涂抹至菌體充分分散，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余的水分，按照油鏡的使用步驟，觀察草芽孢桿菌形態(tài)，邊觀察邊繪圖。 2、簡單染色 (1) 涂片:取兩塊干凈的載玻片，各滴一小滴生理鹽水于載玻片中央，用無菌操作分別挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌于二載玻片的水滴中（每一種菌制一片），調(diào)勻并涂成薄膜。注意滴生理鹽水時(shí)不宜過多，涂片必須均勻。 (2) 干燥：自然氣干或酒精燈高處微微加熱。 (3) 固定:于火焰上通過2—3次。 (4) 染色：在整個(gè)涂面上滴加齊氏石炭酸復(fù)紅，染色１分鐘。 （5）水洗：傾去染液，用自來水細(xì)流沖洗至流下的水中無染料顏色為止。 （6）干燥：空氣中自然干燥或在酒精燈高處微微加熱。 （7）鏡檢：在油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 油鏡使用的原理 繪制細(xì)菌形態(tài) 六、思考題 1鏡檢標(biāo)本時(shí)，為什么先用低倍鏡觀察，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？ 2根據(jù)實(shí)驗(yàn)體會，你認(rèn)為制備染色標(biāo)本時(shí)，應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？ 七、教學(xué)反饋 實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌的革蘭氏染色 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1掌握革蘭氏染色。 2了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。 二、實(shí)驗(yàn)原理 1 革蘭氏染色的原理 革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁主要有肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，在染色過程中，當(dāng)用95%乙醇處理時(shí)，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，細(xì)胞壁的通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞壁內(nèi)而不易脫色，因此呈藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物容易被乙醇抽提出來而脫色，然后又被染上了復(fù)染劑的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。 三、實(shí)驗(yàn)材料 1大腸桿菌24h的斜面培養(yǎng)物。 2葡萄球菌24h的斜面培養(yǎng)物。 4革蘭氏染色液（結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸復(fù)紅） 5載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、火柴、玻璃鉛筆、蒸餾水等。 6顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等。 四、實(shí)驗(yàn)方法和步驟 附表1細(xì)菌染色法分類 附表2 微生物染色常用染料 A酸性染料：如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑等。 B堿性染料：一般有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶紫、美蘭、甲基紫等，細(xì)菌易被堿性染料染色。 C中性（復(fù)合）染料：如伊紅、美蘭等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于細(xì)胞核染色）。 D單純?nèi)旧哼@類染料物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類（Sudan b）的染料 2革蘭氏染色 （1）涂片。 （2）初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。 （3）媒染：先用新配的盧哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。 （4）脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約30秒，后立即用流水沖洗。 （5）復(fù)染：滴加番紅染色液，染1分鐘，水洗后用吸水紙吸干。 （6）鏡檢：觀察染色結(jié)果。 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 1 革蘭氏染色的基本原理和意義 2 革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵 六、思考題 1根據(jù)實(shí)驗(yàn)體會，你認(rèn)為制備染色標(biāo)本時(shí)，應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？ 2制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀察？ 3做革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？ 4當(dāng)你對一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠? 七、教學(xué)反饋 實(shí)驗(yàn)四 培養(yǎng)基的配制 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1學(xué)習(xí)和掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟 2學(xué)會實(shí)驗(yàn)室滅菌鍋的使用方法 二、實(shí)驗(yàn)材料 1牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4.·7H2O。 2試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號筆、線繩、紗布。 3 滅菌鍋 三、實(shí)驗(yàn)方法 (一)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。其配方如下： 牛肉膏3g，蛋白胨10g．NaCl5g，瓊脂15-20g，水1000mL，pH7.4-7.6。 1稱藥品：按實(shí)際用量計(jì)算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量，隨后放人熱水中，牛肉膏便與稱量紙分離，立即取出紙片。蛋白胨極易吸潮，故稱量時(shí)要迅速。 2加熱溶解：在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補(bǔ)足所失的水分。 3調(diào)pH：檢測培養(yǎng)基的pH，若pH偏酸，可滴加1滴1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙檢測，直至達(dá)到所需pH范圍。若偏堿，則用1mol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂前。應(yīng)注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。 4過濾：液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的觀察。 5分裝：按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時(shí)可用三角漏斗以免培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上面造成污染。 分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1／5，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶內(nèi)以不超過其容積一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/4為宜，滅菌后垂直待凝。 6加棉塞：試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通汽的作用。要使棉塞總長約3／5塞人試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時(shí)也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。 7包扎：加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報(bào)紙，以防滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)先把試管扎成捆后，再于棉塞外包一層牛皮紙。然后用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。 8滅菌：將上述培養(yǎng)基于121.3℃濕熱滅菌20min。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放人冰箱內(nèi)暫存。 9擺斜面：滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，并調(diào)整斜度，使斜度的長度不超過試管總長度的1/2。 10無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)24-48h，無菌生長即可使用。或儲存于冰箱清潔的櫥內(nèi)，備用。 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和報(bào)告 記錄本實(shí)驗(yàn)配制培養(yǎng)第的名稱、數(shù)量，并圖解說明其配制過程，指明要點(diǎn)。 五、問題和思考 1配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟?在操作過程中應(yīng)注意些什么問題?為什么? 2培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理？如何進(jìn)行無菌檢查， 3試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對飲料進(jìn)行無菌檢查。 六、演示 1培養(yǎng)基的分裝方法。 2試管斜面的擱置方法 七、注意事項(xiàng) 稱藥品用的牛角匙不要混用，稱完藥品應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋。調(diào)PH時(shí)要小心操作，避免回調(diào)。不同培養(yǎng)基各有配制特點(diǎn)，要注意具體操作。 八、教學(xué)反饋 實(shí)驗(yàn)五 土壤的稀釋、分離、純化及無菌操作技術(shù) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容 1學(xué)習(xí)從上壤中分離微生物的方法，學(xué)習(xí)無菌操作技術(shù)。 2用稀釋法分離細(xì)菌、放線茵和霉菌。 3用平板劃線法分離微生物。 4學(xué)習(xí)平板接種等無菌操作技術(shù)。 二、實(shí)驗(yàn)材料 1金黃色葡萄球菌和普通變形菌斜面菌種。 2已滅菌的牛肉膏、高氏1號、土豆蔗糖固體培養(yǎng)基各1瓶。 3無菌培養(yǎng)皿12套、無菌EP管10支、土壤樣品、天平、稱量紙、藥匙、試管架、記號筆、涂布器、1000ul移液器、200ul移液器、20ul移液器、1000ul槍頭、200ul槍頭、20ul槍頭。 4無菌水(49.5mL、帶玻璃珠) 1瓶、80％乳酸、10％酚液、95％乙醇。 三、實(shí)驗(yàn)方法 (一)土壤稀釋分離 1取土壤：取表層以下5-10ml處的土樣．放入滅菌的袋中備用，或放在4℃冰箱中暫存。 2制備稀釋液 (1)制備土壤懸液：稱土樣0.5g，迅速倒人帶玻璃珠的無菌水瓶中，振蕩5-10min,使土壤充分打散，即成為10-2的土壤懸液。 (2)梯度稀釋：用移液器吸10-2的土壤懸液100ul，放入裝有900ul無菌水的EP管中，上下顛倒數(shù)次，即為10-3的稀釋液，如此重復(fù)，可依次制成10-3-10-8的稀釋液。 注意：每一個(gè)稀釋度換用一支槍頭。 (二)平板劃線分離微生物 1倒平板：按無菌操作要求，在火焰旁操作，取融化并冷卻至不燙手的固體培養(yǎng)基(約50℃)，倒入無菌培養(yǎng)皿中，倒量以鋪滿皿底為限，平放桌上待其充分凝固，備用。 2劃線分離：使用接種環(huán)，從待純化的菌落或待分離的斜面菌種中沾取少量菌樣，在相應(yīng)培養(yǎng)基平板中劃線分離，劃線的方法多樣，目的是獲得單個(gè)菌落。 3培養(yǎng)：方法同“土壤稀釋分離” (三) 平板接種培養(yǎng) 1混合平板培養(yǎng)法 將無菌平板編上10-7、10-8、10-9號碼，每一號碼設(shè)置三個(gè)重復(fù)，用無菌吸管按無菌操作要求吸取10-9稀釋液各1ml放入編號10-9的3個(gè)平板中，同法吸取10-8稀釋液各lml放入編號10-8的3個(gè)平板中，再吸取10-7稀釋液各lml放入編號10-7的3個(gè)平板中（由低濃度向高濃度時(shí)，吸管可不必更換）。然后在9個(gè)平板中分別倒入已融化并冷卻至45—50℃的細(xì)菌培養(yǎng)基(圖22-2)，輕輕轉(zhuǎn)動平板，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，冷疑后倒置，適溫培養(yǎng)。至長出菌落后即可計(jì)數(shù)。 2涂抹平板計(jì)數(shù)法 涂抹平板計(jì)數(shù)法與混合法基本相同，所不同的是先將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無菌平板中，待凝固后編號，然后用無菌吸管吸取0.1ml菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上（每個(gè)編號設(shè)三個(gè)重復(fù)）。再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻（圖22-3），每個(gè)稀釋度用一個(gè)滅菌刮鏟，更換稀釋度時(shí)需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時(shí)，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒轉(zhuǎn)，保溫培養(yǎng)，至長出菌落后即可計(jì)數(shù)。 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和報(bào)告 1記錄土壤稀釋分離結(jié)果，并計(jì)算出每克土壤中的細(xì)菌、放線曲和霉菌的數(shù)量。 計(jì)算方法：選擇長出菌落數(shù)30-300之間的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，技以下公式： 總個(gè)數(shù)／g＝同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)x稀釋倍數(shù) 2分別記錄平板劃線、平板接種的結(jié)果，并自我評價(jià)。 五、問題和思考 1在測定土壤微生物含量中，除混菌法外還可用什么方法? 2試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，從土壤中分離出酵母菌，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。 3試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，從水或者空氣中分離微生物，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。 六、注意事項(xiàng) 1一般土壤中，細(xì)菌最多，放線菌及霉菌次之，而酵母菌主要見于果園及菜園土壤中，故從土壤中分離細(xì)菌時(shí)，要取較高的稀釋度，否則菌落連成一片不能計(jì)數(shù)。 2在土壤稀釋分離操作中，每稀釋10倍，最好更換一次移液管，使計(jì)數(shù)準(zhǔn)確。 3放線菌的培養(yǎng)時(shí)間較長，故制平板的培養(yǎng)基用量可適當(dāng)增多。 六、教學(xué)反饋 實(shí)驗(yàn)六 水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的檢測 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ??? (1)了解和學(xué)習(xí)水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的測定原理和測定意義。 ??? (2)學(xué)習(xí)和掌握用稀釋平板計(jì)數(shù)法測定水中細(xì)菌總數(shù)的方法。 ??? (3)學(xué)習(xí)和掌握水中大腸菌群的檢測方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 ??? 水是微生物廣泛分布的天然環(huán)境。各種天然水中常含有一定數(shù)量的微生物。水中微生物的主要來源有：水中的水生性微生物(如光合藻類)、來自土壤徑流、降雨的外來菌群和來自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要來源于人和動物的傳染性排泄物。 ??? 水的微生物學(xué)的檢驗(yàn)，特別是腸道細(xì)菌的檢驗(yàn)，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時(shí)也是評價(jià)水質(zhì)狀況的重要指標(biāo)。國家飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，飲用水中大腸菌群數(shù)每升中不超過3個(gè)，細(xì)菌總數(shù)每mL不超過100個(gè)。 ??? 所謂細(xì)菌總數(shù)是指1mL或1g檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)，所用的方法是稀釋平板計(jì)數(shù)法，由于計(jì)算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)數(shù)，故其單位應(yīng)是cfu/g(mL)。它反映的是檢樣中活菌的數(shù)量。 ??? 所謂大腸菌群，是指在37℃24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌的總稱，主要由腸桿菌科中四個(gè)屬內(nèi)的細(xì)菌組成，即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。 ??? 水的大腸菌群數(shù)是指100mL水檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實(shí)際數(shù)值，以大腸菌群最近似數(shù)(MPN)表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽胞桿菌等多種細(xì)菌。這些細(xì)菌都可隨人畜排泄物進(jìn)入水源，由于大腸菌群在腸道內(nèi)數(shù)量最多，所以，水源中大腸菌群的數(shù)量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項(xiàng)重要指標(biāo)。目前，國際上已公認(rèn)大腸菌群的存在是糞便污染的指標(biāo)。因而對飲用水必須進(jìn)行大腸菌群的檢查。 ???水中大腸菌群的檢驗(yàn)方法，常用多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法可運(yùn)用于各種水樣的檢驗(yàn)，但操作繁瑣，需要時(shí)間長。濾膜法僅適用于自來水和深井水，操作簡單、快速，但不適用于雜質(zhì)較多、易于阻塞濾孔的水樣。 多管發(fā)酵法包括初(步)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、平板分離和復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)三個(gè)部分。 1、初(步)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)： 發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置一德漢氏小套管，乳糖能起選擇作用，因?yàn)楹芏嗉?xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣，為便于觀察細(xì)菌的產(chǎn)酸情況，培養(yǎng)基內(nèi)加有溴甲酚紫作為pH指示劑，細(xì)菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)基即由原來的紫色變?yōu)辄S色，溴甲酚紫還有抑制其他細(xì)菌如芽孢細(xì)菌生長的作用。 水樣接種于發(fā)酵管內(nèi)，37℃下培養(yǎng)，24小時(shí)內(nèi)小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏色改變，說明水中存在大腸菌群為陽性結(jié)果，但也有個(gè)別其他類型的細(xì)菌在此條件下也可能產(chǎn)氣；此外產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的也不能完全說明是陰性結(jié)果，在少量的情況下，也可能延遲到48小時(shí)后才產(chǎn)氣，此時(shí)應(yīng)視為可疑結(jié)果，因此，以上兩種結(jié)果均需繼續(xù)做下面兩部分實(shí)驗(yàn)，才能確定是否是大腸菌群。48小時(shí)后仍產(chǎn)氣的陰性結(jié)果。 2、平板分離： 平板培養(yǎng)基一般使用復(fù)紅亞硫酸鈉瓊脂（遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基，Endo’s medium）或尹紅美藍(lán)瓊脂(eos in methylene blue agar,EMB agar),前者含有堿性復(fù)紅染料，在此作為指示劑，它可被培養(yǎng)基中亞硫酸鈉脫色，使培養(yǎng)基呈淡粉紅色，大腸菌群發(fā)酵乳糖后產(chǎn)生的酸和乙醛即和復(fù)紅反應(yīng)，形成深紅色復(fù)合物，使大腸菌群菌落變?yōu)閹Ы饘俟鉂傻纳罴t色。亞硫酸鈉還可抑制其他雜菌的生長，尹紅美藍(lán)瓊脂平板含有與美藍(lán)染料，在此亦作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時(shí)，該兩種染料即結(jié)合成復(fù)合物，使大腸菌群產(chǎn)生與遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基上相似的、帶核心的、有金屬光澤的深紫色(龍膽紫的紫色)菌落。初發(fā)酵管24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣和48小時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的均需在以上平板上劃線分離菌落。 3、復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)： 以上大腸菌群陽性菌落，經(jīng)涂片染色為革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌者，通過此實(shí)驗(yàn)再進(jìn)一步證實(shí)。原理與初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)相同，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)產(chǎn)酸又產(chǎn)氣的，最后確定為大腸菌群陽性結(jié)果。 三、實(shí)驗(yàn)器材 1菌落總數(shù)的測定： 1)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，無菌生理鹽水。 2)器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管等。 2大腸菌群的測定； （1）、培養(yǎng)基：乳糖蛋白胨發(fā)酵管(內(nèi)有倒置小套管)，三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管(瓶)( 內(nèi)有倒置小套管)，尹紅美藍(lán)瓊脂平板； 2）、材料：無菌水、載玻片、滅菌帶玻璃塞空瓶、無菌吸管、無菌試管等。 四、實(shí)驗(yàn)方法 ?(1)水樣的采集： ???1)自來水：先將自來水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌，再開放水龍頭使水流5min，以滅菌三角瓶接取水樣以備分析。 ??? 2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸邊5m處，取距水面10-15cm的深層水樣，先將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。如果不能在2h內(nèi)檢測的，需放入冰箱中保存。 ??? (2)細(xì)菌總數(shù)的測定： ??? 1)水樣稀釋及培養(yǎng)： ??? ①按無菌操作法，將水樣作10倍系列稀釋： ??? ⑦根據(jù)對水樣污染情況的估計(jì)，選擇2-3個(gè)適宜稀釋度(飲用水如自來水、深井水等，一般選擇1、1:10兩種濃度；水源水如河水等，比較清潔的可選擇1:10、1:100、1:1000三種稀釋度；污染水—被選擇1:100、1:1000、1:10000三種稀釋度)，吸取1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作3個(gè)重復(fù)。 ??? ③將熔化后保溫度45℃的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒平皿，每皿約15mL，并趁熱轉(zhuǎn)動平皿混合均勻。 ??? ④待瓊脂凝固后，將平皿倒置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±1h后取出，計(jì)算平皿內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得1mL水樣中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)。 ??? 2)計(jì)算方法： ??? 作平板計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。 ?3)計(jì)數(shù)的報(bào)告： ?①平板菌落數(shù)的選擇： ??? 選取菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)重復(fù)時(shí)，應(yīng)選取兩個(gè)平板的平均數(shù)。如果一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板計(jì)數(shù)作為該稀釋度的菌數(shù)。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表整個(gè)平板的菌落數(shù)。 ??? ②稀釋度的選擇： a. 應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度，乘以該稀釋倍數(shù)報(bào)告之(表1例1)。 ??? b．若有兩個(gè)稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30-300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；若比值大于2，則報(bào)告其中較小的數(shù)字(l例2、例3)。 c．若所有稀釋度的平均菌落均大于300，則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(l例4)。 d．若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30、則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(1例5)。 e. 若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之（表1例6)。 ??? f. 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以該稀釋倍數(shù)報(bào)告之(表l例7)。 ??? ③細(xì)菌總數(shù)的報(bào)告： ??? 細(xì)菌的菌落數(shù)在l00以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時(shí)，用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)字，以四舍五入方法修約。為了縮短數(shù)字后面的0的個(gè)數(shù)，可用10的指數(shù)來表示，如表1“報(bào)告方式”一欄所示。 (3)大腸菌群的測定(多管發(fā)酵法)： (一)自來水檢查： 1、初(步)發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 在2個(gè)含有50ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵瓶中，各加入100ml水樣；在10支含有5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，各加入10ml水樣(見圖)。搖勻后，37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，24小時(shí)未產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)至48小時(shí)。 2、平板分離 經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后，產(chǎn)酸產(chǎn)氣及48小時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管(瓶)，分別劃線接種于尹紅美藍(lán)瓊脂平板上，再于37℃下培養(yǎng)18-24小時(shí)，將符合下列特征的菌落的一小部分，進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。 ⑴深紫黑色、有金屬光澤。⑵紫黑色、不帶或略帶金屬光澤；⑶淡紫紅色、中心顏色較深。 3、復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 經(jīng)涂片、染色、鏡檢，如為革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部分，重新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的同類型菌落1-3個(gè)，37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，結(jié)果若產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，即證實(shí)有大腸菌群存在。 證實(shí)有大腸菌群存在后，再根據(jù)初發(fā)酵的陽性管(瓶)數(shù)查表，即得大腸菌群數(shù)(見表一)。 表一 接種水樣總量300ml(100ml2份、10ml10份) 100ml水量陽性管數(shù) 10ml水量陽性管數(shù) 0 1 2 每升水樣中 大腸菌群數(shù) 每升水樣中 大腸菌群數(shù) 每升水樣中 大腸菌群數(shù) 0 <3 4 11 1 3 8 18 2 7 13 27 3 11 18 38 4 14 24 52 5 18 30 70 6 22 36 92 7 27 43 120 8 31 51 161 9 36 60 230 10 40 69 >230 （二）、池水、河水或湖水等的檢查： 1、將水樣稀釋成10-1與10-2。 2、分別吸取1ml10-2、10-1的稀釋水樣和1ml原水樣，各注入裝有10ml普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管中。另取10ml和100ml原水樣，分別注入裝有5ml和50ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管(瓶)中。 3、以下步驟同自來水的平板分離和復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。 4、將100、10、1、0.1(10-1)ml水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表見表二：將10、1、0.1(10-1)、0.01(10-2) ml水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表見表三：即得每升水樣中大腸菌群數(shù) 表二 接種水樣總量111.1ml(100、10、1、0.1ml各1份) 接種水樣量(ml) 每升水樣中 大腸菌群數(shù) 100 10 1 0.1 - - - - <9 - - - + 9 - - + - 9 - + - - 9.5 - - + + 18 - + - + 19 - + + - 22 + - - - 23 - + + + 28 + - - + 92 + - + - 94 + - + + 180 + + - - 230 + + - + 960 + + + - 2380 + + + + >2380 表三 接種水樣總量11.11ml(10、10、0.1、0.01ml各1份) 接種水樣量(ml) 每升水樣中 大腸菌群數(shù) 10 1 0.1 0.01 - - - - 90 - - - + 90 - - + - 90 - + - - 95 - - + + 180 - + - + 190 - + + - 220 + - - - 230 - + + + 280 + - - + 920 + - + - 940 + - + + 1800 + + - - 2300 + + - + 9600 + + + - 23800 + + + + 23800 “+”發(fā)酵陽性、“-”發(fā)酵陰性 表 1 稀釋度的選擇及細(xì)菌數(shù)報(bào)告方式 ? 稀釋度及菌落數(shù) 兩稀釋度之比 菌落總數(shù)/（cfu/g或cfu/mL） 報(bào)告方式（菌落總數(shù)）/（cfu/mL或cfu/g） 10-1 10-2 10-3 1 多不可計(jì) 164 20 - 16400 16000或1.6×104 2 多不可計(jì) 295 46 1.6 37750 38000或3.8×104 3 多不可計(jì) 271 60 2.2 27100 27000或2.7×104 4 多不可計(jì) 多不可計(jì) 313 - 313000 310000或3.1×105 5 27 11 5 - 270 270或 6 0 0 0 - ＜10 ＜10 7 多不可計(jì) 305 12 - 30500 31000或3.1×104 1)生活飲用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗(yàn)： ? ??? 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告： 1、結(jié)果： (1)自來水 100ml水樣的陽性管數(shù)是多少？ 10ml水樣的陽性管數(shù)是多少？ 查表一得每升水樣中大腸菌群是多少？ (2)池水、河水或湖水 陽性結(jié)果記“+”；陰性結(jié)果記“-”。 查表二得每升水樣中大腸菌群是多少？ 查表三得每升水樣中大腸菌群是多少？ 2、思考題： p188(1-3) 六、教學(xué)反饋  THANKS !!! 致力為企業(yè)和個(gè)人提供合同協(xié)議，策劃案計(jì)劃書，學(xué)習(xí)課件等等 打造全網(wǎng)一站式需求 歡迎您的下載，資料僅供參考 -可編輯修改-