羊水細(xì)胞等貼壁細(xì)胞培養(yǎng)及其染色體制作.ppt
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羊水細(xì)胞等貼壁細(xì)胞培養(yǎng)及其染色體制作技術(shù)與原理,動物細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)方式大致可分為兩種: 一種是群體培養(yǎng)(mass culture),將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中,讓細(xì)胞貼壁生長,匯合(confluence)后形成均勻的單細(xì)胞層; 另一種是克隆培養(yǎng)(clonal culture),將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,各個細(xì)胞貼壁后,彼此距離較遠(yuǎn),經(jīng)過生長增殖每一個細(xì)胞形成一個細(xì)胞集落,稱為克?。╟lone)。一個細(xì)胞克隆中的所有細(xì)胞均來源于同一個祖先細(xì)胞。 此外,為了制取細(xì)胞產(chǎn)品而設(shè)計了轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)法,使用大容量的圓培養(yǎng)瓶,在培養(yǎng)過程中不斷地轉(zhuǎn)動,使培養(yǎng)的細(xì)胞始終處于懸浮狀態(tài)之中而不貼壁。,群體培養(yǎng)(左)和克隆培養(yǎng)(右),細(xì)胞培養(yǎng)基本條件,1、合適的細(xì)胞培養(yǎng)基 合適的細(xì)胞培養(yǎng)基是體外細(xì)胞生長增殖的最重要的條件之一,培養(yǎng)基不僅提供細(xì)胞營養(yǎng) 和促使細(xì)胞生長增殖的基礎(chǔ)物質(zhì),而且還提供培養(yǎng)細(xì)胞生長和繁殖的生存環(huán)境。,2、優(yōu)質(zhì)血清 目前,大多數(shù)合成培養(yǎng)基都需要添加血清。血清是細(xì)胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一,含有細(xì)胞生長所需的多種生長因子及其它營養(yǎng)成分。,3、無菌無毒細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境 無菌無毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染,或者自身代謝物質(zhì)積累,可導(dǎo)致細(xì)胞中毒死亡。因此,在體外培養(yǎng)細(xì)胞時,必須保持細(xì)胞生存環(huán)境無菌無毒,及時清除細(xì)胞代謝產(chǎn)物。,4、恒定的細(xì)胞生長溫度 維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長,必須有恒定適宜的溫度。 5、合適的氣體環(huán)境 氣體是哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。,正常細(xì)胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限,只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無限生長下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細(xì)胞。目前世界上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細(xì)胞系就是1951年從一位名叫Henrietta Lacks的婦女身上取下的宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)而成。此細(xì)胞系一直延用至今。,原代培養(yǎng) (primary culture):從動物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長比較緩慢,而且繁殖一定的代數(shù)后(一般10代以內(nèi))停止生長,需要從更換培養(yǎng)基。將細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)(Passage)。 細(xì)胞株(cell strain):從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群,能夠繁殖50代左右,在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。,細(xì)胞系(cell line):從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞,在培養(yǎng)條件下可無限繁殖 克?。╟lone):亦稱無性繁殖系或簡稱無性系。對細(xì)胞來說,克隆是指由同一個祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。,培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程,體內(nèi)細(xì)胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中,而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器,生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后,則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液,否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存,這一過程叫傳代(Passage或Subculture)。,每次傳代以后,細(xì)胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。另外,很多細(xì)胞特別是正常細(xì)胞,在體外的生存也不是無限的,存在著一個發(fā)展過程。所有這一切,使組織細(xì)胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點。,所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期,是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體內(nèi)組織細(xì)胞的生存期與完整機(jī)體的死亡衰老基本相一致。 正常細(xì)胞培養(yǎng)時,不論細(xì)胞的種類和供體的年齡如何,在細(xì)胞全生存過程中,大致都經(jīng)歷以下三個階段: 1.原代培養(yǎng)(Primary Culture)期; 2.傳代期; 3.衰退期。,1.原代培養(yǎng)(Primary Culture)期,也稱初代培養(yǎng),即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段,一般持續(xù)1一4周。 此期細(xì)胞呈活躍的移動,可見細(xì)胞分裂,但不旺盛。 初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大,多呈二倍體核型。,2.傳代期,初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系(Cell Line)。 在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下,細(xì)胞增殖旺盛,并能維持二倍體核型。 為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì),細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。如不凍存,則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度,以利于生存。 一般情況下當(dāng)傳代10~50次左右,細(xì)胞增殖逐漸緩慢,以至完全停止,細(xì)胞進(jìn)入第三期,3.衰退期,此期細(xì)胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖;細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng),最后衰退凋亡。 在細(xì)胞生命期階段,少數(shù)情況下,在以上三期任何一點(多發(fā)生在傳代末或衰退期),由于某種因素的影響,細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化(Spontaneous Transformation)。,組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期,所謂細(xì)胞“一代”一詞,系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間,這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法,它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞,即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代(Generation)或倍增(Doubling)不同;在細(xì)胞一代中,細(xì)胞能倍增3~6次。細(xì)胞傳一代后,一般要經(jīng)過以下三個階段:,1.潛伏期,細(xì)胞接種培養(yǎng)后,先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細(xì)胞胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形。 接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上,稱貼壁,懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同,這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。,貼附是貼附類細(xì)胞生長增殖條件之一。 細(xì)胞貼附于支持物后,除先經(jīng)過前述延展過程變成極性細(xì)胞,還要經(jīng)過一個潛伏階段,才進(jìn)入生長和增殖期。細(xì)胞處在潛伏期時,可有運動活動,基本無增殖,少見分裂相。 細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長,約24~96小時或更長,連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短,僅6~24小時;細(xì)胞接種密度大時潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時,標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。,2.指數(shù)增生期,這是細(xì)胞增值最旺盛的階段,細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個重要標(biāo)志。,指數(shù)增生期是細(xì)胞一代中活力最好的時期,因此是進(jìn)行各種實驗最好的和最主要的階段。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下,指數(shù)增生期持續(xù)3~5天,細(xì)胞相互接觸后,如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞,由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運動,這種現(xiàn)象稱接觸抑制(Contact Inhibition)。 腫瘤細(xì)胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動和增殖,導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展,使細(xì)胞發(fā)生堆積(Piled up)。,3.停滯期(Stagnate Phase):,細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后,細(xì)胞遂停止增殖,進(jìn)入停滯期。 此時細(xì)胞數(shù)量不再增加,故也稱平頂期(Plateau)。停滯期細(xì)胞雖不增殖,但仍有代謝活動,繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡,代謝產(chǎn)物積累、pH降低。 此時需做分離培養(yǎng)即傳代,否則細(xì)胞會中毒,發(fā)生形態(tài)改變,重則從底物脫落死亡,故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚(已有中毒跡象)能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。,細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇,選擇培養(yǎng)基沒有一定的標(biāo)準(zhǔn),有幾點建議可供參考: (1 )建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。可以查閱參考文獻(xiàn),或在購買細(xì)胞株時咨詢。 (2) 其它實驗室慣用的培養(yǎng)基不妨一試,許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。,(3) 根據(jù)細(xì)胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選 RPMI1640 。 (4) 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞,觀察其生長狀態(tài),可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷,根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基,這是最客觀的方法,但比較繁瑣。,細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境,1、實驗室設(shè)計 細(xì)胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術(shù),要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細(xì)胞培養(yǎng)室和設(shè)計原則是防止微生物污染和有害因素影響,要求工作環(huán)境清潔、空氣清新,干燥和無煙塵。細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計原則一般是無菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動的內(nèi)側(cè),常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室,而洗刷消毒在另一室。,2、常用設(shè)施及設(shè)備,(1)超凈工作臺:也稱凈化工作臺,分為側(cè)流式、直流式和外流式三大類。,(2)無菌操作間:一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無菌物品等。 操作間:普通培養(yǎng)箱、離心機(jī)、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物 洗刷消毒間:烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。 分析間:顯微鏡、計算機(jī)及打印機(jī)等。,細(xì)胞培養(yǎng)無菌操作基本技術(shù),工作環(huán)境的處理 使用層流超凈工作臺是最經(jīng)濟(jì)有效的手段。超凈工作臺正常工作時,向下的氣流可阻擋外界空氣污染物進(jìn)入超凈臺。,(1)實驗前,無菌室及無菌操作臺用紫外燈照射30-60 分鐘滅菌,用70% 酒精擦拭無菌操作臺面,并開啟無菌操作臺風(fēng)機(jī)運轉(zhuǎn)10 分鐘后,才可開始實驗操作。每次操作只處理一株細(xì)胞,以免造成細(xì)胞交叉污染。實驗結(jié)束后,將實驗物品帶出工作臺。如需要繼續(xù)進(jìn)行下一個實驗,則用70% 酒精擦拭無菌操作臺面,再讓無菌操作臺風(fēng)機(jī)運轉(zhuǎn)10 分鐘后,才可進(jìn)行下一個實驗操作。,(2)無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔與寬敞,必要物品,如試管架、移液器或吸管頭等可以暫時放置,其它實驗用品用完后應(yīng)及時移出,以利氣體流通。實驗用品要用70%酒精擦拭后才能帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在操作臺中央無菌區(qū)域內(nèi)進(jìn)行,勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。,(3)小心取出無菌實驗用品,避免造成污染。切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口,不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后,用手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45°角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺面上。,(4)工作人員應(yīng)注意自身的安全,必須穿戴實驗衣與手套后才進(jìn)行實驗。對于來自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心,并選擇適當(dāng)?shù)燃壍臒o菌操作臺(至少兩級)。操作過程中,應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生,小心有毒性試劑,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖銳物品傷人等。,(5)定期檢查下列項目:CO2 鋼瓶內(nèi)的CO2 壓力;CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)的CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染;無菌操作臺內(nèi)氣流壓力是否正常,定期更換紫外燈管及HEPA 過濾器濾膜,預(yù)濾網(wǎng)﹙300 小時/預(yù)濾網(wǎng),3000 小時/HEPA)。,人羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備,人的羊水細(xì)胞能長成單層并可連續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng),但它們的一些特征與一般成纖維細(xì)胞不同。在羊水中存在著各種不同類型的胎兒細(xì)胞,依據(jù)其外形和生長特征可區(qū)分為以下三類:上皮細(xì)胞(E)、成纖維細(xì)胞(F)和羊水細(xì)胞(AF)。,E細(xì)胞在胰酶消化的連續(xù)培養(yǎng)中不再生長,所以在培養(yǎng)過程中的生長期最短。 AF細(xì)胞在再培養(yǎng)中一開始就長得很好,染色體分析大多用這類細(xì)胞。 F細(xì)胞在再培養(yǎng)中潛在的生長期最長,在較老的羊水培養(yǎng)物中占優(yōu)勢。,通常在培養(yǎng)后3—4天(可能更早些)即出現(xiàn)E細(xì)胞的集落,它們不適合再培養(yǎng)作染色體分析。大約在第7天出現(xiàn)的AF細(xì)胞可被用于染色體制備。如果在培養(yǎng)后第10天還未見長出新的細(xì)胞,就應(yīng)考慮第二次羊膜穿刺。,實驗用品、實驗試劑,見實驗操作手冊,內(nèi)容與方法,(一)細(xì)胞接種與培養(yǎng) 在無菌條件下抽得妊娠18-22周羊水后,注入10ml離心管中,共抽4管約32ml,立即送檢 進(jìn)室后,以1500rpm離心10min 進(jìn)無菌室,在無菌操作臺上吸去上清液,每管約留0.5ml,吸管打散細(xì)胞。制成細(xì)胞懸液,再加入約4.5ml完全培養(yǎng)基入管內(nèi),吸管輕混勻,移至25cm2方形培養(yǎng)瓶中置含5%CO2的37℃溫箱行開放式培養(yǎng),一般5天后鏡下觀察,可見成纖維樣或上皮細(xì)胞生長,當(dāng)細(xì)胞生長旺盛,在貼壁細(xì)胞層的背景上出現(xiàn)圓形細(xì)胞時,視情況(有較好的梭形細(xì)胞克?。┛蓳Q上換液用培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時,如細(xì)胞生長狀況好,即可加入秋水仙素0.04ug-0.08ug/ml, (20ug/ml,7號針頭垂直加2滴)4-6小時左右行細(xì)胞學(xué)處理,(二)細(xì)胞收獲 倒出瓶中細(xì)胞液入10ml離心管,0.85%NaCl沖洗細(xì)胞壁兩遍 0.25% EDTA-trypsin消化3-5分鐘,待細(xì)胞面出現(xiàn)肉眼可見皺形改變時即用吸管吹打細(xì)胞。 收集細(xì)胞懸液:離心,1500rpm,10min,去上清,低滲:加入0.075M KCl 4ml-6ml,吸管吹打,37℃水浴3min-5min(或0.4%檸檬酸鈉1∶1作為低滲液,每管8ml,低滲10min)。 預(yù)固定:加入1.5ml左右,輕混勻37℃水浴5min, 離心,1500rpm,10min。 固定:加入3:1固定劑8ml左右,輕混勻,37℃水浴10min,室溫1500rpm離心10min,去上清,約留0.5ml 重復(fù)固定:同上 離心,1500rpm,10min,去上清 調(diào)懸液:視管底細(xì)胞量加入幾滴新鮮固定劑,并吹打混勻,滴片:每片1-2滴, 滴片4-6張 烤片:75℃烤箱烘烤3小時 第二天行顯帶處理:同外周血,注意事項,羊水標(biāo)本應(yīng)及時送檢,送檢過程中不宜受熱或冰凍,實驗人員收到羊水后應(yīng)先觀察羊水是否清亮,含胎脂的多少及是否為血性羊水;羊水中少量紅細(xì)胞不需處理,如有明顯血性羊水,立即在羊水中加入無菌肝素一滴。,接種所用器皿要進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌處理。 離心時,一定要注意離心機(jī)內(nèi)溫度,必須達(dá)到室溫方可離心。 培養(yǎng)基pH為7.2-7.4也是羊水細(xì)胞開放式培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。 注意接種時培養(yǎng)基不能加得過多,臥倒瓶子時,培養(yǎng)基不能接觸瓶蓋;,羊水培養(yǎng)首先必須有好的培養(yǎng)基 傳統(tǒng)的培養(yǎng)基是在F10中加入一定比例的胎牛血清,由于營養(yǎng)成份較少,羊水細(xì)胞培養(yǎng)所需時間較長,培養(yǎng)成功率低。 國內(nèi)有些學(xué)者通過添加生長因子或用血清代用品來培養(yǎng)羊水,但步驟繁瑣,也容易造成污染。,要根據(jù)細(xì)胞的生長狀況,來決定所要收獲的時間。 抓住細(xì)胞生長旺盛時期相當(dāng)重要,如羊水為血性羊水或胎質(zhì)較多須給予不同的處理。 要收獲較多的分裂相,必須在適當(dāng)?shù)臅r機(jī)收獲。,收獲標(biāo)準(zhǔn):于10倍目鏡和4倍物鏡下觀察: ①以梭長形羊水細(xì)胞(AF細(xì)胞)為主要類型的生長細(xì)胞,形成的細(xì)胞克隆覆蓋1個或1個以上的完整視野。 ②培養(yǎng)瓶中有2~3個以上細(xì)胞克隆,且每個細(xì)胞克隆中存在有20個以上的圓形、雙圓形或葡萄狀透亮細(xì)胞。 ③細(xì)胞克隆中央的細(xì)胞開始老化,克隆周邊細(xì)胞生長旺盛。,收獲細(xì)胞時要掌握好低滲時間及低滲液的量,吹打時力度要均勻,滴片濃度不能太高,以免細(xì)胞不分散。培養(yǎng)收獲時間大多數(shù)為9~10天,最早收獲在第7天,最長14天。顯帶時,胰酶消化時間一般比外周血要稍長,但需根據(jù)其胰酶活性而定。,絨毛細(xì)胞培養(yǎng)與染色體制備,絨毛細(xì)胞由受精卵發(fā)育分化的滋養(yǎng)層細(xì)胞及絨毛間質(zhì)中的胚外中胚層細(xì)胞組成,絨毛細(xì)胞與胎兒組織同源,通過絨毛檢測,可客觀反映胎兒情況。絨毛既可以直接制片進(jìn)行染色體的觀察,也可以經(jīng)培養(yǎng)制備染色體,進(jìn)行產(chǎn)前診斷。,內(nèi)容與方法,挑選孕6-8周孕婦,詢問病史、進(jìn)行婦科檢查,以確定早孕,了解子宮大小,位置、彎曲情況及胚胎著床情況 拭去宮頸粘液,嚴(yán)密消毒宮頸及宮頸管下段,一般可不用宮頸鉗,如子宮過度前屈或后屈,則有助手用宮頸鉗輕拉子宮向下固定,用消毒塑料吸管按子宮的自然彎曲方向,沿著子宮壁輕輕進(jìn)入子宮腔,直至有阻力感為止,一般進(jìn)入子宮頸外口6-10cm(根據(jù)妊娠天數(shù)及宮頸長度而定)切忌反復(fù)進(jìn)退,以防剝離面大,然后用空針抽吸,同時退出塑料管,大多可吸出少許血液,絨毛枝便夾在其中,在無菌條件下,將絨毛組織放入玻璃平皿中,用含400U/ml雙抗的0.85%NaCl反復(fù)沖洗絨毛組織2-3次以去除血液,然后除去并吸凈生理鹽水,(一)消化法 (1)經(jīng)低倍鏡下鑒定為絨毛枝后,在玻璃平皿用眼科手術(shù)剪將絨毛組織剪碎,放入裝有30-50倍組織量的0.25% EDTA-trypin的三角燒瓶中,37℃下,20-30min即可 (2)將三角燒瓶中的組織溶液裝入離心管,離心,1000rpm,10min,(3)去上清,加入20 ml PBS,打勻 (4)離心,1000rpm,10min (5)去上清,加入20 ml PBS,打勻 (6)細(xì)胞計數(shù):106/25cm2接種,(二)貼壁法 經(jīng)低倍鏡下鑒定為絨毛枝后,在玻璃平皿用眼科手術(shù)剪剪成1-2mm3小枝或小塊,移入25cm2培養(yǎng)瓶中,用牙科探針將組織均勻分散于培養(yǎng)瓶的細(xì)胞貼壁面,組織塊的間距約為0.5cm-1cm,于對側(cè)瓶壁加入含50%血清的培養(yǎng)基,pH為7.2-7.4,37℃培養(yǎng)2-3小時待組織貼壁牢固后,即可翻瓶,使組織塊泡在培養(yǎng)液中,(三)收獲細(xì)胞及染色體制片 每天觀察,一般3-7天可見上皮樣或成纖維樣細(xì)胞生長。根據(jù)生長情況每隔5-7天換液一次。一般培養(yǎng)6-20天,待細(xì)胞生長旺盛時,按下列程序處理:,加入秋水仙素0.02-0.04ug/ml讓其過夜,約14小時左右,或秋水仙素0.04-0.08ug/ml,4-6h收獲 將培養(yǎng)液倒入離心管中,加入PBS或生理鹽水2-3毫升,洗凈完全培養(yǎng)基,加0.25% EDTA-trypsin約2ml消化3-5min,完全培養(yǎng)基終止消化。置離心管中離心,1500rpm ,10min,低滲:加入0.075M KCl 4ml-6ml,吸管吹打,37℃水浴3min-5min(或0.4%檸檬酸鈉1∶1作為低滲液,每管8ml,低滲10min) 預(yù)固定:加入1.5ml左右,輕混勻37℃水浴3min,離心,1500rpm,10min 固定:加入3:1固定劑8ml左右,輕混勻,37℃水浴15min,室溫1500rpm離心10min,去上清,約留0.5ml 重復(fù)固定:同上 離心,1500rpm,10min,去上清 視管底細(xì)胞量加入適當(dāng)幾滴新鮮固定劑,滴片:每片1-2滴, 滴片4-6張 烤片:75℃烤箱烘烤3小時 第二天行顯帶處理:同外周血,注意事項,嚴(yán)格無菌操作是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵; 視細(xì)胞分裂旺盛情況加秋水仙素0.2-0.4ug/ml、 4-6小時也可考慮收獲; 在用0.25% EDTA-trypsin消化之前盡量將瓶壁血清洗凈,更有利于快速消化; 低滲之后每一步均應(yīng)輕吹打,用力過大可能損失掉較多細(xì)胞。,Thank you!,- 1.請仔細(xì)閱讀文檔,確保文檔完整性,對于不預(yù)覽、不比對內(nèi)容而直接下載帶來的問題本站不予受理。
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- 羊水 細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng) 及其 染色體 制作
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