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PI染色法測細(xì)胞周期,,一） 細(xì)胞DNA含量檢測,細(xì)胞固定后用PI （Propidium iodide碘化丙啶），染色，因為PI特異性結(jié)合于細(xì)胞DNA，熒光強度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)這個原理，可測出細(xì)胞的DNA含量。用于細(xì)胞周期、細(xì)胞倍體以及凋亡的檢測。,,單參數(shù)直方圖,圖中2N代表G0/G1期細(xì)胞，4N代表G2/M期細(xì)胞，兩者中間代表S期細(xì)胞。這是以2倍體和4倍體細(xì)胞為主的流式DNA圖,DNA細(xì)胞周期分析,細(xì)胞周期,,,,,,,,,,,G2,M,G0,G1,s,200,400,600,800,1000,,,,,,s,DNA分析,DNA含量,細(xì)胞數(shù)量,,2倍體,異倍體,4倍體,腫瘤組織中的各種DNA倍體,含量與凋亡關(guān)系,DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)。 凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標(biāo)本制備中的固定處理時，細(xì)胞膜的完整性被破壞，使細(xì)胞內(nèi)降解的DNA片段從細(xì)胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。,2. 凋亡研究,在G0/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰，即凋亡峰。 檢測調(diào)亡，可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細(xì)胞的損傷機理的研究。,Annexin V Assay,,,,圖 Annexin V/PI雙標(biāo)記分析細(xì)胞凋亡和壞死,,,Date acquired: 14-Jan-03 File: 7Gy 4hr.001 Source: dongbo DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04 Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48,,圖 FCM測試細(xì)胞周 期分布和凋亡,根據(jù)凋亡細(xì)胞的特點來檢測,在形態(tài)上，早期細(xì)胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)顯新月體形、核碎裂；細(xì)胞漿和細(xì)胞器密度增高、細(xì)胞體積變?。患?xì)胞膜皺折卷曲，但早期細(xì)胞膜的完整性未受到破壞 凋亡細(xì)胞的FSC ？SSC ？ 細(xì)胞壞死時，細(xì)胞腫脹，F(xiàn)SC ？，SSC ？,,正常人靜止體細(xì)胞有46條染色體，相當(dāng)于7.10-12 pg DNA/細(xì)胞核，我們稱之為二倍體細(xì)胞，而正常增殖細(xì)胞則存在不同的DNA含量。在細(xì)胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各個時期，DNA含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化：在G1期，細(xì)胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體；,,進入S期后，DNA開始合成，這時細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于G1和G2期之間；當(dāng)DNA復(fù)制結(jié)束成為4倍體時，細(xì)胞進入G2期，G2期細(xì)胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進入M期，因此，單純從DNA含量無法區(qū)分G2期和M期；一旦有絲分裂發(fā)生，細(xì)胞分裂成兩個子細(xì)胞，這兩個子細(xì)胞或者進入下一個細(xì)胞周期，或者進入靜止期(G0期)，而G0期從DNA含量上同樣無法與G1期區(qū)分。因此，整個復(fù)制周期可以描述為G0/G1，S，G2/M期。,,通過核酸染料標(biāo)記DNA，并由流式細(xì)胞儀進行分析，可以得到細(xì)胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1，S及G2/M的百分含量，了解細(xì)胞的增殖能力；結(jié)合DNA指數(shù)分析，還可進行凋亡、異倍體等檢測。,,,,,,,,,,,,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,s,DNA Analysis,DNA content,Count,Normal Cell Cycle,細(xì)胞濃度及質(zhì)量要求,單細(xì)胞和核的上機濃度應(yīng)約106/ml。濃度太低，上機時樣本的流速不得不提高，這樣就會影響檢測的CV。濃度太高，則可能導(dǎo)致染料的相對不足，最終使染色不飽和，同樣影響CV和檢測結(jié)果。 制備完成后的標(biāo)本應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢查其質(zhì)量：細(xì)胞是否聚集或過多的碎片。,,染料的選擇取決于流式激光的配置。488nm的激光下應(yīng)用PI(碘化丙啶)，由于PI也與RNA結(jié)合，所以分析前樣本應(yīng)用Rnase處理.。重要的是染料要足夠，以保證飽和結(jié)合。PI的推薦濃度是至少20ug/106 個細(xì)胞。其最佳濃度為50ug/106 個細(xì)胞。,操作步驟,取一瓶生長期的A549細(xì)胞，倒掉瓶中舊的培養(yǎng)液，加入3mlPBS，細(xì)胞生長面在下輕輕晃動細(xì)胞瓶，然后去掉液體，加入1ml胰蛋白酶消化1~5分鐘（以鏡下觀察決定） 加入5mlPBS輕輕吹打細(xì)胞生長面，制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液移至15ml離心管中1500rpm離心5min，去上清。 加入500ulPBS輕輕吹打細(xì)胞團成細(xì)胞懸液，在旋渦狀態(tài)下逐滴加入2ml-20℃95%冷乙醇，混勻后固定30min。,,加入5mlPBS，1500rpm離心5min，去上清液。 加入5mlPBS重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min，去上清液。 加入800ulPI染液，用槍輕輕吹打細(xì)胞團，混勻，室溫避光染色30min 上機檢測。,影響熒光染色的因素,溫度：溫度高于20℃時，即出現(xiàn)溫度淬滅。 2、PH：PI在7.2~7.6，保持熒光染料分子與溶劑間的電離平衡。 3、熒光染料濃度：染料太少，結(jié)合不完全。染料過多，又會出現(xiàn)濃度淬滅現(xiàn)象。 4、固定劑：醛類固定劑會干擾插入性染料與核酸分子的結(jié)合，造成熒光發(fā)射強度減弱。,