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2019-2020年高中生物第一部分微生物的利用1.1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離2素材浙科版 一、培養(yǎng)基的配置： 我們用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基來培養(yǎng)大腸桿菌。 配置1000ml的培養(yǎng)基（可由教師在實驗前配置好，也可由學(xué)生分小組后在實驗課上操作）。 1、配方： 牛肉膏 5g 蛋白胨 10g Nacl 5g 瓊脂 20g 2、稱量：準(zhǔn)確稱取各成分。 3、溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到1000mL。整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。 4、調(diào)pH：用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0——7.2。 5、滅菌：將配置好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加上棉塞，包上牛皮紙，用皮筋勒緊，集中放入高壓滅菌鍋內(nèi)，121攝氏度、100千帕壓力下滅菌15min。5——8套培養(yǎng)皿用舊報紙包作一包，于干熱滅菌鍋內(nèi)160——170℃條件下滅菌2小時。 6、倒平板：滅菌后，待固體培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時在酒精燈火焰附近操作進行。 其過程是：①將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，右手拿裝有培養(yǎng)基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過火焰；③用左手將培養(yǎng)皿打開一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋；④待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。 倒過來放置的目的是防止培養(yǎng)基冷卻過程中形成的水滴落到培養(yǎng)基表面。向培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移已滅菌的培養(yǎng)基時，也不要把培養(yǎng)基沾在皿壁上。否則，空氣中雜菌會在這些粘附培養(yǎng)基上繁殖，并污染皿內(nèi)培養(yǎng)基。 二、大腸桿菌的接種、培養(yǎng)： 1、接種常用的方法有平板劃線法和稀釋涂布平板法。 （1）平板劃線法： ①操作步驟：將培養(yǎng)皿底部用拇指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線 3～5條，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時，接種針應(yīng)與平板表面成30角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。 ②該方法原理及其注意事項： 用接種環(huán)蘸菌液后在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線過程中菌液逐漸減少，細(xì)菌也逐漸減少。劃線到最后，可使細(xì)菌間的距離加大。在培養(yǎng)10～20h后，可由一個細(xì)菌產(chǎn)生單菌落，菌落不會重疊。如果再將每個菌落分別接種至含有固體培養(yǎng)基的試管斜面上，在斜面上劃線，則每個斜面的菌群就是由一個細(xì)菌產(chǎn)生的后代。 取菌種前灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環(huán)冷卻后進行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環(huán)的目的是防止細(xì)菌污染環(huán)境和操作者。 （2）稀釋涂布平板法： 先將培養(yǎng)的菌液稀釋，通常稀釋到10－5 ～10－7之間，然后取0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進行培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)南♂尪认?，可產(chǎn)生相互分開的菌落。通常每個培養(yǎng)皿有20個以內(nèi)的單菌落最為適合。將每個菌落分別接種在斜面上擴增培養(yǎng)后，再做功能性實驗。 2、培養(yǎng)： 將接種后和未接種的培養(yǎng)基都放入37℃恒溫箱中，培養(yǎng)12小時和24小時后，分別觀察記錄結(jié)果。 三、實驗評價相關(guān)問題： 1、未接種的培養(yǎng)基是否有菌落？如果有，為什么？ 2、接種了大腸桿菌的培養(yǎng)基上是否有菌落？其顏色、形狀、大小是否相同？ 3、如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了不同的菌落，請分析可能的原因。 四、實驗注意事項： ① 實驗中用的棉花不能用脫脂棉，因脫脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。滅菌后，通常在60～80℃烘箱中除去滅菌時的水分； ② 物品裝入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后，要首先打開排氣閥，煮沸并排除鍋內(nèi)冷空氣，其目的是有利于鍋內(nèi)溫度升高，隨后關(guān)閉排氣閥繼續(xù)加熱，加熱結(jié)束切斷熱源后，要使溫度自然降低，氣壓務(wù)必降至零時打開鍋蓋，其目的是防止容器中的液體暴沸； ③ 在用任何器皿轉(zhuǎn)接時，瓶塞和封口膜只能夾在手上，不許放在臺面上，接種時要在酒精燈火焰旁操作； ④ 培養(yǎng)基一定不能沾在三角瓶口、試管管口和培養(yǎng)皿壁上，否則容易污染； ⑤ 接種時要膽大心細(xì)，動作快捷，這是減少污染的關(guān)鍵； ⑥ 接種后，培養(yǎng)皿必須倒放（蓋在下方）在恒溫培養(yǎng)箱中，如正放則水蒸氣在蓋上凝成水滴，滴到接種后的培養(yǎng)基表面，水流擴散會使菌落擴散，就很難形成單菌落