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2019-2020年高三生物總復(fù)習(xí) 第45講 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)教案 【考綱要求】 生物技術(shù)在其它方面的應(yīng)用 考綱要求 具體內(nèi)容 (3)PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用 (4)蛋白質(zhì)的提取和分離 Ⅱ Ⅱ 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 (3)血紅蛋白的提取和分離操作 實(shí)驗(yàn)與探究能力 【考點(diǎn)分析】 考點(diǎn) 試卷類型 題型 PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用 xx江蘇生物 非選擇題 xx江蘇生物 選擇題 【考點(diǎn)預(yù)測】 從近幾年高考試題看，有關(guān)植物的組織培養(yǎng)內(nèi)容是命題的重點(diǎn)。預(yù)測今年高考命題可能會從下面兩個方面展開： 1．植物組織培養(yǎng)和花藥離體培養(yǎng)的原理、方法、操作步驟、注意事項(xiàng)等 2．PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用 3．蛋白質(zhì)的提取和分離原理、過程及其注意事項(xiàng) 從近幾年新課標(biāo)改革地區(qū)生物試題看，主要考查植物組織堵喬的原埋、近程及影響因素，以非選擇題為主。由于近兩年考查面的增加，賦分也有所增加的趨勢。以07年到08年逐漸增多。命題角度的最大變化應(yīng)該是以過程圖和表格形式等多種表達(dá)形式考查學(xué)生對知識的掌握程度和識圖能力?？傮w上來說本單元的考查難度較低，且作為選做題出現(xiàn)為主。在復(fù)習(xí)的過程中，要多加強(qiáng)識記，同時注意實(shí)驗(yàn)探究能力的培養(yǎng)。 【知識梳理】 一、 DNA的粗體取與鑒定 1、 提取DNA的方法 2、 DNA的鑒定 3、 設(shè)計實(shí)驗(yàn)過程 二、DNA體外擴(kuò)增技術(shù) 1、 PCR原理 2、 PCR的反應(yīng)過程 3、 DNA含量的鑒定 三、血紅蛋白的提取和分離 【重點(diǎn)解析】 一、DNA的粗提取和鑒定 1．DNA的理化性質(zhì) (1)DNA的溶解性 DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離目的。此外，DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些成分如蛋白質(zhì)等卻溶于酒精，利用這一原理，可將DNA與蛋白質(zhì)等進(jìn)一步地分離。 (2)DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對DNA沒有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60℃～80℃的高溫，而DNA在80℃以上時才會變性，洗滌劑能夠溶解細(xì)胞膜，但對DNA沒有影響。 (3)DNA的熱變性 DNA分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時，在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂，而在體外，DNA在80℃～l00℃的溫度范圍內(nèi)變性，即雙螺旋解開，成為單鏈；當(dāng)溫度慢慢降低后，兩條彼此分離的單鏈又會重新結(jié)合形成雙鏈。但高溫能使DNA聚合酶變性失活，后來發(fā)現(xiàn)了耐高溫的TaqDNA聚合酶，解決了上述矛盾。 2．基本原理 (1)DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，在0．14 mol／L的NaCl溶液中的溶解度最低，如下表所示 由上表可以看出，在NaCl溶液物質(zhì)的量濃度為2 mo1／L時，DNA溶解，部分蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析而生成沉淀，通過過濾可除去部分蛋白質(zhì)；在NaCl溶液物質(zhì)的量濃度為0．14 m01／L時，DNA析出．，過濾可除去溶解的部分蛋白質(zhì)。 (2)DNA不溶于酒精溶液——加入體積分?jǐn)?shù)為95％的冷卻酒精溶液可使DNA析出，除去溶于酒精的蛋白質(zhì)。 (3)DNA不被蛋白酶所水解——嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，加入嫩肉粉可使蛋白質(zhì)水解而DNA不被水解。 (4)DNA可被二苯胺染成藍(lán)色——向含DNA的試管中加入二苯胺并沸水浴，溶液呈現(xiàn)藍(lán)色可確認(rèn)DNA。 3．方法步驟 (1)實(shí)驗(yàn)材料的選擇 ①首先選擇含有DNA的生物材料。 ②選用DNA含量相對較高的生物組織，成功率較大。 (2)破碎細(xì)胞——獲取含DNA的濾液 ①動物細(xì)胞如雞血細(xì)胞——在血細(xì)胞液中加入蒸餾水，用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。 ②植物細(xì)胞用洗滌劑溶解細(xì)胞膜，進(jìn)行充分?jǐn)嚢韬脱心?，過濾后收集濾液。 (3)去除濾液中的雜質(zhì) 方案①利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，通過控制NaCl溶液的濃度去除雜質(zhì)(用2 mol／I。NaCl溶液過濾除去不溶的雜質(zhì)，用0．14 mol／I。NaCl溶液析出DNA，過濾，除去溶液中的雜質(zhì)，再用2 mol／L NaCl溶液溶解DNA)。 方案②在濾液中加入嫩肉粉，利用其蛋白酶水解蛋白質(zhì)。 方案③將濾液放入60℃～75℃恒溫水浴箱中保溫10～15 rain，使蛋白質(zhì)變性。 (4)DNA的析出與鑒定 ①析出：將處理后的溶液過濾，加入與濾液等體積的冷卻酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95％)靜置，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物(此即粗提取的DNA)，用玻璃棒沿一個方向攪拌卷起絲狀物。 ②鑒定 【例1】關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”的實(shí)驗(yàn)裝置如圖 (1)實(shí)驗(yàn)材料選用雞血細(xì)胞液，而不用雞全血。主要原因是雞血細(xì)胞液中 含量較高。 (2)在圖A所示的實(shí)驗(yàn)步驟中加蒸餾水20 mL的目的是 通過圖B所示的步驟取得濾液，再在濾液中加入2mol/l NaCl溶液的目的是 ．圖C所示實(shí)驗(yàn)中加蒸餾水的目的是 。 (3)為鑒定實(shí)驗(yàn)所得絲狀物的主要成分是DNA，可滴加 溶液，結(jié)果絲狀物被染成綠色。 解析：(1)雞血細(xì)胞中含較多的DNA，而血漿中不合DNA，因此，實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)用雞血細(xì)胞液而不用雞全血。 (2)要明確區(qū)別兩次加蒸餾水的目的，第一次目的是讓雞血細(xì)胞吸水漲破，放出DNA，第二次加蒸餾水是為了降低NaCl溶液的濃度，使溶解于2 molL_1 NaCl溶液中的 DNA析出。 (3)本題考查DNA的鑒定，可以加二苯胺沸水浴變藍(lán)色，也甲基綠使DNA變綠色，本題干無沸水浴這一條件，且結(jié)果是絲狀物變綠色，所以使用的試劑為甲基綠。 答案： (1)DNA (2)使血細(xì)胞吸水漲破，放出DNA使濾液中的DNA溶于鹽溶液 使DNA析出 (3)甲基綠 二、PCR技術(shù) 1．生物體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR反應(yīng)的區(qū)別 體內(nèi)DNA復(fù)制 PCR反應(yīng)， 時期 細(xì)胞有絲分裂間期或減數(shù)第一次分裂間期及無絲分裂、二分裂過程 體外隨時進(jìn)行 場所 細(xì)胞內(nèi) 微量離心管內(nèi) 解旋 在解旋酶作用下，細(xì)胞提供能量，部分解開 加熱至90℃，雙鏈全部解開，不需解旋酶 引物 一小段RNA 可以是RNA或單鏈DNA分子片段 合成子鏈 在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)合成，另一條鏈不連續(xù)合成 分別從兩條鏈的引物端開始，都是連續(xù)合成，控制溫度72℃ 特點(diǎn) 邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制 體外迅速擴(kuò)增 DNA聚合酶 需DNA聚合酶 需耐高溫的Taq DNA聚合酶 循環(huán)次數(shù) 受生物體自身控制 30多次 相同點(diǎn) ①需提供DNA復(fù)制的模板 ②四種脫氧核苷酸作原料 ③子鏈延伸的方向都是從5‘端到3‘端 2． PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA片段 (1)原理：DNA復(fù)制。 (2】需要條件：模板DNA、RNA引物、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)、離子。 (3)方法：DNA受熱變性解旋為單鏈、冷卻后RNA引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合、在DNA聚合酶作用下延伸合成互補(bǔ)鏈。 (4)特點(diǎn)：指數(shù)形式擴(kuò)增。 (5)過程：變性、復(fù)性、延伸、重復(fù)。 步驟名稱 需要溫度 過程 第一步變性 90℃～95℃ 將反應(yīng)體系(包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應(yīng)所需的離子等)加熱至90℃～95℃，使雙鏈DNA模板兩條鏈之間的氫鍵 打開，變成單鏈DNA，作為互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板 第二步復(fù)性 55℃～60℃ 將反應(yīng)體系降溫至55℃～60℃，使兩種引物分別與模板DNA鏈3’端的互補(bǔ)序列互補(bǔ)配對，這個過程稱為復(fù)性 第三步 延伸合成 70℃～75℃ 將反應(yīng)體系升溫至70℃～75℃，在耐高溫的DNA聚合酶催化作用下，將與模板互補(bǔ)的單個核苷酸加到引物所提供的3 7一OH上，使DNA鏈延伸，產(chǎn)生一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈。 (6)結(jié)果：上述三步反應(yīng)完成后，一個DNA分子就變成了兩個DNA分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNA分子就以2”的形式增加。PCR的反應(yīng)過程都是在PCR擴(kuò)增儀中完成的。 【例2】2008年5月20日，民政部制訂汶川大地震遇難人員遺體處理意見時指出，無法確認(rèn)遇難者身份的，由公安部門提取可供DNA檢驗(yàn)的檢材以便后身份辨認(rèn)。事后的遺體辨認(rèn)可借助于DNA雜交技術(shù)，即從遺體細(xì)胞與死者家屬提供的死者生前生活用品中分別提取DNA，然后借助DNA雜交技術(shù)對遺體進(jìn)行確認(rèn)。請回答下列問題： (1)為了確保辨認(rèn)的準(zhǔn)確性，需要克隆出較多的DNA樣品，這需要借助PCR技術(shù)。使用PCR技術(shù)的具體實(shí)驗(yàn)操作順序是：按配方準(zhǔn)備好各組分 離心使反應(yīng)液集中在離心管底部一設(shè)計好PCR儀的循環(huán)程序一進(jìn)行PCR反應(yīng)。在該操作過程中應(yīng)特別注意的問題是 (2)如表所示為分別從死者遺體和死者生前的生活用品中 提取的三條相同染色體上的同一區(qū)段DNA單鏈的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對情況進(jìn)行判斷，A、B、C三組DNA中不是同一人的是 A組 B組 C組 遺體中的DNA堿基序列 ACTGACGGTT GGCTTATCGA GCAATCGTGC 家屬提供的DNA堿基序列 TGACTGCCAA CCGAATAGCA CGGTAAGACG (3)為什么從死者體細(xì)胞與死者家屬提供的其生前生活用品中分別提取的DNA可以完全互補(bǔ)配對? 解析：從遺體細(xì)胞和死者家屬提供的死者生前的生活用品中分別提取DNA，在一定溫度下，水浴共熱，使DNA氫鍵斷裂，雙鏈打開。若兩份DNA樣本來自同一個體，在溫度 降低時，兩份樣本中的DNA單鏈通過氫鍵連接在一起，若不是來自同一個體，則兩份樣本中的DNA單鏈在一定程度上不能互補(bǔ)，DNA雜交技術(shù)就是通過這一過程對面目全非 的死者進(jìn)行辨認(rèn)的。 答案： (1)用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分PCR實(shí)驗(yàn)使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌 (2)B、C (3)人體所有體細(xì)胞均由一個受精卵經(jīng)有絲分裂產(chǎn)生，其細(xì)胞核中均含有相同的遺傳物質(zhì) 三、血紅蛋白的提取和分離 1．實(shí)驗(yàn)原理 (1)蛋白質(zhì)各種特性(如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等)的差異，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。 (2)有效方法——凝膠色譜法：根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)。 ①凝膠是由多糖類化合物構(gòu)成的微小的多孔球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。 ②相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)，無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。 (3)電泳：蛋白質(zhì)等生物大分子都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下會帶上正電或負(fù)電。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。故電泳可利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 2．實(shí)驗(yàn)操作程序 (2)粗分離——透析 將盛有1 mL血紅蛋白溶液的透析袋放入盛有300 mL的物質(zhì)的量濃度為20 mm01／L的磷酸緩沖液中透析12 h，去除樣品中的小分子雜質(zhì)。 (3)純化——采用凝膠色譜法對血紅蛋白進(jìn)行分離和純化 (4)純度鑒定：一般用SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，來測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，即對血紅蛋白進(jìn)行純度鑒定。 【例3】紅細(xì)胞含有大量的血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來提取和分離血紅蛋白，請回答下列有關(guān)問題： (1)以上所述的過程即是樣品處理，它包括 、 、分離血紅蛋白溶液。 (2)收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過透析，這就是樣品的粗分離。 ①透析的目的是 。 ②透析的原理是 。 (3)然后通過凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化，最后經(jīng)SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。 ①樣品純化的目的是 。 ②血紅蛋白有什么特點(diǎn)? 。這一特點(diǎn)對進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義? 解析：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血劑檸檬酸鈉。透析可以去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液，透析袋一般是用硝酸纖維素(又稱玻璃紙)制成的，能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)。血紅蛋白因含血紅素而呈現(xiàn)紅色，在凝膠色譜分離時，可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液，使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作。 答案： (1)紅細(xì)胞的洗滌血紅蛋白的釋放 (2)①去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì) ②透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子則保留在袋內(nèi) (3)①通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜蛋白除去 ②血紅蛋白呈現(xiàn)紅色，在凝膠色譜分離時，可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液 使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作 【實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練】 （09江蘇卷）23．下列關(guān)于DNA和蛋白質(zhì)提取與分離實(shí)驗(yàn)的敘述，正確的有 A．提取細(xì)胞中的DNA和蛋白質(zhì)都需用蒸餾水漲破細(xì)胞 B．用不同濃度NaCl溶液反復(fù)溶解與析出DNA可去除蛋白質(zhì) C．蛋白質(zhì)提取和分離過程中進(jìn)行透析可去除溶液中的DNA D．蛋白質(zhì)和DNA都可以用電泳的方法進(jìn)行分離純化 答案：BD 解析：A選項(xiàng)，在提取DNA時，如果是用動物的細(xì)胞需要用蒸餾水漲破，如果用植物細(xì)胞則不需要，而是用洗滌劑溶解細(xì)胞膜；用2 mol／L的NaCl溶液溶解DNA，然后過濾出蛋白質(zhì)，再降低NaCl溶液的濃度，析出DNA。DNA和蛋白質(zhì)樣品都是帶負(fù)電荷的，從負(fù)極向正極移動，移動的距離都和樣品的分子量有關(guān)。C中透析用以出去小分子物質(zhì)，DNA是大分子物質(zhì)，D是常規(guī)方法比如用十二烷基磺酸鈉，可以根據(jù)其分子大小及所帶電荷性質(zhì)進(jìn)行分離純化 【名師點(diǎn)撥】 關(guān)鍵解讀PCR技術(shù)中的變性、復(fù)性與延伸 (1)變性：當(dāng)溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解旋為單鏈，如圖： (2)復(fù)性：當(dāng)溫度下降至50℃左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合，如圖： (3)延伸：當(dāng)溫度上升至72℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈，如圖：