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2019-2020年高中生物第1部分微生物的利用實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離教案浙科版選修 課　標(biāo)　解　讀 重　點(diǎn)　難　點(diǎn) 1.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作。 2.進(jìn)行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的劃線培養(yǎng)。 3.說(shuō)明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和實(shí)驗(yàn)原理。 1.微生物實(shí)驗(yàn)的無(wú)菌操作。 2.利用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。 3.利用LB固體培養(yǎng)基分離大腸桿菌。 4.劃線分離法和涂布分離法。 2．在腸道中，大腸桿菌一般對(duì)人無(wú)害，但也有一些菌株可以侵襲腸黏膜并產(chǎn)生毒素，任何大腸桿菌如果進(jìn)入人的泌尿系統(tǒng)，都會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。 3．大腸桿菌是基因工程技術(shù)中被廣泛采用的工具。 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1．本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容是將大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)和劃線分離。分離后，一個(gè)菌體便會(huì)形成一個(gè)菌落，這是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡(jiǎn)便方法之一。 2．本實(shí)驗(yàn)用LB液體培養(yǎng)基(通用的細(xì)菌培養(yǎng)基)擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌。培養(yǎng)后再在LB固體平面培養(yǎng)基上劃線進(jìn)行分離，隨后培養(yǎng)基上便會(huì)形成一個(gè)個(gè)單獨(dú)的菌落。 三、細(xì)菌的培養(yǎng)和分離 1．細(xì)菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，約20分鐘分裂一次。人們?cè)谂囵B(yǎng)細(xì)菌時(shí)，一般用接種環(huán)轉(zhuǎn)移帶菌的培養(yǎng)物。接種時(shí)，先將接種環(huán)在明火上燒紅后冷卻，再操作。 2．細(xì)菌的分離 (1)劃線分離法：在液體培養(yǎng)基中，只要接種后培養(yǎng)8 h，每毫升培養(yǎng)基中就有幾億個(gè)細(xì)菌。可用接種環(huán)蘸菌液在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線過(guò)程中接種環(huán)上的菌液逐漸減少，因此，劃線到最后，可使細(xì)菌間的距離加大。在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)10～20 h后，可由一個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生單菌落，菌落不會(huì)重疊。如果再將每個(gè)菌落分別接種至含有固體培養(yǎng)基的試管斜面上，在斜面上劃線，則每個(gè)斜面的菌群就是由一個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生的后代。這種方法也可用于分離細(xì)菌，將污染的雜菌除去。 接種環(huán)在取菌種前和劃線前都要灼燒、而后都要冷卻、操作完畢后又要灼燒的原因是什么？ 【提示】　取菌種前灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環(huán)冷卻后進(jìn)行，目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環(huán)的目的是防止細(xì)菌污染環(huán)境和操作者。 (2)涂布分離法：先將培養(yǎng)的菌液稀釋，通常稀釋10－5～10－7倍，然后取0.1 mL不同稀釋度的稀釋菌液加在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進(jìn)行培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)南♂尪认?，可產(chǎn)生相互分開(kāi)的菌落。通常每個(gè)培養(yǎng)皿有20個(gè)以內(nèi)的單菌落最為適合。將每個(gè)菌落分別接種在斜面上擴(kuò)增培養(yǎng)后，再做功能性實(shí)驗(yàn)。 細(xì)菌的兩種分離法各有優(yōu)點(diǎn)，都可采用。劃線分離法，方法簡(jiǎn)單；涂布分離法，單菌落更易分開(kāi)，但操作復(fù)雜些。 四、滅菌操作 1．各種器皿必須是無(wú)菌的：實(shí)驗(yàn)用具用牛皮紙或報(bào)紙包好，所有容器都先封口，然后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(1 kg/cm2壓力、121 ℃、15 min)處理，并在超凈臺(tái)上使用。 注意：實(shí)驗(yàn)中所需棉花不能用脫脂棉，因?yàn)槊撝抟孜? 2．各種培養(yǎng)基必須是無(wú)菌的。 3．細(xì)菌轉(zhuǎn)移過(guò)程要避免雜菌污染和菌種外泄。 注意：培養(yǎng)皿需倒置，防止冷凝后形成的水珠滴落在培養(yǎng)基上污染培養(yǎng)基，沖散菌落。 五、大腸桿菌培養(yǎng)與分離的實(shí)驗(yàn)步驟 1．在兩個(gè)250 mL三角瓶中分別裝入50 mL LB液體培養(yǎng)基和50 mL LB固體培養(yǎng)基，加上封口膜。將培養(yǎng)皿包好，連同培養(yǎng)基一同滅菌15 min。 2．滅菌后待培養(yǎng)基冷卻至60 ℃時(shí)，關(guān)閉紫外燈，點(diǎn)燃酒精燈，并用酒精棉球擦拭桌面和實(shí)驗(yàn)者的手。在酒精燈火焰旁用右手持盛有固體培養(yǎng)基的三角瓶，左手拿培養(yǎng)皿，并將培養(yǎng)基倒入4個(gè)培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于水平位置上，待其凝固。 為什么要在酒精燈火焰旁進(jìn)行操作？ 【提示】　酒精燈火焰旁約10 cm的空間是一個(gè)無(wú)菌區(qū)，在酒精燈火焰旁操作能防止雜菌污染。 3．?dāng)U大培養(yǎng) 先將接種環(huán)在酒精燈火焰上燒紅，再深入到大腸桿菌斜面，使環(huán)冷卻后，取菌體，并將菌體放入三角瓶液體培養(yǎng)基中，封瓶后在37 ℃每分鐘200轉(zhuǎn)的搖床上振蕩培養(yǎng)12 h。 4．劃線分離 用在酒精燈火焰上灼燒后的接種環(huán)深入到搖床上培養(yǎng)后的菌液中，然后在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線，接種環(huán)需蘸菌液1次，劃線后蓋好皿蓋，將培養(yǎng)皿倒置，在37 ℃，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h后，可在劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個(gè)菌落，表明菌已被分離。 5. 在無(wú)菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。 微生物培養(yǎng)的基本條件 1.培養(yǎng)基及其類型 (1)培養(yǎng)基：①概念：人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，此即培養(yǎng)基。 ②作用：在提供主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及O2的需求，如培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)需在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時(shí)需將pH調(diào)至酸性，培養(yǎng)厭氧型微生物需給予無(wú)氧條件等。 (2)培養(yǎng)基的種類 劃分標(biāo)準(zhǔn) 培養(yǎng)基種類 特點(diǎn) 用途 物理性質(zhì) 液體培養(yǎng)基 不加凝固劑 微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)、工業(yè)生產(chǎn) 半固體培養(yǎng)基 加凝固劑，如瓊脂 觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、分類鑒定 固體培養(yǎng)基 微生物分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)、保藏菌種 用途 選擇培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng) 培養(yǎng)、分離出特定微生物(如培養(yǎng)酵母菌和霉菌，可在培養(yǎng)基中加入青霉素；培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，可在培養(yǎng)基中加入高濃度食鹽) 用途 鑒別培養(yǎng)基 根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品 鑒別不同種類的微生物，如可用伊紅—美藍(lán)培養(yǎng)基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(若有，菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤) 2.無(wú)菌技術(shù) 進(jìn)行微生物培養(yǎng)獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染，無(wú)菌技術(shù)即圍繞著如何避免雜菌的污染展開(kāi)，主要包括以下幾個(gè)方面： (1)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。 (2)將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。 (3)為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。 (4)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。 3．消毒和滅菌的比較 概念 常用方法 應(yīng)用的范圍 消毒 使用較為溫和的物理或化學(xué)方法，殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法：在100 ℃開(kāi)水中煮沸5～6 min 一般物品 巴氏消毒法：70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min 對(duì)于一些不耐高溫的液體，如牛奶 化學(xué)藥劑消毒法 如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等 滅菌 使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物(包括芽孢和孢子) 灼燒滅菌：酒精燈火焰 接種工具的滅菌 干熱滅菌：干熱滅菌箱內(nèi)160～170 ℃下滅菌1～2 h 玻璃器皿、金屬工具的滅菌 高壓蒸汽滅菌：121 ℃條件下，滅菌15～30 min 培養(yǎng)基及容器的滅菌 注：消毒與滅菌的最大區(qū)別是芽孢和孢子能否存活 　某小組同學(xué)為了調(diào)查湖水中細(xì)菌的污染情況而進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)包括制備培養(yǎng)基、滅菌、接種及培養(yǎng)、菌落觀察計(jì)數(shù)。請(qǐng)回答與此實(shí)驗(yàn)相關(guān)的問(wèn)題。 (1)制備培養(yǎng)基：根據(jù)物理性質(zhì)的不同，可以將培養(yǎng)基分為液體、半固體和固體培養(yǎng)基。對(duì)細(xì)菌進(jìn)行大量的擴(kuò)增，用________培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離，用________培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。 (2)滅菌：在培養(yǎng)微生物時(shí)必須進(jìn)行無(wú)菌操作，包括各種________都必須是無(wú)菌的。對(duì)它們進(jìn)行滅菌，通常用________法滅菌。 (3)接種及培養(yǎng)：接種時(shí)常用的工具是________和玻璃三角刮刀。 為了盡快觀察到細(xì)菌培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)將接種了湖水樣品的平板置于________中培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度設(shè)定在37 ℃。要使該實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果可靠，還應(yīng)該同時(shí)在另一平板上接種________作為對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 (4)菌落觀察計(jì)數(shù)：培養(yǎng)20小時(shí)后，觀察到平板上有形態(tài)和顏色不同的菌落，這說(shuō)明湖水樣品中有________種細(xì)菌。一般說(shuō)來(lái)，菌落總數(shù)越多，湖水遭受細(xì)菌污染的程度越________。 (5)選擇培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)。如果提高培養(yǎng)基中NaCl的濃度，可以用于篩選耐________細(xì)菌。 【思路點(diǎn)撥】　(1)細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基，分離用固體培養(yǎng)基。(2)無(wú)菌操作包括所有的器皿要無(wú)菌，所有的培養(yǎng)基要無(wú)菌，接種過(guò)程要防止雜菌污染。實(shí)驗(yàn)室中常用高壓蒸汽滅菌法。(3)接種時(shí)常用接種環(huán)，用恒溫培養(yǎng)箱保持溫度。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，除實(shí)驗(yàn)變量以外的其他各變量應(yīng)適宜且相同，以利于更好地實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?4)不同的菌落具有各自不同的菌落特征(如硬度、顏色、透明度、光滑度等。)(5)選擇培養(yǎng)基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來(lái)。 【答案】　(1)液體　固體平面　(2)器皿和培養(yǎng)基 高壓蒸汽滅菌　(3)接種環(huán)　恒溫培養(yǎng)箱　無(wú)菌水 (4)多　高　(5)鹽(或NaCl) 1．細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中分別采用了高壓蒸汽、用酒精棉球擦試、火焰灼燒等幾種不同的處理，這些方法依次用于殺滅哪些部位的雜菌(　　) A．接種環(huán)、手、培養(yǎng)基 B．高壓鍋、手、接種環(huán) C．培養(yǎng)基、手、接種環(huán) D．接種環(huán)、手、高壓鍋 【解析】　此題考查對(duì)無(wú)菌技術(shù)的掌握。高壓蒸汽滅菌鍋是滅菌的一個(gè)設(shè)備，通常用于培養(yǎng)基的滅菌。用酒精擦拭雙手是消毒的一種方法?；鹧孀茻梢匝杆?gòu)氐椎販缇?，適用于微生物接種工具的滅菌，如接種環(huán)。 【答案】　C 大腸桿菌的培養(yǎng)和分離 1.LB培養(yǎng)基的制備 (1)計(jì)算：根據(jù)LB培養(yǎng)基配方的比例，計(jì)算配制50 mL 的培養(yǎng)基時(shí)各種成分的用量。 (2)稱量：準(zhǔn)確地稱取各種成分。即：蛋白胨0.5 g、酵母提取物0.25 g、氯化鈉0.5 g，加水50 mL。(如配LB固體培養(yǎng)基，則再加1 g 瓊脂) (3)制備空白斜面：將LB液體培養(yǎng)基配好，加入瓊脂并加熱使之融化后，通過(guò)玻璃漏斗加入試管中，每試管2 mL，加棉塞并將試管捆在一起，上端加蓋一張牛皮紙，滅菌。滅菌后斜靠于平放的鉛筆上，冷卻后即成空白斜面培養(yǎng)基。 2．進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng)與分離操作 (1)滅菌 (2)制備LB固體平面培養(yǎng)基——倒平板操作 待培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右時(shí)，在酒精燈火焰附近倒平板。倒平板的具體操作描述如下： (3)擴(kuò)大培養(yǎng) ①左手持大腸桿菌斜面和有液體培養(yǎng)基的三角瓶，右手拿接種環(huán)并用無(wú)名指、小指夾住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。 ②將接種環(huán)在火焰上燒紅，再深入到斜面，使其冷卻后取菌體。 ③將菌體放入三角瓶液體培養(yǎng)基中(將封口膜及斜面棉塞復(fù)原)。 ④三角瓶在37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)12 h。 (4)劃線分離 ①取種 在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)，將上述培養(yǎng)后的菌液打開(kāi)，接種環(huán)部分深入到菌液中取種。 ②平板劃線操作 在LB固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線(如下圖所示)，劃線后蓋好培養(yǎng)皿。 ③培養(yǎng) 將上述劃線操作后的培養(yǎng)皿倒置放至37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h，可看到劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個(gè)菌落，表明菌已被分離。 (5)菌種純化與保藏 在無(wú)菌操作下，將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種至斜面上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，4 ℃冰箱保存即可。 劃線的目的是將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面，以期在連續(xù)劃線后，可以分離到由單個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的子細(xì)胞群體(菌落)，從而達(dá)到純化菌種的目的，為此，在劃線操作時(shí)，接種環(huán)只需在菌液中蘸取菌液一次，且作第二次及其以后的劃線操作時(shí)，須從上一次劃線的末端劃線——如此可使菌體數(shù)量隨劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散，最終實(shí)現(xiàn)在平板上得到單菌落的目的。 　下圖為“大腸桿菌的培養(yǎng)和分離”實(shí)驗(yàn)的基本流程： →→→→ 請(qǐng)回答： (1)滅菌常用________法，滅菌后，要待________________時(shí)才能打開(kāi)鍋蓋。 (2)倒平板和接種前要用________擦手。接種和劃線前使用________的方法對(duì)接種環(huán)滅菌。 (3)劃線分離時(shí)，接種環(huán)在菌液中蘸取________次。下圖甲表示在平板培養(yǎng)基上的第一次和第二次劃線，請(qǐng)?jiān)谝覉D中畫出第三次劃線。 (4)劃線后在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)皿須倒置，目的是__________________。 (5)實(shí)驗(yàn)完成后，接觸過(guò)細(xì)菌的器皿應(yīng)如何處理？____________________。 【思路點(diǎn)撥】　此題考查大腸桿菌的培養(yǎng)和分離過(guò)程，具體分析如下： (1)滅菌是指對(duì)LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行的滅菌。對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行的滅菌應(yīng)該是用滅菌鍋進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。滅菌后，滅菌鍋內(nèi)的壓力與大氣壓相同時(shí)，才能打開(kāi)滅菌鍋，否則會(huì)造成培養(yǎng)液濺出。 (2)在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，操作者的雙手要用酒精棉球擦拭消毒，接種環(huán)要用火焰燒灼滅菌。 (3)劃線分離時(shí)，接種環(huán)在菌液中蘸取菌液1次然后連續(xù)劃線。 (4)在培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)皿須倒置，目的是防止冷凝后形成的水滴落在培養(yǎng)基上污染培養(yǎng)基，沖散菌落。 (5)實(shí)驗(yàn)完成后，接觸過(guò)細(xì)菌的器皿應(yīng)滅菌處理以防止污染。 【答案】　(1)高壓蒸汽　滅菌鍋內(nèi)壓力與大氣壓相同 (2)酒精棉球　(酒精燈火焰上)灼燒 (3)1　(見(jiàn)右圖) (4)避免水滴污染培養(yǎng)基 (5)接觸過(guò)細(xì)菌的器皿應(yīng)作滅菌處理 劃線分離操作 ①第一次劃線及每次劃線之前都需灼燒滅菌，劃線操作結(jié)束仍需灼燒接種環(huán)，每次灼燒的目的如下表： 第一次灼燒 每次劃線之前灼燒 劃線結(jié)束灼燒 目的 避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物 殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使每次劃線的菌種來(lái)自上次劃線末端 殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者 ②灼燒接種環(huán)之后，要冷卻后才能伸入菌液，以免溫度太高殺死菌種。 ③劃線時(shí)最后一區(qū)域不要與第一區(qū)域相連。 ④劃線用力要大小適當(dāng)，防止用力過(guò)大將培養(yǎng)基劃破。 2．下圖為“大腸桿菌的培養(yǎng)和分離”實(shí)驗(yàn)的基本流程，請(qǐng)回答： →→→→ (1)A過(guò)程配制的是通用細(xì)菌培養(yǎng)基，稱為_(kāi)_______培養(yǎng)基。配制時(shí)除了加入特定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以外，還要加入一定量的氯化鈉，以維持________。對(duì)培養(yǎng)基酸堿度的調(diào)節(jié)，應(yīng)該在B過(guò)程的________(填“前面”或“后面”)。 (2)D過(guò)程與C過(guò)程相比，培養(yǎng)基中增加的物質(zhì)是________。E過(guò)程所需的溫度是________。 (3)D過(guò)程后，一個(gè)菌體便會(huì)形成一個(gè)________，這種分離方法是________________的通用方法，也是篩選特定菌株的最簡(jiǎn)便方法之一。 【答案】　(1)LB　滲透壓　前面　(2)瓊脂　4 ℃ (3)(單)菌落　消除污染雜菌(純化菌種) 1．下列有關(guān)倒平板操作錯(cuò)誤的是(　　) A．將滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上 B．使打開(kāi)的錐形瓶瓶口迅速通過(guò)火焰 C．將培養(yǎng)皿打開(kāi)，培養(yǎng)皿蓋倒放在桌面上 D．等待平板冷卻凝固后需要將平板倒過(guò)來(lái)放置 【解析】　整個(gè)倒平板過(guò)程要防止外來(lái)雜菌的入侵，因此，滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，打開(kāi)的錐形瓶瓶口迅速通過(guò)火焰，培養(yǎng)皿打開(kāi)一條稍大于瓶口的縫隙，不能將培養(yǎng)皿蓋完全打開(kāi)，等待平板冷卻凝固后需要將平板倒過(guò)來(lái)放置。 【答案】　C 2．無(wú)菌技術(shù)包括以下幾個(gè)方面的敘述，其中錯(cuò)誤的是(　　) A．對(duì)培養(yǎng)操作的空間、操作者的衣著和手進(jìn)行滅菌 B．對(duì)培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌 C．為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行 D．實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸 【解析】　滅菌是采用強(qiáng)烈的理化因素對(duì)用于微生物培養(yǎng)的培養(yǎng)皿、接種用具和培養(yǎng)基進(jìn)行處理，使物體內(nèi)外一切微生物，包括芽孢和孢子都要被殺死；實(shí)驗(yàn)操作者的衣著和手以及操作空間只能進(jìn)行消毒。 【答案】　A 3．下列依次表示倒平板、接種的位置，以及劃線法接種的路徑示意圖，其中錯(cuò)誤的是(　　) 【解析】　在劃線時(shí)，應(yīng)在第一區(qū)的劃線末端開(kāi)始往第二區(qū)域內(nèi)劃線，在第二區(qū)的劃線末端開(kāi)始往第三區(qū)劃線。 【答案】　D 4．關(guān)于大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn)以下敘述不正確的是(　　) A．本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容是將大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和劃線分離 B．本實(shí)驗(yàn)用LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌，再在LB固體平面培養(yǎng)基上劃線進(jìn)行大腸桿菌的分離 C．除劃線分離外，也可用涂布分離法分離大腸桿菌，兩種分離方法中劃線分離方法簡(jiǎn)單且單菌落更易分開(kāi) D．進(jìn)行培養(yǎng)之前對(duì)加入培養(yǎng)基的三角瓶、試管也要在121 ℃下滅菌15 min 【解析】　劃線分離與涂布分離均可實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的分離，其中劃線分離法操作簡(jiǎn)單，但單菌落相對(duì)不易分開(kāi)，涂布分離法操作雖相對(duì)復(fù)雜，但單菌落更易分開(kāi)。 【答案】　C 5．微生物與人類關(guān)系密切。雖然有些微生物能使動(dòng)植物患病，但多數(shù)微生物對(duì)人類是有益的。請(qǐng)回答： (1)培養(yǎng)基中含有蛋白胨、淀粉分別為細(xì)菌培養(yǎng)提供____________。對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，應(yīng)該采用的方法是____________。接種時(shí)通常采用________法。 (2)在制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的倒平板操作時(shí)，平板冷凝后，要將平板倒置的原因是____________________________________________________ ____________________________________________________________。 (3)微生物接種的方法很多，最常用的是平板劃線法和____________法。在用平板劃線法接種時(shí)，在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)的目的是______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ____________________________________________________________。 在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ____________________________________________________________。 【答案】　(1)氮源(碳源)、碳源　高壓蒸汽滅菌　平板劃線 (2)皿蓋上會(huì)凝有水珠，防止水珠落入培養(yǎng)皿造成污染，還可使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā) (3)稀釋涂布平板 第一步灼燒接種環(huán)是防止接種環(huán)上有其他微生物而污染培養(yǎng)基。每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次接種時(shí)留下的菌種，使下一次劃線時(shí)接種環(huán)上的菌種直接來(lái)自上次劃線的末端，以便通過(guò)多次劃線后，得到單個(gè)的菌落　劃線結(jié)束后仍要灼燒接種環(huán)，以免菌種對(duì)環(huán)境造成污染和感染操作者 學(xué)業(yè)達(dá)標(biāo)測(cè)評(píng)(一)　大腸桿菌的培養(yǎng)和分離 1．要從多種細(xì)菌中分離某種細(xì)菌，培養(yǎng)基要用(　　) A．固體培養(yǎng)基 B．液體培養(yǎng)基 C．加青霉素的培養(yǎng)基 D．加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基 【解析】　分離微生物應(yīng)使用固體培養(yǎng)基。 【答案】　A 2．涂布平板操作需要用到(　　) A．接種環(huán)、滴管、酒精燈 B．接種環(huán)、移液管、酒精燈 C．涂布器、移液管、酒精燈 D．涂布器、接種環(huán)、酒精燈 【解析】　涂布平板操作過(guò)程中不需要接種環(huán)。 【答案】　C 3．采用干熱滅菌、灼燒滅菌、高壓蒸汽滅菌、紫外線照射等幾種方法，可分別殺死哪些部位的雜菌(　　) A．接種環(huán)、吸管、培養(yǎng)基、接種室 B．吸管、接種環(huán)、培養(yǎng)基、接種箱 C．培養(yǎng)基、接種環(huán)、吸管、接種箱 D．培養(yǎng)皿、吸管、培養(yǎng)基、雙手 【解析】　干熱滅菌主要對(duì)玻璃器皿進(jìn)行滅菌，紫外線主要對(duì)接種室和接種箱進(jìn)行空氣和表面滅菌。 【答案】　B 4．下列操作錯(cuò)誤的是(　　) A．用酒精擦拭雙手 B．用氯氣消毒水源 C．實(shí)驗(yàn)室用紫外線進(jìn)行消毒 D．玻璃器皿(吸管、培養(yǎng)皿)用酒精直接擦拭即可達(dá)到徹底滅菌的目的 【解析】　玻璃器皿應(yīng)用干熱無(wú)菌箱在160～170 ℃加熱1～2 h才能達(dá)到無(wú)菌目的。 【答案】　D 5．在涂布平板操作時(shí)錯(cuò)誤的是(　　) A．將涂布器在酒精燈火焰上灼燒，直到燒紅 B．取少量菌液滴加在培養(yǎng)基表面 C．將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃待酒精燃盡后，冷卻8～10 s再用 D．涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻 【解析】　涂布平板所用涂布器是玻璃器皿，不能在酒精燈火焰上灼燒，否則會(huì)變形，正確方法是沾取少量酒精，引燃。 【答案】　A 6．利用涂布分離法純化的大腸桿菌，經(jīng)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上出現(xiàn)了多種菌落，不可能的原因是(　　) A．培養(yǎng)基制備過(guò)程中被雜菌污染 B．接種過(guò)程中，無(wú)菌操作不符合要求 C．系列稀釋時(shí)，無(wú)菌操作不符合要求 D．由大腸桿菌的種類不同造成的 【解析】　大腸桿菌培養(yǎng)基中出現(xiàn)了多種菌落，說(shuō)明污染了雜菌，雜菌可能來(lái)自培養(yǎng)基，也可能是因?yàn)椴僮鬟^(guò)程中無(wú)菌操作不符合要求。 【答案】　D 7．下列與大腸桿菌及其培養(yǎng)與分離的相關(guān)敘述正確的是(　　) A．大腸桿菌是革蘭氏陽(yáng)性菌 B．大腸桿菌的代謝類型是異養(yǎng)需氧型 C．可用LB固體平面培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌 D．進(jìn)行平板劃線分離時(shí)，接種環(huán)只需蘸菌液一次 【解析】　大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，其代謝類型為異養(yǎng)兼性厭氧型，擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌宜使用LB液體培養(yǎng)基，LB固體平面培養(yǎng)基可用于劃線分離，進(jìn)行劃線分離時(shí)，為達(dá)到分離目的，獲得單菌落，接種環(huán)只需蘸取菌液一次，故只有D選項(xiàng)所述正確。 【答案】　D 8．(xx杭州檢測(cè))請(qǐng)回答微生物培養(yǎng)的有關(guān)問(wèn)題： (1)人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需要，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)稱培養(yǎng)基。培養(yǎng)基之所以有________、________和半固體培養(yǎng)基等三種，主要是培養(yǎng)基中所添加的________含量不同。 (2)微生物個(gè)體是肉眼看不見(jiàn)的，但固體培養(yǎng)基上的微生物的________是可見(jiàn)的，該結(jié)構(gòu)的特征常常是鑒定菌種的主要依據(jù)之一。 (3)微生物的營(yíng)養(yǎng)包括碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、水和無(wú)機(jī)鹽。培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)，在培養(yǎng)基中所添加的維生素屬于________；在培養(yǎng)基中添加酸或堿或緩沖溶液的作用是__________________________________________________。 (4)培養(yǎng)微生物的操作必須實(shí)行無(wú)菌操作，以防止____________的入侵等作用。無(wú)菌操作主要包括________和滅菌；前者不能殺死芽孢和孢子，后者能殺死芽孢和孢子。 (5)微生物接種的方法很多，最常用的是________和______________。 【答案】　(1)固體培養(yǎng)基　液體培養(yǎng)基　瓊脂(凝固劑) (2)菌落 (3)生長(zhǎng)因子　調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH(酸堿度) (4)外來(lái)雜菌　消毒 (5)平板劃線法　稀釋涂布平板法 9．從自然菌樣中篩選較理想生產(chǎn)菌種的一般步驟是：采集菌樣→富集培養(yǎng)→純種分離→性能測(cè)定。 (1)不同微生物的生存環(huán)境不同，獲得理想微生物的第一步是從適合的環(huán)境采集菌樣，然后再按一定的方法分離、純化。培養(yǎng)耐鹽菌的菌樣應(yīng)從____________中采集，培養(yǎng)厭氧菌的菌樣應(yīng)從________中采集。 (2)富集培養(yǎng)指創(chuàng)設(shè)僅適應(yīng)于該微生物旺盛生長(zhǎng)的特定的環(huán)境條件，使待分離微生物在群落中的數(shù)量大大增加，從而達(dá)到從自然界中分離到所需特定微生物的培養(yǎng)方法。對(duì)耐鹽菌富集培養(yǎng)的培養(yǎng)基應(yīng)是______的選擇培養(yǎng)基；對(duì)高溫淀粉酶的富集培養(yǎng)應(yīng)選擇__________________的選擇培養(yǎng)基，并在________條件下培養(yǎng)。 (3)實(shí)驗(yàn)室最常用的滅菌方法是利用高溫處理達(dá)到殺菌的效果。高溫滅菌的原理是高溫使微生物的______________等物質(zhì)發(fā)生________。________滅菌法是微生物研究和教學(xué)中應(yīng)用最廣、效果最好的滅菌法。 (4)下面兩圖是采用純化微生物培養(yǎng)的兩種接種方法接種后培養(yǎng)的效果圖解，請(qǐng)分析接種的具體方法。 獲得圖A效果的接種方法是____________，獲得圖B效果的接種方法是________。 【答案】　(1)高鹽環(huán)境　無(wú)氧環(huán)境　(2)加鹽　以淀粉為唯一碳源　高溫　(3)蛋白質(zhì)和核酸　變性　高壓蒸汽　(4)(稀釋)涂布分離法　劃線分離法