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細胞培養(yǎng)技術,藺帥 2013年4月,主要內容,,細胞簡介,細胞是生命活動的基本單位 1665年英國學者Robert Hooke，用自制的顯微鏡觀察軟木的薄片，第一次發(fā)現(xiàn)植物的細胞結構，并首次借用拉丁文Cella（小室）詞.,細胞簡介,細胞是生命活動的基本單位 1983-39德國植物學家施萊登和動物學家施旺確立了“細胞學說”的基本原則 1、細胞是有機體，動植物都是由細胞發(fā)育來的 2、每個細胞都作為一個相對的獨立單位，有自己的“生命” 3、新的細胞可以通過老的細胞繁殖產生,細胞培養(yǎng)技術平臺,細胞的培養(yǎng)具體方法與步驟,細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)(cell culture) 的含義，簡單地說即是把來自機體的組織經分散成為單個細胞，放在類似于體內的體外環(huán)境中生存，使其不斷生長、繁殖或傳代，借以觀察細胞的生長、繁殖、衰老等生命現(xiàn)象。細胞培養(yǎng)技術在遺傳學、免疫學、腫瘤學、病毒學、分子生物學等領域已得到廣泛的應用 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng),細胞的培養(yǎng)具體方法與步驟,原代培養(yǎng) 用直接從機體獲得的細胞進行的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。這種培養(yǎng)過程主要是采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動物體內取出，經酶消化處理，使分散成單個細胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長和繁殖。原代培養(yǎng)是建立各種細胞系的第一步。,細胞的培養(yǎng)具體方法與步驟,傳代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)是指細胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或其他比率轉移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化，把細胞分散成單細胞再傳代，而懸浮型生長細胞則用直接傳代法或離心法傳代。,HEK293T和HEK293細胞,HEK293細胞簡介,HEK293細胞在倒置顯微鏡下的形態(tài),HEK293T和HEK293細胞,HEK293細胞簡介 HEK293細胞株是轉染腺病毒E1A基因的人胚腎上皮細胞，由于容易轉染且容易培養(yǎng)，常被用于轉染試驗。,HEK293T和HEK293細胞,瞬時轉染 在瞬時轉染中重組DNA導入感染性強的細胞系已獲得目的基因暫時但高水平的表達。轉染的DNA不必整合進宿主染色體，當用大量的樣品需要在短時間內分析時，尤其是在轉然后的1-4天內收獲細胞，所得的溶解產物用于檢測目的基因的表達，可以采用瞬時表達的方式。 穩(wěn)定轉染 這種細胞系中轉染的目的基因整合到宿主染色體DNA中并指導適量的目的蛋白的合成。一般來說轉染細胞的效率要比瞬時轉染的效率低1-2個數(shù)量級。,HEK293細胞,HEK293細胞生長條件 完全培養(yǎng)基 10%的胎牛血清 DMEM(4.0mM L-谷氨酰胺 4500mg/ml葡萄糖 ) 1%雙抗(1000units /L penicillin 1000mg/L streptomycin) 37℃ 5%CO2,無菌技術,制定好實驗計劃和操作程序（準備好實驗過程中的一切用品） 洗手和著裝（75%酒精消毒） 進入超凈臺中的所有物品均需消毒 操作野消毒,細胞培養(yǎng)耗材,HEK293細胞的傳代,待細胞的融合率達到90%時進行傳代。 棄去舊細胞液 4℃遇冷的DPBS（不含Ca2+ 、Mg2+）4ml沖洗后棄液 加入0.05%（37 ℃預溫 ）胰酶消化 加入12ml完全培養(yǎng)基（37 ℃預溫 ）將細胞從細胞瓶底部沖下 1:4傳代即取3ml細胞懸液加入有9ml完全培養(yǎng)基的新細胞瓶中 放入37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng),,,,,,HEK293細胞的傳代,加入0.05%胰酶消化,HEK293細胞的傳代,,HEK293細胞的凍存,隨著傳代的次數(shù)增加，293細胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降，出現(xiàn)突變等。所以要在細胞購進時就進行大量凍存，以保證實驗的穩(wěn)定性和持續(xù)性。 在細胞對數(shù)生長期進行凍存，增加細胞復蘇成活率。 原則：慢凍,HEK293細胞的凍存,凍存前的準備 DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)：試驗前置室溫下。 0.05%的胰酶消化液：37℃預溫。 程序凍存盒（加250ml異丙醇）、二甲基亞砜(DMSO)、2ml細胞凍存管（標記細胞名稱、代數(shù)、日期）、DPBS（不含鈣鎂）,HEK293細胞的凍存,凍存前的準備,HEK293細胞凍存步驟,配制細胞凍存液 取50ml無菌離心管，于超凈臺內，加入適量DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，再逐滴加入二甲基亞砜(DMSO)至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置室溫下待用。,HEK293細胞凍存步驟,,取準備凍存的細胞，棄去培養(yǎng)基，以DPBS2-3ml洗細胞一次,加入0.5-1.0ml 0.05%的胰酶消化,加入新鮮培養(yǎng)基10-12ml吹打成細胞懸液,收集細胞懸液至50ml無菌離心管，1000rpm，5min離心.棄上清，加入適量培養(yǎng)基,取與細胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細胞懸液，DMSO最后濃度為10%,HEK293細胞凍存步驟,,細胞濃度為1～5×106cells/ml（細胞計數(shù)），分裝于已標示完全之細胞凍存管中,將細胞凍存管放入程序凍存盒中（已加250ml異丙醇），置-80℃超低溫冰箱,第二天將細胞放入液氮灌，并記錄,HEK293細胞凍存步驟,細胞凍存的注意事項 欲冷凍保存之細胞應在生長良好且存活率高之狀態(tài) 冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色，以小體積分裝，4℃避光保存 低溫損傷主要發(fā)生在0℃～-60℃這一溫度區(qū)內，這一溫度范圍內不宜過久,HEK293細胞的復蘇,當細胞傳代次數(shù)過多(超過50代)，細胞狀態(tài)變差時或細胞出現(xiàn)污染事故時，需要丟棄并對開始凍存的細胞進行復蘇 原則：快復,HEK293細胞的復蘇,復蘇前的準備 DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)：試驗前置室溫下 將水浴鍋預熱至37℃ 取新培養(yǎng)瓶（75cm2），標記細胞編號、時間，加入10ml DMEM培養(yǎng)基(37℃預熱)，潤濕底面,HEK293細胞復蘇步驟,,根據(jù)凍存記錄從液氮灌中取出凍存的細胞,迅速投入已經預熱至37 ℃的水浴鍋中，并快速晃動，在1-2 min內使完全融化,用酒精擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內，有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶,輕輕混勻，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日換液,細胞培養(yǎng)的常見問題與解決方案,一、細胞培養(yǎng)污染問題 二、何時須更換培養(yǎng)基 三、可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基 四、細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應馬上去除DMSO,細胞污染問題與解決方案,細胞污染 細胞培養(yǎng)中最大的敵人污染 包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成份和造成細胞不純的異物（真菌、細菌、病毒和支原體）、化學物質及細胞,細胞污染問題與解決方案,細胞污染的原因 無菌操作技術不當 操作室環(huán)境不佳 培養(yǎng)基或者血清的污染,細胞污染問題與解決方案,細胞的細菌污染 最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以。革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、假單胞菌等。其中又以白色葡萄球菌較常見。 細菌污染后，會很快出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有少數(shù)培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。,細胞污染問題與解決方案,細胞的細菌污染檢測 16S RNA PCR法,細胞污染問題與解決方案,,,,常見的細菌污染,,白色鏈球菌污染以及革蘭氏染色圖片,細胞污染問題與解決方案,細胞的真菌污染 梅雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染。污染培養(yǎng)細胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。 真菌污染后，霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。,細胞污染問題與解決方案,細胞的真菌污染檢測 鏡檢有絲狀物,細胞污染問題與解決方案,,,,常見的真菌污染,,真菌污染,霉菌污染,細胞污染問題與解決方案,細胞的支原體污染 細胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率達到63%，因而細胞培養(yǎng)過程中被支原體污染是一個世界性的難題 細胞被支原體污染后，細胞內的DNA、RNA及蛋白表達發(fā)生改變，而細胞的生長率一般并未發(fā)生顯著的影響，因而細胞被支原體污染一般難以察覺。,細胞污染問題與解決方案,細胞的支原體污染檢測 試劑盒檢測法： 目前已有專門做支原體檢測的試劑盒，可以用細胞滴片進行檢測 間接免疫熒光法和免疫印跡：簡便、快速、特異性,細胞污染問題與解決方案,,,,常見的支原體污染,,支原體污染的電鏡下圖片,細胞污染問題與解決方案,細胞污染的解決方法 控制環(huán)境污染；嚴格實驗操作 原則上棄掉 加抗生素 污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。,細胞污染問題與解決方案,細胞污染的解決方法 加抗生素,細胞污染問題與解決方案,何時需更換細胞液 視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可,何時需更換細胞液 視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可,細胞污染問題與解決方案,可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基 不能，每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活,細胞污染問題與解決方案,細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應馬上去除DMSO 除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。,細胞間的操作注意事項,未經許可，任何人不得進入細胞間。 不得在細胞間內做任何與試驗無關之事。 不得攜帶任何與實驗無關或可能導致污染的物品進入細胞間。 必須隨時保持細胞間的整潔、衛(wèi)生，及時清理雜物、垃圾。 所有設備、物品，使用后必須及時歸位。 進入細胞間必須更換細胞間專用拖鞋與工作服。不得將細胞間專用拖鞋與工作服傳出細胞間外。 進入細胞間必須養(yǎng)成隨手關門習慣。操作期間，細胞間外門和中門必須處于關閉狀態(tài)。,www.themegallery.com,LOGO,細胞間的操作注意事項,操凈工作臺實驗前和試驗后的滅菌，打開紫外燈15-20分鐘。 試驗操作期間，應戴手套。并注意隨時用75%酒精消毒雙手。 實驗操作期間，操凈工作臺的風機應處于打開狀態(tài)。操作結束后，關閉擋板、關閉風機。 凡是帶入操凈工作臺內的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶等到額瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面。 使用倒置顯微鏡前，用75%酒精擦拭消毒載物臺 使用二氧化碳培養(yǎng)箱時，應盡量縮短開門時間，減少開門次數(shù)。 每次倒置顯微鏡觀察細胞后，用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當旋松瓶蓋，再放入放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。,www.themegallery.com,LOGO,細胞間的操作注意事項,每一個人操作結束后，必須及時清理操凈工作臺內的物品，不得在工作臺內留置或堆積雜物。 清理操凈工作臺后，用75%酒精擦拭消毒操凈工作臺面。 每一個操作結束后，必須及使用84消毒液消毒管道，并清理廢液瓶，及時棄去廢液。 操作結束后，確認倒置顯微鏡電源關閉。 操作結束后，確認二氧化碳培養(yǎng)箱的兩道門均處于關閉狀態(tài)。 離開細胞間前，確認空調已關閉（夏季高溫季節(jié)除外）。 每日最后一人離開細胞間前，打開紫外燈消毒。 進入或離開細胞間時，注意觀察二氧化碳鋼瓶上的壓力表壓力是否正常（減壓閥出氣口的壓力應在0.06-0.08Mpa之間）。 注意定期檢查液氮罐內液氮量，及時添加。 定期打掃細胞間：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、操凈工作臺等，然后用3‰蘇爾或者新潔爾滅或者5%過氧乙酸擦拭,Thank You !,