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細(xì)胞周期調(diào)控 cell cycle regulation,1,細(xì)胞增殖周期，簡稱細(xì)胞周期(cell cycle)，是指連續(xù)分裂的細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束開始到下一次有絲分裂結(jié)束為止所經(jīng)歷的整個序列過程。這個過程所需要的時間稱為細(xì)胞周期時間。,2,,,細(xì)胞周期,3,細(xì)胞周期周而復(fù)始地進(jìn)行著，這種周期性的重復(fù)過程受到嚴(yán)格地控制，使得不同的細(xì)胞周期事件在空間和時間上相互協(xié)調(diào)。,4,內(nèi)容提要,,研究背景 細(xì)胞周期的檢驗點 細(xì)胞周期蛋白 CDK及其調(diào)控 生長因子、癌基因和抑癌基因 細(xì)胞周期與腫瘤,5,一、研究背景 1.MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用 1960年，Masui和Markert研究爪蟾卵母細(xì)胞，提出了成熟卵母細(xì)胞中存在一種促成熟因子（maturation promoting factor，MPF）。 Rao和Johnson(1970、1972、1974) 以Hela細(xì)胞為材料，發(fā)現(xiàn)M期細(xì)胞具有某種促進(jìn)間期細(xì)胞進(jìn)行分裂的因子，即促細(xì)胞分裂因子(mitosis- promoting factor ，MPF)。,6,2.cdc基因 Leland Hartwell、 Paul Nurse分別以不同的酵母為實驗材料，發(fā)現(xiàn)了許多與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因(cell division cycle gene，CDC)。如芽殖酵母的cdc28、裂殖酵母cdc2基因。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：P34cdc2與P34cdc28是同源物，二者本身并不具有激酶活性，只有當(dāng)其與有關(guān)蛋白結(jié)合后，其激酶活性才能夠表現(xiàn)出來。例如：P34cdc2必須與另一種蛋白P56cdc13結(jié)合后才具有激酶活性。,7,3.cyclin 1983年Timothy Hunt首次發(fā)現(xiàn)海膽卵受精后，在其卵裂過程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期劇烈振蕩，在每一輪間期開始合成，G2/M時達(dá)到高峰，M結(jié)束后突然消失，在下一個周期中又重復(fù)這一消長現(xiàn)象，故命名為周期素或周期蛋白(cyclin)。隨后cyclin很快被分離和克隆出來，證明其廣泛存在于從酵母到人類等各種真核生物中，而且在功能上存在互補性。,8,4. MPF － P34cdc2－Cyclin ？？ 1988年M. J. Lohka 純化了爪蟾的MPF，經(jīng)鑒定由34KD和45KD兩種蛋白組成，二者結(jié)合可使多種蛋白質(zhì)磷酸化。 1990 Paul Nurse進(jìn)一步的實驗證明P34實際上是P34cdc2的同源物，P45是cyclinB的同源物，而且，對于P34cdc2的活性而言，cyclin是必需的。從而將細(xì)胞周期三個領(lǐng)域的研究聯(lián)系在一起。,9,,“for their discoveries of key regulators of the cell cycle“,Leland Hartwell,Timothy Hunt,Paul Nurse,,10,二、細(xì)胞周期的檢驗點 1989年，Hartwell通過構(gòu)建酵母細(xì)胞突變模型證實了細(xì)胞周期檢驗點（check point）的存在，并首次提出檢驗點的概念。細(xì)胞周期的運行，是在一系列檢驗點的嚴(yán)格檢控下進(jìn)行的，它保證前一個事件完成之后，才啟動下一個事件，檢查點是細(xì)胞的錯誤監(jiān)測機制。,11,G1/S檢驗點：在酵母中稱start點，在哺乳動物中稱R點(restriction point)，控制細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)的G1進(jìn)入DNA合成期，相關(guān)的事件包括：DNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？ S期檢驗點：DNA復(fù)制是否完成？,12,G2/M檢驗點：是決定細(xì)胞一分為二的控制點，相關(guān)的事件包括： 所有DNA都正確復(fù)制了嗎？DNA是否有損傷？細(xì)胞體積是否足夠大？ 中-后期檢驗點（紡錘體組裝檢驗點）：所有染色體都排列在紡錘體上了嗎？任何一個著絲點沒有正確連接到紡錘體上，引起細(xì)胞周期中斷。,,13,三、細(xì)胞周期蛋白 cyclin 的種類繁多，目前從芽殖酵母、裂殖酵母和各類動物中分離出的周期蛋白有30余種，在脊椎動物中為A1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。分別參與細(xì)胞周期中不同時相的調(diào)節(jié)。分為G1型、G1/S型S型和M型4類。,14,,,人類細(xì)胞周期蛋白線性結(jié)構(gòu)示意圖 實心方框代表“cyclin box ”， 方框代表“destruction box” 圓形框代表PEST序列,15,cyclin box：各類周期蛋白均含有一段約100個氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白盒(cyclin box)，介導(dǎo)周期蛋白與CDK(cyclin–dependent kinase)結(jié)合。,Cyclin也含有降解盒（destruction box）或PEST（脯氨酸－谷氨酸－絲氨酸－蘇氨酸）序列，它可以通過定時降解或恒定地迅速周轉(zhuǎn)來調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)的水平，起著CDK的調(diào)節(jié)亞基的作用。,16,G1期：細(xì)胞在生長因子的刺激下，G1期cyclin D表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，磷酸化的Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄。,17,Cyclin D與CDK結(jié)合使Rb釋放結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F,,18,G1/S期：cyclinE與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S限制點而進(jìn)入S期。向細(xì)胞內(nèi)注射CyclinE的抗體能使細(xì)胞停滯于G1期，說明細(xì)胞進(jìn)入S期需要CyclinE的參與。,S期：將CyclinA的抗體注射到細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn) 能抑制細(xì)胞的DNA合成，推測CyclinA是DNA復(fù) 制所必需的。,19,G2/M期：cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1使底物蛋白磷酸化,如將組蛋白H1磷酸化導(dǎo)致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體等下游細(xì)胞周期事件。,20,M期：在分裂中期當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時，通過一種未知的途徑，激活后期促進(jìn)因子APC (anaphase promoting complex) ，負(fù)責(zé)將泛素連接在cyclinB上，導(dǎo)致cyclinB被蛋白酶體（proteasome）降解，完成一個細(xì)胞周期。,21,哺乳動物細(xì)胞周期中各時相不同cyclin的作用,,,22,四、CDK及其調(diào)控 CDK即細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 (cyclin–dependent kinase,CDK)，控制著細(xì)胞周期各期之間的順序轉(zhuǎn)換。CDK是一組相關(guān)聯(lián)的Ser/Thr蛋白激酶， 酵母中細(xì)胞周期的進(jìn)程主要由單一的CDK（P34cdc2/ cdc28）所控制。多細(xì)胞生物中，細(xì)胞周期各期之間的轉(zhuǎn)換需要不同的CDK。,23,脊椎動物的CDK,* P35，P36的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞周期蛋白無相似性,24,1．Cyclin的結(jié)合是CDK激活的第一步 CDK活性的最初調(diào)節(jié)者是cyclin亞單位。 Cyclin與相應(yīng)的CDK結(jié)合后，引起CDK空間構(gòu)象改變，暴露其催化亞基。各種細(xì)胞周期蛋白程序化的合成和降解保證各對應(yīng)CDK適時的活化，維持細(xì)胞周期的正確時序。,25,2．CDK的磷酸化與去磷酸化 以P34cdc2 (CDK1)為例，如果對P34cdc2磷酸化作用位點不同，則對該酶的活性分別產(chǎn)生正向和負(fù)向的控制。完整的P34cdc2-cyclin復(fù)合物需要磷酸化才能被激活，驅(qū)動細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂。,26,P34cdc2的Thr14和Tyr15的磷酸化引起P34cdc2-cyclin復(fù)合物的失活，Weel是催化Tyr15磷酸化的激酶，另有一個是Thr14磷酸化的激酶；催化Thr14及Tyr15 脫磷酸化的蛋白磷酸酶為雙特異性磷酸酶Cdc25蛋白。,27,P34cdc2的Thr161的磷酸化是酶的活性所必需的。CDKs活化激酶CAK（CDKs activiting kinase）應(yīng)答Thr161的磷酸化，這是另一種蛋白激酶CDK7-Cyclin H復(fù)合物。當(dāng)磷酸酶-1將此位點的磷酸水解，P34cdc2又失去激酶活性。,28,3．CDK抑制劑的作用 除了磷酸化／去磷酸化可以調(diào)節(jié)MPF活性外，另有一類CDK抑制因子（CDC kinase inhibitor,CKI）可與CDK結(jié)合抑制其活性。,29,（1）Ink4(Inhibitor of cdk 4) 如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，專一地與CDK4、CDK6結(jié)合，阻止CDK和cyclinD的結(jié)合。使細(xì)胞周期不能從G1期的調(diào)控點進(jìn)入到下一個時相。,30,（2）Cip/Kip 包括P21cip1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2等，能與多種cyclin - CDK復(fù)合物包括cyclinE–CDK2、cyclinD–CDK6、cyclinD–CDK4結(jié)合，抑制cyclin - CDK復(fù)合物的蛋白激酶活性，使一些細(xì)胞增殖所需要的蛋白質(zhì)磷酸化受阻，細(xì)胞停留在G1期。,31,此外P21cip1還可與DNA聚合酶δ亞單位PCNA (proliferating cell nuclear antigen, PCNA )相互作用， 抑制DNA復(fù)制，但不影響DNA修復(fù)。,32,CDK1的激活需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Tyr161的磷酸化,,33,五、生長因子、癌基因和抑癌基因 1．生長因子 生長因子是促細(xì)胞周期運行的重要因子。RTK-Ras-MAPK信號傳遞途徑是細(xì)胞外的信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)最基本的途徑。,34,2．癌基因 原癌基因被激活，其編碼蛋白大量表達(dá)，這些蛋白對細(xì)胞周期具有促進(jìn)作用。,35,癌基因的主要類型及其表達(dá)產(chǎn)物,36,3．抑癌基因 抑癌基因可抑制細(xì)胞周期于靜止期，并使DNA復(fù)制不完全或損傷的細(xì)胞不能進(jìn)入分裂期，避免細(xì)胞的癌變。,37,（1）P53 一般情況下，細(xì)胞中很少有P53蛋白。DNA損傷會引起P53蛋白濃度和活性的提高。P53蛋白可同P21基因調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合，激活P21基因轉(zhuǎn)錄。使細(xì)胞停滯在G1期的調(diào)控點處不能進(jìn)入S期。這樣，即可有足夠的時間修復(fù)DNA。,38,,39,P53蛋白可促進(jìn)GADD45基因（growth arrest and DNA damage inducible gene）表達(dá)生成GADD45蛋白，后者與CDK及PCNA形成的復(fù)合物，參與DNA損傷的修復(fù)。 當(dāng)DNA損傷不能修復(fù)時，p53基因的過量表達(dá)導(dǎo)致P34cdc2的過早激活，結(jié)果使核膜破裂，引起細(xì)胞凋亡。,40,（2）Rb Rb基因位于人染色體13q14，由27個外顯子構(gòu)成，分布在總長180-200kb以上的DNA片段上。Rb基因轉(zhuǎn)錄的mRNA大小為4.7 kb，編碼一個分子量為105kD的蛋白質(zhì)，由928個氨基酸殘基構(gòu)成，定位于細(xì)胞核內(nèi)，是多種cyclin-CDK的底物，具有多個被磷酸化的位點。,41,Rb有高、低磷酸化兩種狀態(tài)。低磷酸化的Rb蛋白可與一些轉(zhuǎn)錄因子如E2F結(jié)合，抑制這些轉(zhuǎn)錄因子的活性，阻止細(xì)胞的生長。而高磷酸化狀態(tài)則失去這種功能，使E2F游離，進(jìn)入核內(nèi)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)行。,42,Rb在細(xì)胞周期內(nèi)的磷酸化,,,43,六、細(xì)胞周期與腫瘤,腫瘤細(xì)胞最顯著的特點是生長失控和幼稚化（即不分化）。,44,（一）腫瘤細(xì)胞周期失控的分子基礎(chǔ) 1．細(xì)胞周期蛋白異常,G1cyclin基因突變、重排，使這些cyclin異常表達(dá)，從而使細(xì)胞通過G1期，進(jìn)入S期，細(xì)胞即自發(fā)增殖，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化特征。許多人類腫瘤中，均發(fā)現(xiàn)有cyclin D1基因的擴增。,45,B型肝炎病毒（hepatitis B virus ,HVB）感染人體后成為導(dǎo)致肝癌的因素之一，有研究發(fā)現(xiàn)，HVB基因組整合入cyclinA基因的一個內(nèi)含子中，產(chǎn)生異常、過量表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物。和正常的cyclinA相比，它缺少N端的“destruction box”，逃脫了對它的降解，大量異常的cyclinA刺激細(xì)胞增殖。,46,2．CDK和CKI基因的突變 研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞CDK的水平一般較高，而CKI基因常見純合性缺失突變，細(xì)胞內(nèi)缺少CKI，或CKI抑制CDK功能的喪失。,47,3．抑癌基因突變 不少癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Rb或P53基因發(fā)生了突變，使Rb失去了阻斷mRNA轉(zhuǎn)錄，P53失去了使細(xì)胞休止在G1后期的功能，造成細(xì)胞周期失控。,48,（二）細(xì)胞周期與腫瘤的基因治療 1．抑制G1期cyclins的過度表達(dá) G1期cyclins反義核酸，在體外和裸鼠體內(nèi)都可抑制肺癌的增殖。反義DNA可以與基因結(jié)合而阻止基因的轉(zhuǎn)錄，反義的RNA可與mRNA結(jié)合，而抑制其翻譯，都可以達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。 RNA干擾(RNA interference ，RNAi )是將雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)引起特異基因的mRNA降解的一種細(xì)胞反應(yīng)過程。屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默的一種。,49,2．促使腫瘤細(xì)胞表達(dá)正常的CKIs 有報道用正常的P16、P21、P27基因與腺病毒載體重組，將重組的腺病毒導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，重組的腺病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)有功能的P16、P21和P27蛋白，抑制CDKs的活性，使腫瘤細(xì)胞停止在G0～G1，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。,50,3．抑制E2F的活性 把對E2F有高度親和性的雙鏈DNA片段導(dǎo)入細(xì)胞，該DNA能夠結(jié)合游離狀態(tài)的E2F生成一種復(fù)合物，復(fù)合物中的E2F不再與有關(guān)基因的啟動子結(jié)合，從而阻斷這些基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞增生。,51,思考題,名詞： cyclin box、R點 問答： 1.簡述細(xì)胞周期各時相cyclin的種類及作用。 2.簡述細(xì)胞周期的主要檢驗點（check point）及功能。,52,,非洲爪蟾卵細(xì)胞發(fā)育過程分為六個階段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期。前四個時期為卵母細(xì)胞生成和生長階段。其中第Ⅳ期時細(xì)胞核較大，稱為生發(fā)泡(germinal vesicle,GV)，此時細(xì)胞就停留在該時期，等待成熟。,53,,實驗表明：成熟卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中必然有一種物質(zhì)，可以誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟，稱之為促成熟因子（maturation promoting factor，MPF）。,54,,G1期PCC為單線狀，因DNA未復(fù)制。 S期PCC為粉末狀，因DNA由多個部位開始復(fù)制。 G2期PCC為雙線染色體，說明DNA復(fù)制已完成。,與M期細(xì)胞融合的間期細(xì)胞產(chǎn)生了形態(tài)各異的早熟凝集染色體(prematurely condensed chromosome，PCC)，這種現(xiàn)象叫做早熟染色體凝集(premature chromosome condensation),55,,人M期細(xì)胞與袋鼠（Ptk）G1、S、G2期細(xì)胞融合誘導(dǎo)PCC,不僅同類M期細(xì)胞可以誘導(dǎo)PCC，不同類的M期細(xì)胞也可以誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生。,,56,芽殖酵母及其細(xì)胞周期,,L.Hartwell在芽殖酵母中發(fā)現(xiàn)cdc28基因的表達(dá)產(chǎn)物是一種相對分子量為34KD的蛋白，被稱為P34cdc28，它是一種蛋白激酶，在G2/M轉(zhuǎn)換過程中起中心調(diào)節(jié)作用。,57,裂殖酵母及其細(xì)胞周期,,P.Nurse在裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)cdc2基因的表達(dá)產(chǎn)物也是一種相對分子量為34KD的蛋白，被稱為P34cdc2,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，P34cdc2具有激酶活性，可使多種蛋白底物磷酸化，在裂殖酵母周期調(diào)控中起關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。,58,,,59,,,60,,,61,