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項目名稱： 木質纖維素資源高效生物降解轉化中的關鍵科學問題研究首席科學家： 曲音波 山東大學起止年限： 2011.1 至 2015.8依托部門： 教育部 山東省科技廳二、預期目標總體目標：提出 3-5 套新的木質纖維素類生物質生物轉化液體燃料和化學品的生物煉制技術方案，培養(yǎng)一支高水平的基礎研究和技術開發(fā)隊伍，最終為在我國建立大規(guī)模利用木質纖維素資源轉化液體燃料和大宗化學品的新型工業(yè)體系，實現(xiàn)社會經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展提供理論與技術基礎。五年預期目標：1）通過闡述植物生物質抗生物降解的組成和結構特征，建立起改造纖維生物質組成和結構以提高降解效率的理論體系；解析預處理技術對提高纖維生物質降解性的結構基礎，提出高效、經(jīng)濟和實用的預處理技術方案；2）研究微生物對天然或預處理后底物的降解機理，特別是纖維素解聚機理、去結晶化途徑以及提高纖維素酶的持續(xù)化降解能力的途徑等，探討采用現(xiàn)代系統(tǒng)生物技術，從復雜纖維質降解多酶體系中，篩選和發(fā)現(xiàn)新的高效、耐逆、適合工業(yè)要求的纖維質降解酶類；為降解不同的木質纖維素資源研制出低成本且高效的復合酶系；3）選育適于轉化纖維質糖分為平臺化合物的微生物，研究其代謝調控機理與機制，指導構建高效代謝工程菌，研究定向轉化平臺化合物的過程及相關產(chǎn)品的利用途徑；進而通過對預處理、產(chǎn)酶、酶解和發(fā)酵的反應動力學、工程學和方法論的研究，將預處理技術、生物反應與分離過程耦合起來，提出新的生物煉制技術方案。4）從木質纖維素生物降解轉化角度，構建纖維素降解和糖轉化利用的數(shù)據(jù)庫，其中包括木質纖維素原料組成與結構特征、纖維素降解微生物類群與特性、纖維素酶、半纖維素酶和木素酶及復合酶系，新型糖代謝的功能微生物等，建立專門的信息共享平臺和網(wǎng)站，為實現(xiàn)大規(guī)模降解轉化木質纖維素資源提供理論、技術和信息支撐。五年的可考核指標: 提出 2-3 種新的高效、低能耗、少抑制物的預處理方案；篩選到 5-10 種新的關鍵酶或非酶降解因子，構建出高效的纖維素降解酶系，使酶解轉化率大于 90%；使噸乙醇用酶成本從 2000 元以上降到 800 元以下；構建出能全糖共利用、表達纖維降解相關酶組分的統(tǒng)合生物加工工程菌株3-5 株，發(fā)酵性能達到國際先進水平；綜合前述進展，設計出多技術集成、全組分利用、多產(chǎn)品選擇、經(jīng)濟上有競爭力的木質纖維素生物煉制技術路線 3-5 條；發(fā)表相關研究論文 200 篇以上，包括 SCI 影響因子超過 5 的論文 5-10 篇，總影響因子超過 300；三、研究方案1）學術思路： 以研究植物木質纖維素類生物質對生物降解的抗性屏障及其破解之道為核心，深入研究微生物的多種多樣的降解天然纖維的策略，探索人類干預生物降解過程，認識降解產(chǎn)物的復雜性，提高其降解轉化效率，實現(xiàn)全部降解糖類的代謝轉化，使之轉而為人類可持續(xù)發(fā)展服務的可能途徑。該學術思想可以用下圖簡示：2）技術途徑： 以植物有效防止微生物及酶降解的抗性屏障為切入點，從宏觀（細胞） 、微觀（大分子）層次分析納米級生物催化劑在降解過程效率低下的原因出發(fā)，植物的防御屏障? 纖維素結晶結構? 多種高分子聚集? 細胞壁分層構造微生物的破解策略? 單酶組分分解反應? 游離復合多酶體系? 多酶組分協(xié)同作用? 固定多酶組合構造? 生物之間協(xié)同作用物理化學措施（預處理技術）? 蒸汽爆碎? 酸堿處理? 有機溶劑? 綜合法預處理?生物學措施? 新降解因子發(fā)現(xiàn)? 酶分子設計改造? 復合酶系的重構? 微生物代謝工程工程技術措施? 單一過程優(yōu)化? 復合過程集成? 綜合評價標準? 精煉方案設計研究可能的物理化學預處理途徑，使之有利于納米級酶分子的作用（擴散、持續(xù)性降解與酶分子協(xié)同作用） ，同時，加強對微生物降解機理及其多樣性、酶系組分協(xié)同作用及其合成調控機理的研究，對微生物酶分子和復合酶系進行定向進化或理性改造，加強對纖維降解糖類代謝網(wǎng)絡的研究和代謝（進化）工程菌的構建研究，進而將一系列的工程技術手段集成起來，建立起高效的復合生物煉制轉化系統(tǒng)?？偟募夹g途徑可以用下圖表示：天然超分子結構分析抗降解性研究預處理樣品結構分析酶解過程構效關系 酶系重構研究降解機理研究代謝工程改造代謝網(wǎng)絡分析糖化、發(fā)酵工程 技術研究酶系合成調控研究天然植物生物質預處理的木質纖維素材料纖維水解糖過程耦合集成代謝工程菌株纖維降解酶非酶降解因子高效降解酶系纖維素降解微生物發(fā)酵微生物燃料與化學品3) 創(chuàng)新點與特色： （1）提出木質纖維素的抗降解性是生物質難以高效轉化的核心問題，從納米尺度和生物降解角度來研究木質纖維素超分子結構；（2）深入研究生物質的微生物降解的多樣性，尋找新的生物降解因子，設計出高效的復合生物催化劑；（3）使用分子生物學改造相關的產(chǎn)酶和發(fā)酵微生物，設計和構建工程微生物，實現(xiàn)全糖定向生物轉化為生物基產(chǎn)品，并使應用生物轉化過程的成本及投資明顯降低；（4）完成木質纖維素類生物質生物轉化技術的優(yōu)化、耦合和系統(tǒng)集成，為生物質綜合生物煉制產(chǎn)業(yè)的建立構建理論和實踐基礎。課題設置課題 1、植物生物質抗生物降解屏障解析與破解途徑探索研究內容：1. 植物纖維類生物質抗降解屏障的定量解析高通量、快速纖維生物質結構和組成分析。利用近紅外（NIR）結合 GC-MS細胞壁組份分析等技術建立高通量分析、快速測定生物質結構和化學組成的技術，為明確生物質結構和組成與纖維生物質降解轉化之間的關系以及鑒定經(jīng)分子改良的優(yōu)良品系提供便捷的分析手段。2. 植物細胞壁生物質特性與降解轉化效率的關系建立表征細胞壁超分子組成與結構的方法，測定木質纖維素生物質轉化過程中基本的物理化學限制因子；利用木素酶、半纖維素酶、纖維素酶等處理，研究細胞壁超分子結構中不同組分的構效關系；基于木質纖維素超分子結構研究纖維素酶催化過程的定量構效關系，與酶分子催化動力學過程，基于定向進化、定點突變等新技術提高酶組分的活力。3．預處理過程中降解屏障的解構過程及其優(yōu)化研究預處理技術對降解屏障的影響，建立高效打開酶分子通道的可行方案?？疾觳煌A處理條件下的底物成分變化（如纖維素、半纖維素、木素含量變化）和結構變化（纖維素結晶度、聚合度變化）以及對可降解性能的影響。探討預處理過程中發(fā)酵抑制物的生成動力學。經(jīng)費比例：15%承擔單位：中國科學院過程工程研究所、山東大學課題負責人：陳洪章學術骨干：趙建、王祿山、邱衛(wèi)華課題 2、木質纖維素生物降解多樣性、新降解因子及相關機理研究內容：1. 結晶纖維素結構解聚的分子機理及相關生物因子的分離鑒定與特征化在生化分離分析的基礎上，通過對特定菌種或群落的不同酶活組分及非酶組分的組合配比，借助蛋白質組學定性和定量分析鑒定技術，分離鑒定能提高木質纖維素協(xié)同酶解活性的關鍵組分；結合底物超微結構觀察及酶分子吸附模擬，深入研究闡述酶分子在木質纖維素高效酶解過程中的作用機制。2. 天然纖維素降解的多樣性分析2.1 天然生境纖維素降解微生物群系分析。2.2 分離新型纖維素降解微生物。2.3 用比較基因組學技術探尋新的降解策略。3. 新纖維素降解酶和降解因子的發(fā)現(xiàn) 分析新生物降解因子參與纖維素降解或解聚作用的模式與相關機理。分析特定環(huán)境高效酶解體系的多樣性與結構組成，從中尋找能促進提高現(xiàn)有酶系催化水解效率的新酶、非酶蛋白質或非蛋白因子，并獲得新酶或非酶蛋白因子的克隆表達；在深入研究闡述這些新降解因子在特殊環(huán)境中木質纖維素高效酶解過程中作用機制的基礎上，從中篩選和發(fā)現(xiàn)新的高效、耐逆、適合工業(yè)要求的促纖維質降解因子。經(jīng)費比例：15%承擔單位：中國科學院微生物研究所、山東大學課題負責人：董志揚學術骨干：陳冠軍、劉巍峰、盧雪梅、倪金 鳳課題 3、真菌游離酶系纖維素降解機理、酶系合成調控與高效酶系重構研究內容：1. 真菌纖維素酶合成代謝調控分子機制研究在基本完成了對斜臥青霉原始菌株和抗降解物阻遏的工業(yè)高產(chǎn)纖維素酶突變株的全基因組測序的基礎上，采用高通量基因組測序、數(shù)字化全基因組表達譜分析、熒光差異蛋白表達分析、RNA 沉默、酵母雙雜交等先進技術，通過比較基因組學、轉錄組學和蛋白質組學等方法，鑒定出關鍵節(jié)點基因/蛋白及其在纖維素酶表達調控網(wǎng)絡中的位置和功能；并利用高效轉化和基因評價體系對候選基因進行快速功能驗證和評價，解析哪些基因或通路的改變導致了表型（高產(chǎn)纖維素酶突變、抗降解物阻遏）的變化，從而闡明纖維素酶合成的誘導機制、阻遏機理和高產(chǎn)纖維素酶突變的分子基礎，為進一步提高菌株產(chǎn)酶能力和改進酶系組成提供指導。2.真菌木質纖維素降解復合酶各組分間的協(xié)同作用構建纖維素酶、半纖維素酶和最佳酶系的組成和比例以及纖維素材料物理化學性質的數(shù)據(jù)庫，為降解不同的木質纖維素資源調制低成本且高效的復合酶系提供理論依據(jù)。分離鑒定能提高木質纖維素協(xié)同酶解活性的關鍵組分，構建特定環(huán)境高效酶解體系的結構組成及其相互作用模式，提高纖維素酶各組分酶協(xié)同水解效率，最大限度降低纖維素酶水解過程中產(chǎn)物反饋抑制效應。3. 真菌纖維素酶合成代謝調控的改造及纖維素酶系的優(yōu)化重構選育高分泌表達菌株；結合相關蛋白運輸分泌蛋白的轉錄表達分析，探詢纖維素酶的高分泌機制。構建纖維素酶的高效表達新系統(tǒng)，培育高效產(chǎn)酶優(yōu)良菌種。針對絲狀真菌纖維素酶合成代謝關鍵調控因子，通過嵌合體技術、基因敲除技術、RNA 干擾技術和基因過量表達技術等對真菌纖維素酶表達調控網(wǎng)絡進行人工改造，探索真菌纖維素酶整體表達水平提高及纖維素酶各組分酶表達水平的精確調控，重構具有對纖維素高效水解糖化能力的纖維素酶系，優(yōu)化纖維素酶各組分的結構。經(jīng)費比例：25%承擔單位：山東大學、中國科學院上海生命科學研究院、天津工業(yè)生物技術研究所課題負責人：曲音波學術骨干：田朝光、方詡、汪天虹、嚴興、 張磊課題 4、細菌酶復合體纖維素降解轉化機理和纖維小體的解析、重構研究內容：1. 高溫厭氧纖維素降解細菌及纖維小體的篩選和多樣性研究1.1 從極端環(huán)境中篩選和構建厭氧纖維素降解菌群，建立不可培養(yǎng)微生物篩選手段，發(fā)掘高溫厭氧纖維素高效降解細菌，結合 16S rRNA 基因分析，研究不可培養(yǎng)微生物的篩選策略；1.2 運用高通量基因組測序技術，從高效纖維素降解群落中通過宏基因組分析獲取關鍵基因信息。分析包括不可純培養(yǎng)細菌在內的高溫厭氧纖維素降解細菌群落中纖維素降解相關基因的分布、豐度、可能的協(xié)作及進化關系。通過蛋白質組學分析，結合生理生化驗證，研究纖維素降解復合體，尤其是纖維小體的組成及多樣性。結合微生物篩選以及酶活力驗證，獲得新的纖維素降解關鍵基因及輔助因子。2. 纖維小體的解析、體外重構、性能改良2.1 研究高效纖維素降解菌株的纖維小體的組成成分，分析各成員在空間上的排列及蛋白－蛋白相互作用，解析酶在空間上的集群與功能上的相互配合對結晶纖維素降解效率的影響。對關鍵蛋白或復合體進行三維結構解析，從分子水平分析結構與功能關系。2.2 體外重構纖維小體。進一步了解及驗證纖維小體的結構、功能及其裝配機制，為其性狀改良奠定必要的理論基礎。對纖維小體骨架蛋白進行優(yōu)化設計、表達；同時利用功能基因組學和蛋白質組學的方法，對纖維小體關鍵酶進行篩選并重組表達，在此基礎上體外構建人工纖維小體，并進行性狀鑒定。2.3 對纖維小體進行性能改良：廣泛篩選各種互補性酶組分， 在底物特異性、抗逆性、催化活性、功能互補性等方面尋求最佳酶組合，充分發(fā)揮纖維小體固有的協(xié)同效應。對關鍵酶進行理性設計或定向進化改造，以期提高對預處理過程產(chǎn)生的抑制物的抗逆性，拓寬底物譜，解除產(chǎn)物抑制，最終提高重構纖維小體的總體木質纖維素降解效率。最后通過設計緊湊型微型纖維小體，降低體外重組纖維小體的難度，以期減少酶生產(chǎn)成本，最終達到實用化。3.纖維小體的合成代謝調控機制及 CBP 乙醇生產(chǎn)技術路線的設計及改造3.1 對中高溫產(chǎn)纖維小體模式菌株，包括 C. thermocellum 和 C. cellulolyticum，進行轉錄組學分析分析，比較菌株在含有纖維素或者其它碳源培養(yǎng)基中基因的表達情況，通過蛋白質組分析纖維小體的組成變化，根據(jù)這些組學數(shù)據(jù)，研究嗜熱厭氧菌纖維小體在功能上的進化、表達和調控機理。3.2 對模式菌株熱纖梭菌（C. thermocellum）LQR1 進行遺傳改造，設計高溫厭氧細菌混合培養(yǎng)或熱纖梭菌超級工程菌產(chǎn)乙醇的 CBP 路線。通過遺傳改造，提高纖維小體的質量和數(shù)量，敲除產(chǎn)酸代謝途徑，通過互補混合培養(yǎng)實現(xiàn)五、六碳糖共代謝，提升整體纖維素降解效率，降低生產(chǎn)成本。對纖維素生物轉化過程采取多種物理化學手段進行表征，監(jiān)測從預處理到發(fā)酵完成過程中木質纖維素原料的變化、抑制物及產(chǎn)物的表觀曲線，監(jiān)測纖維小體在發(fā)酵過程中組成成分及酶活性的變化，通過代謝流和代謝組學分析，對 CBP 發(fā)酵過程進行優(yōu)化，為實現(xiàn)木質纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化奠定基礎。4. 基于纖維小體產(chǎn)生菌生物強化的木質纖維素高效降解機理以木質纖維素發(fā)酵制氫為目標體系，研究基于中高溫產(chǎn)纖維小體梭菌 C. thermocellum 和 C. cellulolyticum 強化的木質纖維素生物降解過程，建立該降解過程與發(fā)酵制氫匹配的體系。利用微生物分子生態(tài)手段，追蹤產(chǎn)纖維小體梭菌在混合培養(yǎng)體系中的動態(tài)分布；研究纖維小體與木質纖維素的相互作用；解析纖維小體在木質纖維素轉化過程中的功能，從而解析基于纖維小體產(chǎn)生菌生物強化的木質纖維素高效降解及轉化的機理。5. 人工菌群設計實現(xiàn)木質纖維素同步糖化產(chǎn)氫以構建木質纖維素高效發(fā)酵制氫體系為目標，研究中高溫產(chǎn)纖維小體梭菌與產(chǎn)氫菌混合發(fā)酵同步糖化產(chǎn)氫過程，揭示菌群間的相互作用機制。通過人工菌群合理設計，實現(xiàn)纖維素降解菌和產(chǎn)氫菌的協(xié)同作用，研究人工菌群在糖轉化（纖維素、寡糖、二糖、己糖、戊糖） 、中間代謝中產(chǎn)物（甲酸等有機酸）的代謝流相互作用，構建人工菌群代謝網(wǎng)絡模型，解析混合菌群的關鍵代謝調控節(jié)點，特別是研究人工菌群中糖代謝對纖維素降解的解抑制及其緩釋提高產(chǎn)氫菌產(chǎn)氫得率的機理和方法。經(jīng)費比例：14%承擔單位：中國科學院青島生物能源與過程研究所、清華大學課題負責人：崔球學術骨干：邢新會、李福利、宋厚輝課題 5、纖維降解組分高效生物轉化的代謝網(wǎng)絡調控與改造研究內容：1. 微生物戊糖代謝與轉運網(wǎng)絡的解析解析相關菌株的戊糖代謝相關基因的功能與作用，解析戊糖運輸和代謝機理；考察葡萄糖和戊糖的轉運蛋白，并對其各自轉運系統(tǒng)進行研究，進一步解析葡萄糖對戊糖利用的抑制作用，研究如何解除抑制的方法，為進一步提高戊糖的利用效率提供理論支撐；開展轉錄組學分析、代謝控制分析和代謝流向分析，研究菌株的代謝途徑、代謝節(jié)點以及各種調節(jié)機制的變化，加深對戊糖代謝調控機理的認識；根據(jù)輔酶工程理念，進行分子改造或發(fā)酵工程調控，改變輔酶特異性，解決氧化還原不平衡問題；構建高效能的磷酸戊糖途徑，使木糖、阿拉伯糖等戊糖代謝的中間產(chǎn)物進入中心代謝途徑并向目標代謝產(chǎn)物轉化。2. 微生物遺傳操作體系的建立根據(jù)微生物的遺傳特性，利用基因工程技術，建立或改進其分子操作體系，為菌株的遺傳改造提供高效的技術平臺。首先，對已成熟的大腸桿菌和酵母遺傳操作體系進行改進，根據(jù) Cre/lox 位點特異性重組系統(tǒng)的特點，建立適用于酵母等工業(yè)菌株的位點特異性系統(tǒng)及規(guī)范化操作流程，以去除因分子生物學操作引入基因組中的抗性標記基因；進而建立以不同啟動強度的啟動子為基礎的能夠不同水平表達目標基因的表達體系；直接在酵母中表達 β-葡萄糖苷酶等纖維降解酶系組分。其次，對遺傳操作不成熟的放線桿菌、梭菌等，進行遺傳體系的探索與建立，為其代謝工程改造提供技術支撐。3. 利用進化或系統(tǒng)生物學技術提高相關工程菌的抗逆性能分析不同預處理條件下纖維素原料水解液中的主要毒性成分及其含量，通過現(xiàn)代分子生物學技術與經(jīng)典的微生物選育技術相結合，獲得對纖維素水解液中抑制因子的高抗性菌株。利用系統(tǒng)性擾動與高通量的分析技術（如各種組學技術） ，結合代謝網(wǎng)絡的定量調控和計算機模擬技術，對菌株抗逆性能機制進行研究。4. 大宗化學品生產(chǎn)用代謝工程菌的研究和改造4.1 構建利用纖維降解組分的工程菌，生產(chǎn)大宗平臺化合物。選擇大腸桿菌、酵母、梭菌、運動單胞菌等作為出發(fā)菌株，通過基因操作的手段，運用發(fā)酵和代謝工程的技術方法，可控制地生產(chǎn)重要平臺化合物。通過對菌體膜運輸系統(tǒng)的研究和改造，提高菌體對底物的利用能力，消除二階段生長現(xiàn)象，使其能夠同時利用纖維素水解物中的多種碳源；提高菌體的抗逆及抗不良環(huán)境（耐酸和耐抑制物）的能力；以琥珀酸、乙醇等為代表，通過異源表達和代謝阻遏提高菌體合成目標化合物的能力。4.2 建立利用纖維水解全糖組分的系統(tǒng)或者體系，并注重體系的協(xié)同效應和高值轉化利用。在大腸桿菌、運動發(fā)酵單胞菌等菌株中構建以木糖 /阿拉伯糖為唯一碳源的工程菌，并利用工程菌生產(chǎn)乳酸、琥珀酸、聚羥基脂肪酸酯（PHA） 、丁醇、氨基酸、木糖醇等。經(jīng)費比例：17%承擔單位：南京工業(yè)大學、山東大學、中國科學院大連化學物理研究所課題負責人：姜岷學術骨干：祁慶生、鮑曉明、何冰芳、蔡恒、譚海東課題 6、木質纖維素降解轉化過程強化的工程學原理與方法研究內容：1. 產(chǎn)酶、酶解和發(fā)酵過程特性與優(yōu)化控制研究1.1 產(chǎn)酶、酶解和發(fā)酵的反應動力學研究：以降低能耗為目標，通過實驗和理論分析，解析上述反應系統(tǒng)中各因素的相互作用關系，采用分層建模方式（由簡單到復雜）逐步完善纖維質原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇過程的動力學模型，并根據(jù)敏感性分析，探討底物中抑制物濃度、底物酶解性能與發(fā)酵性能三者之間的定量關系。由動力學模型從理論上分析同步糖化發(fā)酵過程的控制策略。1.2 非均相酶解發(fā)酵過程的優(yōu)化控制：考慮非均相酶解過程的主要特點，包括纖維素原料的特點（結晶度、聚合度、粘度） 、纖維質原料對纖維素酶的吸附（特別是木素對纖維素酶的不可逆失活吸附）等酶解性能與發(fā)酵性能之間的定量關系，分析溫度、酶用量、底物濃度控制策略。對不同反應器規(guī)模下的發(fā)酵過程進行優(yōu)化和控制。1.3 纖維素降解轉化過程放大的基礎研究：針對木質纖維素降解轉化過程的特點（極限低水用量、極高固體含量、極低纖維素酶用量與發(fā)酵營養(yǎng)等） ，研究工業(yè)化約束條件下的資源節(jié)約型過程集成中的基礎理論問題和過程放大方法論；高粘度多相流體系的混合與傳遞過程的數(shù)學模擬、生物轉化與代謝過程中酶與細胞狀態(tài)的定量表征與調控、復雜化學反應與酶反應體系的反應網(wǎng)絡動力學模型與過程強化；木質纖維素降解產(chǎn)物的直接分離技術以及其它新型節(jié)能型分離技術；木質纖維素全組分的物性數(shù)據(jù)庫構建；基于 Aspen plus 平臺上的過程模型化與優(yōu)化；木質纖維素降解過程全流程集成的 Mini-Plant 評價系統(tǒng)。2. 預處理技術、生物反應與分離過程的耦合和集成系統(tǒng)2.1 適合預處理的物料與聯(lián)產(chǎn)反應條件：測量底物預處理前后的纖維素、半纖維素、木素含量變化、纖維素結晶度、聚合度變化等參數(shù)，研究不同預處理條件下發(fā)酵抑制物（乙酸、糠醛、5-羥甲基糠醛等）的生成動力學；研究異質性底物降解過程中反應的不均一性；研究酶組分耐酸堿性環(huán)境、耐毒性物質的適應機理，對其進行定向進化與理性改造；探索針對特定預處理物料的高效酶組分組合的轉化產(chǎn)糖系統(tǒng)；并建立潛在的污染評價體系。2.2 預處理、生化反應和產(chǎn)物分離過程的節(jié)能和酶循環(huán)利用：為代替?zhèn)鹘y(tǒng)的高耗能濃縮生物燃料蒸餾法，致力于將有機溶劑和水有效分離的新型材料的基礎研究，力圖開發(fā)省能源、可連續(xù)式生產(chǎn)的新型膜分離技術；研究新型酶載體，開發(fā)纖維素酶回收技術，通過纖維素酶的再循環(huán)利用，降低酶的成本； 2.3 物料的全轉化與高值產(chǎn)品的多樣化：發(fā)展新的過程耦合技術和集成系統(tǒng)；優(yōu)化預處理--酶解糖化--雜多糖發(fā)酵過程，通過高效發(fā)酵與代謝流控制產(chǎn)生多種高值化工產(chǎn)品。經(jīng)費比例：14%承擔單位：清華大學、華東理工大學課題負責人：鮑杰學術骨干：劉德華、張建安、葉蕊芳、程可可四、年度計劃研究內容 預期目標第一年1、研究不同生長期、不同干燥方式、不同產(chǎn)地等對原料細胞壁的生物結構、化學組成的影響?？疾觳煌A處 理條件下木質纖維素原料的成分變化，2、開展特殊環(huán)境微生物元基因 組研究，建立纖維素降解酶高通量 篩選平臺，對堆肥、熱泉等微生物生態(tài)群系及糖苷水解酶進行動態(tài)分析。3、針對重要纖維素降解微生物開展基因組學、轉錄組學和蛋白質組 學研究，探索各酶及蛋白因子在纖維素降解過程中的機制及協(xié)同作用。4、研究絲狀真菌纖維素酶合成以及分泌過程中的關鍵因子，鑒定 纖維素酶合成、分泌、修飾的結構基因或 調控基因。5、研究纖維小體結構域的基因聚 類及信息學分析，對代表性類型 進行重組表達；對代表性纖維素降解體系的關鍵蛋白質成分進行蛋白質組分析；6、利用微生物誘變選育技術和分子生物學手段選育優(yōu)良的突變菌株或基因工程菌株；對大腸桿菌、酵母等開展系 統(tǒng)分析、代謝控制分析和代謝流向分析，研究菌株的代謝途徑、代謝節(jié)點以及各種 調節(jié)機制的變化，深化對微生物戊糖代 謝調控機理的認識。7、啟動產(chǎn)酶發(fā)酵、酶水解和乙醇發(fā)酵體系的動力學與過程特性研究，木 質纖維素降解轉化過程放大的工程學基礎研究，預處理體系與生物煉制聯(lián)產(chǎn) 系統(tǒng)的綜合評價。1、建立高通量分析、快速測定生物質結構和化學組成的技術2、構建 2-3 個特殊環(huán)境微生物元基因組文庫；篩選、發(fā)現(xiàn)新的與纖維 素降解相關新基因 10-20 個，克隆 5-10 個不同來源纖維素酶組分酶基因及非酶蛋白因子基因，確定其酶學性質3、完成木霉、哈氏嗜纖維菌等不同纖維素酶誘導和抑制條件下差異表達譜的分析；發(fā)現(xiàn) 2-3 個絲狀真菌 纖維素酶合成、修飾、分泌過程中起關鍵作用的基因。4、獲得高溫厭氧纖維素高效降解 細菌 1～5 株，建立不可培養(yǎng)微生物的 篩選策略。5、構建 Cohesin 和 Dockerin 的重組表達體系，獲得純化的重組蛋白；確定代表性纖維素降解體系的關鍵成分；6、解析基于纖維小體產(chǎn)生菌生物 強化的木質纖維素高效降解機理， 實現(xiàn)汽爆秸稈的高效水解，得糖率達到 80%以上；7、建立并改進適用于相關微生物的方便實用的多套遺傳操作體系；選育多株抗逆性良好、戊糖代謝能力較強 的突變菌株或基因工程菌株；8、構建纖維質原料的產(chǎn)酶發(fā)酵、同步糖化發(fā)酵過程的動力學模型，完成不同預處理條件下發(fā)酵抑制物的生成動力學。發(fā)表論文 35-40 篇，專著 1-2 本。申請專利 5 項左右。研究內容 預 期目標第二年1、測定纖維素的超微結構與整體 結構性質；利用纖維素晶體結構數(shù)據(jù)，構建寡糖、纖維素微纖絲及其聚集體的 結構模型。2、采用 HPLC、質譜等分析手段，定性分析不同預處理條件下木質纖維素原料抑制物生成種類。3、繼續(xù)進行元基因組文庫纖維 素酶高通量篩選，對新發(fā)現(xiàn)的纖維 素降解酶進行克隆表達及酶學性質分析。 進行纖維素酶持續(xù)性催化的熱力學/動態(tài) 學過程和非酶因子在纖維素降解過程中作用機制的研究，發(fā)現(xiàn)的纖維素降解復合體（ 纖維小體）中新的酶組分進行純化、鑒 定。解析纖維小體的酶空間集群排列；進行腳架蛋白的設計及制備；4、分析不同株系絲狀真菌、好氧細菌、厭氧細菌纖維素降解相關基因在不同誘導和阻遏條件下、不同時期表達水平和動態(tài)變化，考察差異基因對纖維 素酶合成的影響，系統(tǒng)闡述多種不同生物的 纖維素降解策略。5、分別建立中高溫/中溫解纖維梭菌強化的木質纖維素高效降解汽爆玉米秸稈工藝；選擇與木質纖維素降解菌生長條件匹配的高效產(chǎn)氫菌株；研究各種產(chǎn)氫菌株的特性，優(yōu)化其培養(yǎng)基及培養(yǎng)工 藝條件；混合培養(yǎng)產(chǎn)氫菌株與產(chǎn)纖維小體梭菌，研究各組合菌株的協(xié)同度。6、對能夠利用戊糖的菌株（重 組酵母、丙酮丁醇梭菌、芽孢桿菌等），考察其相關耐受性( 相關毒素、產(chǎn)物) ，對其抗逆性能機制進行研究；針對不同產(chǎn)品， 結合代謝網(wǎng)絡分析，剖析菌體生長 與主產(chǎn)物抑制的關鍵因子；考察菌株利用纖維水解糖液代謝合成重要平臺化合物的性能。7、繼續(xù)產(chǎn)酶發(fā)酵、酶水解和乙醇發(fā)酵體系的動力學與過程特性研究，非均相酶解與發(fā)酵過程的優(yōu)化控制，木 質纖維素降解轉化過程放大的工程學基礎研究， 預處理體系與生物煉制聯(lián)產(chǎn)系統(tǒng)綜合評價。1、闡明木質纖維素原料的微纖絲 與其它主要結構成分（木素和非纖維素類的多糖）的相互關系；揭示生物質在各種條件預處理過程中的物理和化學變化規(guī)律；2、篩選到纖維素酶新基因 10-30 個；確定 3-5 個影響纖維素酶高效表達 調控新基因的生物學功能，揭示其參與纖維素酶合成代謝調控分子機制；發(fā)現(xiàn) 2-3 個絲狀真菌纖維素酶合成、修飾、分泌過程中受不同誘導條件調控的關鍵新基因；獲得 1-2 種高效降解木質纖維素的復合 酶系。3、獲得特定菌株降解纖維素的最佳條件及作用范圍，發(fā)現(xiàn)新的酶組 分并闡述其降解性質；獲得熱纖梭菌不同碳源的轉錄譜，以及一些纖維小體表達 調控相關的關鍵基因，并初步闡明其調控機理。4、建立 CBH 催化纖維素降解動力學/動態(tài)學模型，獲得不同 Dokerin 及Cohesin 的親和力數(shù)據(jù)，分析各功能酶組分的空間排列樣式，設計出數(shù)種微型腳架蛋白并重組制備；5、建立木質纖維素生物降解過 程與發(fā)酵匹配的體系，初步揭示協(xié) 同作用機理；選育得到多株對纖維水解液中抑制因子具有高抗性的菌株，并解析其抗逆機制；選育得到多株能夠利用纖維水解液代謝合成重要平臺化合物的菌株，完成對菌株生長和主產(chǎn)物抑制因子的研究。6、完成基于敏感性分析的底物抑制物濃度、底物酶解性能與發(fā)酵性能三者之間的定量關系研究；完成對纖維質原料的本征參數(shù)以及對纖維素酶的吸附特性等與過程效率之間的關系進行定量分析；完成工程冷模實驗手段對過程的混合與傳遞特性的研究，提出過程放大基本準 測；完成異質性底物降解過程中反應的不均一性；完成構建木質纖維素全組分的物性數(shù)據(jù)庫。發(fā)表論文 35-45 篇，專著 1-2 本。專利 5 項左右。研究內容 預 期目標第三年1、基于木質纖維素超分子結構研究 纖維素酶催化過程的定量構效關系， 結合酶分子催化動力學過程分析，分析不同微 纖絲組成的超分子空間屏障及限速步驟，為定向進化/理性改造奠定理論 基礎。2、利用表面分析技術、紅外光譜等技術手段，考察預處理對木質纖維 素原料細胞壁組織結構中纖維素、半纖維 素及木質素等主要物質之間的化學鍵類型及空間構型等的影響。3、對獲得纖維素酶新基因進行定向 進化改造，將其在纖維素酶生產(chǎn) 菌株中進行高效表達，分析基因工程菌所產(chǎn)纖維素酶對木質纖維素降解能力的提高。3、通過對纖維素酶生產(chǎn)菌株合成代 謝途徑分子改造，優(yōu)化纖維素酶 各組分及非酶因子組成結構，挖掘影響絲 狀真菌纖維素酶合成、修飾、分泌效率的調控蛋白或基因，探索絲狀真菌纖維素酶 的高效分泌機制，闡明各種蛋白質組分協(xié) 同效應的作用機制。4、通過蛋白質組學分析，結合生理生化驗證，研究篩選得到的纖維 小體的組成及多樣性，解析關鍵蛋白的結 構， 組裝人工纖維小體。5、建立產(chǎn)纖維小體梭菌與產(chǎn)氫 菌混合發(fā)酵體系，研究同步糖化產(chǎn)氫過 程的相互作用機制，解析產(chǎn)纖維小體梭菌 強化木質纖維素降解過程。6、解析戊糖代謝機理和抗逆性代 謝，利用轉錄組學和代謝流向技術分析菌株性狀改變的機制和代謝節(jié)點，并 進行輔酶工程的初步研究；建立利用纖維水解全糖組分的系統(tǒng)或者體系，并注重體系的 協(xié)同效應和高效轉化。7、繼續(xù)產(chǎn)酶發(fā)酵、酶水解和乙醇發(fā)酵體系的動力學與過程特性研究，非均相 酶解與發(fā)酵過程的優(yōu)化控制，木 質纖維素降解轉化過程放大的工程學基礎研究， 預處理體系與生物煉制聯(lián)產(chǎn)系統(tǒng)的綜合評價，預處理、同步糖化與發(fā)酵和產(chǎn) 物分離過程的節(jié)能和酶再生利用。1、闡明不同預處理對原料細胞壁生物結構的影響規(guī)律，并建立相關的原料 結構屏障解聚模型； 2、篩選獲得纖維素酶新基因 20-30 個，確定其酶學性質，闡明 3-5 種重要酶的生物學功能；篩選出 2-3 中有效提高木 質纖維素水解效率的協(xié)同因子，獲 得 1-2 個經(jīng)過理性改造/定向進化后特性改善的 纖維素酶，發(fā)現(xiàn) 2-3 個影響絲狀真菌纖維素酶合成、修飾、分泌的新基因。3、闡明從環(huán)境分離到的高溫 厭氧纖維素降解細菌在利用不同底物時的纖維素酶表達差異，解析 1 到 2 個關 鍵蛋白或復合體的三維結構；制備得到關鍵纖維小體亞基，構建得到有活性的人工 纖維小體；4、獲得 1-2 株高產(chǎn)纖維小體的突變菌株，獲得高產(chǎn)纖維小體的最優(yōu)發(fā) 酵條件；人工構建同步糖化產(chǎn)氫菌群， 實現(xiàn)蒸汽爆破玉米秸稈的同步糖化產(chǎn)氫， 氫氣得率達到 1.5mol 氫氣/mol 已糖以上。5、選育得到多株高效利用纖維 水解全糖組分的菌株，并解析其代謝 機制；解析不同發(fā)酵策略引起微生物胞內輔酶水平變化的分子機制及其與生產(chǎn)效率之間的關系；建立多套纖維水解全糖組分轉化利用的系統(tǒng)，分析菌體生長與產(chǎn) 物代謝合成的瓶頸。6、完成動力學模型的理論分析以及同步糖化發(fā)酵過程的控制策略；完成針對特定預處理物料的高效酶組分組合的轉化產(chǎn)糖系統(tǒng)；完成高粘度多相流體系的混合與傳遞過程的數(shù)學模擬、生物 轉化與代謝過程中酶與細胞狀態(tài)的定量表征與調控；完成同步糖化與發(fā)酵過程中酶與細胞對酸堿性環(huán)境和有毒性物質的適應機理，并完成對其進行定向馴化與改造；完成以工程手段降低預處理過程的蒸汽能耗、同步糖化與發(fā)酵過程的機械能耗和乙醇精餾過程能耗目標發(fā)表 SCI 論文 35-45 篇；申請發(fā)明專利 5-8 項 。研究內容 預 期目標第四年1、闡明纖維素降解過程中的分子 動態(tài)行為與能量轉化規(guī)律，纖維素晶 態(tài)的能量分布和結構特征對高級結構的影響。分析不同預處理方式下影響原料酶解和發(fā)酵性能抑制物關鍵因子的成分、種 類，并確定其臨界含量。2、建立難培養(yǎng)微生物分離培養(yǎng)方法，從瘤胃、白蟻后腸中分離新型高效降解 纖維素的微生物，構建新型高效 纖維素降解微生物基因組文庫，篩選新的 纖維素降解酶， 對已篩選到非酶新降解因子 進行生物學功能分析。3、探討斜臥青霉纖維素酶合成、修飾、分泌過程中多個關鍵基因的相互影響。利用定向進化、定點突變等技術 構建各種突變株，考察其纖維素酶生產(chǎn)能力的差異。將具備協(xié)同作用的蛋白（酶）在絲狀真菌中進行異源表達，考察重構后復合酶系的水解效率，并通過調節(jié)不同蛋白 組分的比例，進一步優(yōu)化復合酶系的水解效率。5、對纖維小體關鍵功能酶的性能 進行優(yōu)化改造，改善底物譜、抗逆性及催化效率。研究梭菌混合發(fā)酵產(chǎn)乙醇體系，篩選及優(yōu)化混和培養(yǎng)菌株；研究人工菌群在糖轉化、中間代謝的代謝流相互作用，構建人工菌群代謝網(wǎng)絡模型，解析混合菌群的關鍵代謝調控節(jié)點，研究人工菌群中糖代謝對纖維素降解的解抑制及其緩釋提高產(chǎn)氫菌產(chǎn)氫得率的機理和方法。6、考察菌株代謝流量及代謝網(wǎng) 絡動態(tài)變化規(guī)律，剖析選育過程中目的 產(chǎn)物發(fā)酵關鍵代謝網(wǎng)絡的變化與調控規(guī)律， 選育獲得生產(chǎn)性狀優(yōu)良的菌株；解決氧化還原不平衡問題，優(yōu)化代謝途徑。7、開展非均相酶解與發(fā)酵過程的 優(yōu)化控制，木質纖維素降解轉化過 程放大的工程學基礎研究，預處理體系與生物 煉制聯(lián)產(chǎn)系統(tǒng)的綜合評價，預處理、同步糖化與發(fā)酵和產(chǎn)物分離過程的節(jié)能和酶再生利用，物料的全轉化與高值產(chǎn)品的多 樣化1、定義出木質纖維素初級結構，闡明不同纖維素晶態(tài)的能量分布以及該層次的結構特征對高一級結構的影響；歸納出預處理影響原料酶解效率的關鍵因子。2、從瘤胃、白蟻腸道、熱泉分離難培養(yǎng)纖維素高效降解微生物 2-3 個，建立 2-3 個纖維素高效降解微生物的基因組文庫， 篩選獲得纖維素酶新基因 20-30 個，鑒定出 1-2 個相關功能非酶新降解因子，并闡明其生物學功能。3、構建絲狀真菌中調控纖維素 酶合成、修飾、分泌過程的代謝網(wǎng)絡圖。解析斜臥青霉纖維素酶合成的誘導或阻遏分子機制。從分子機理角度提出構建絲狀真菌纖維素酶高產(chǎn)菌株的方法。構建各種 纖維素酶分子可調控表達的突變株， 獲得纖維素和半纖維素水解復合酶活性進一步提高的新重組復合酶系。4、獲得性能改良的纖維小體亞 基；獲得能夠與 C.thermocellum 共培養(yǎng) 進行纖維素乙醇發(fā)酵的優(yōu)化菌株；構建人工菌群代謝網(wǎng)絡模型，闡釋異菌間代 謝流相互作用規(guī)律； 5、解除關鍵抑制因子對菌體生 長與產(chǎn)物代謝合成的抑制，提高菌體的生 產(chǎn)性能；建立基于輔酶調控的重要平臺化合物的生物合成策略。6、完成對溫度、酶用量、底物濃度等參數(shù)的調控對過程進行優(yōu)化控制，并在不同反應器規(guī)模下對優(yōu)化控制策略進行測試；完成復雜化學反應與酶反應體系的反應網(wǎng)絡動力學模型，實現(xiàn)過程的 強化和放大過程的有效調控。完成對基于 Aspen plus 平臺上的生物煉制全轉化 過程模型化與優(yōu)化；完成新型分離材料和方法研究，開發(fā)節(jié)能、連續(xù)式的新型分離技 術；建立完整的微型全過程集成平臺和測試實例。發(fā)表 SCI 論文 35-45 篇；申請發(fā)明專利 5-8 項 。研究內容 預 期目標第五年1、構建纖維素超分子結構與木 質纖維素原料生物解聚的定量構效關系，并基于定向進化、定點突變等新技術 提高酶組分的活力；并探討預處理過程中發(fā)酵抑制物的生成動力學，建立針對不同 發(fā)酵菌種和產(chǎn)品的預處理抑制物去除方法；2、對不同預處理方式（包括組 合預處理方式）進行經(jīng)濟成本分析，及其 綜合評價；3、研究分析纖維素酶持續(xù)性催化 結晶纖維素的動態(tài)學，開展纖維素 酶合成生物學研究，人工組合纖維素酶系的研究，對已篩選到新纖維素酶進行多樣性和催化特性深入分析；探索研究哈氏嗜纖維菌參與木霉纖維素酶對結晶纖維素降解的協(xié)同作用。4、構建絲狀真菌可生產(chǎn)新型復合 酶系的纖維素酶高產(chǎn)基因工程菌，并 優(yōu)化它們的纖維素酶生產(chǎn)工藝。構建評 價新復合酶系對不同天然底物的水解效率。5、挖掘新的纖維素降解輔助因子，分析其在降解纖維素過程中的作用及對不同底物降解促進機制；針對不同底物優(yōu)化最小人工纖維小體，并進行大 規(guī)模制備。6、進行 CBP 發(fā)酵產(chǎn)乙醇的工藝優(yōu)化；設計玉米秸稈同步糖化發(fā)酵制氫反應器，進行高效人工菌群的反應器運行實驗，對反應器參數(shù)調控及反應器系統(tǒng)進行優(yōu)化；7、在已獲得優(yōu)良生產(chǎn)菌株的基 礎上，以纖維水解全糖組分為原料， 綜合利用氧化還原電位調節(jié)等發(fā)酵調控手段， 進一步提高目的產(chǎn)物的收率和生產(chǎn)強度；在此基礎上，建立能直接利用纖維素水解液中全部糖類來發(fā)酵生產(chǎn)目的產(chǎn)品（乙醇、丁醇、丁二酸、PHA 、乳酸等）的生 產(chǎn) 體系。7、完成預處理體系與生物煉制 聯(lián)產(chǎn)系統(tǒng)的綜合評價，預處理、同步糖化與發(fā)酵和產(chǎn)物分離過程的節(jié)能和酶再生利用，物料的全轉化與高值產(chǎn)品的多樣化。1、建立不同預處理方式下的抑制物生成動力學；提出 2-3 種新的高效、低能耗、少抑制物的預處理方案；2、建立含 80-100 個不同來源、不同催化特性的纖維素酶酶庫，獲得 3 株新的降解效率高的纖維素酶產(chǎn)生菌株， 獲得降解效率高的人工組合纖維素酶系；3、構建出高產(chǎn)高效纖維素降解 酶系的基因工程菌 2-3 株，使酶解轉化率大于90%。噸乙醇用酶成本從 2000 元以上降到 800 元以下。4、闡明復雜纖維素降解體系中不同 組分的協(xié)同作用機制；獲得 2 到 3 種針對不同底物優(yōu)化的最小人工纖維小體，并 實現(xiàn)制備放大，使纖維素酶解轉化率大于90%；獲 得 C.thermocellum 的 CBP 纖維素乙醇發(fā)酵的最優(yōu)條件，噸乙醇 酶解成本降低 50％。5、構建出同步糖化發(fā)酵制氫反 應器系統(tǒng)， 實現(xiàn)其快速啟動及穩(wěn)定運行 ,最終氫得率 2mol 氫氣/mol 已糖以上；6、獲得能直接利用纖維素水解液中全部糖類來發(fā)酵生產(chǎn)液體燃料和大宗化學品（乙醇、琥珀酸、乳酸、聚羥基丁酸等）的抗逆代謝工程菌株 3-5 株，并建立高效的生產(chǎn)體系，為生物煉制技 術產(chǎn)業(yè)化奠定基礎。7、建立木質纖維素降解過程全流程生物煉制微型工廠(Mini-Plant) 評 價系統(tǒng)，對成本、能耗、廢棄物排放的潛在 污染影響等進行綜合評價。8、完成新型酶或細胞載體研究，開發(fā)基于統(tǒng)合生物工藝(CBP)的纖維素酶再生技術，實現(xiàn)纖維素酶的再生利用。實現(xiàn)纖維質原料的全轉化和多種高值化學品的生物煉制新工藝。發(fā)表 SCI 論文 35-45 篇；申請發(fā)明專利 5-8 項 。一、研究內容圍繞三個關鍵科學問題開展研究工作（1）纖維素類生物質是如何抗生物降解的：抗生物降解的多層次屏障包括纖維素的結晶結構、纖維素與半纖維素和木素組合形成的異質高聚物、復雜的細胞壁多層結構等。從生物降解轉化的角度，來深入研究這一系列抗降解屏障的特性，尋求破解之道，是實現(xiàn)生物質高效轉化的基礎。（2）微生物是如何攻擊植物的抗降解屏障的：在長期自然進化中，微生物形成了攻擊植物生物質抗降解屏障的多酶組分系統(tǒng)代謝策略。深入研究微生物降解木質纖維素的機理、多樣性以及酶系合成調控，特別是其攻擊纖維素結晶結構的途徑，解析降解所需復雜酶系的組成和合成調控，是提高生物催化劑效率的前提。（3）破解抗性屏障和提高轉化效率的可能途徑；分子和系統(tǒng)生物學研究的快速發(fā)展為生物系統(tǒng)的定向設計與改造提供了可能。通過設計和改造微生物及其降解和轉化酶系，開展過程導向的酶分子優(yōu)化改造，結合相關化工技術的研究，探討利用生物技術和物理、化學手段破解抗降解屏障的新途徑，有望集成和設計出新的環(huán)境友好、效益可行的生物煉制方案。