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基因工程的基本操作程序,原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),原核細(xì)胞基因,編碼區(qū)（編碼序列）：能指導(dǎo)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，即能夠編碼蛋白質(zhì),非編碼區(qū)（調(diào)控序列）：位于編碼區(qū)上游和編碼區(qū)下游的DNA序列，雖不能指導(dǎo)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，但有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，如啟動(dòng)子、終止子等,,原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),RNA聚合酶的作用是催化DNA轉(zhuǎn)錄為RNA。它能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并與DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。,真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),與原核細(xì)胞比較，真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)的主要特點(diǎn)是：編碼區(qū)是間隔的、不連續(xù)的。也就是說，能夠編碼蛋白質(zhì)的序列被不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列分隔開來，成為一種斷裂的形式。其中，能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子，一般不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子。,真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),真核細(xì)胞基因,編碼區(qū)（間隔、不連續(xù)）,外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列,非編碼區(qū)：與原核生物具有相似功能的啟動(dòng)子、終止子,,,原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較,基因的種類,（1）編碼蛋白質(zhì)的基因：包括結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因。（2）沒有轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。（3）不能轉(zhuǎn)錄的DNA片段：如操縱基因。,啟動(dòng)子與終止子,啟動(dòng)子是在非編碼區(qū)內(nèi)緊靠轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，調(diào)控遺傳信息表達(dá)的脫氧核苷酸序列，它能引導(dǎo)RNA聚合酶與正確的基因部位結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄從起點(diǎn)開始，沿編碼區(qū)進(jìn)行。終止子是在非編碼區(qū)內(nèi)緊靠轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)，調(diào)控遺傳信息表達(dá)的脫氧核苷酸序列，它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。,基因工程的基本操作流程,基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù),基因組文庫(kù),部分基因文庫(kù),基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù),cDNA合成過程,第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,原理:DNA雙鏈復(fù)制前提:要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。,獲取目的基因,從基因文庫(kù)中獲取利用PCR技術(shù)擴(kuò)增利用化學(xué)方法人工合成,構(gòu)建表達(dá)載體,表達(dá)載體的組成目的基因啟動(dòng)子終止子標(biāo)記基因,基因工程載體的構(gòu)建需要考慮哪些因素,（1）基因的特點(diǎn)：如果一個(gè)來自動(dòng)物的目的基因含有內(nèi)含子，就不能用于轉(zhuǎn)基因植物，因?yàn)閯?dòng)物中內(nèi)含子的剪接系統(tǒng)與植物的不同，植物不能將動(dòng)物基因的內(nèi)含子剪切掉，只能用該基因的cDNA。基因的產(chǎn)物如果是一個(gè)糖蛋白，那么該基因在原核生物細(xì)菌中表達(dá)出來的蛋白就可能不具備天然狀態(tài)下的活性，因?yàn)樘堑鞍咨系奶擎準(zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加上的，而細(xì)菌無這些細(xì)胞器。（2）要選擇強(qiáng)啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子有強(qiáng)有弱，選擇強(qiáng)啟動(dòng)子可以增加轉(zhuǎn)錄活性，使基因產(chǎn)物量增多。如果希望基因在生物的某個(gè)組織表達(dá)，如只在植物種子中表達(dá)，就要選擇種子中特異表達(dá)的啟動(dòng)子。（3）要有選擇標(biāo)記基因，如抗生素基因，以便選擇出真正的轉(zhuǎn)基因生物。,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（植物細(xì)胞）,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（動(dòng)物細(xì)胞）,顯微注射法,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（微生物細(xì)胞）,Ca2+處理,目的基因的檢測(cè)與鑒定,檢測(cè):是否插入目的基因是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯鑒定:功能活性鑒定抗性鑒定,分別提取什么進(jìn)行檢測(cè),歸納步驟,歸納:基因工程的基本操作程序,獲取目的基因從基因文庫(kù)利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯,基因操作的基本步驟,基因操作的基本步驟,,