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,,6.1微生物發(fā)酵與制藥6.2微生物生長與生產的關系6.3制藥微生物生產菌種建立6.4培養(yǎng)基制備6.5滅菌工藝6.6發(fā)酵培養(yǎng)技術6.7發(fā)酵工藝過程的控制6.8青霉素的生產工藝,第六章微生物發(fā)酵制藥工藝,,,青霉素的概述生產菌的生物學特性發(fā)酵工藝過程提煉工藝過程,6.8青霉素的生產工藝,,1929:Fleming在葡萄球菌培養(yǎng)皿中，污染的霉菌周圍出現(xiàn)透明的抑菌圈。殺菌物質，斷言太不穩(wěn)定，無法分離并用作藥物。1939：牛津病理家HowardFlorey化學家ErnstChain,NormanHeatley。發(fā)酵瓶培養(yǎng)霉菌，培養(yǎng)里提取，測活性，青霉素結晶。,6.8.1概述－發(fā)現(xiàn)（1）,1940:8只鼠注射鏈球菌，提取物對4只治療。未經治療鼠在24小時內死亡，治療鼠存活數(shù)天至數(shù)周。1941年2月開始治療第一批人類病人。1943：威斯康辛大學小組，取得突破生產菌表面培養(yǎng)：幾十個單位。深層培養(yǎng)產黃青霉：100U/ml。X、UV誘變育種：1000－1500U/ml。不產色素變種：66000－70000U/ml目前：85000U/ml。,,細胞壁合成中的肽多糖合成的第三階段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽類似物競爭性與轉肽酶結合，使轉肽酶不能催化多肽鏈之間的交聯(lián)。生長中的細胞有效，靜止細胞無效高效、安全的抗細菌感染藥物,6.8.1概述－作用機理（2）,,（1）臨床抗感染治療：大多數(shù)革蘭氏陽性菌和某些革蘭氏陰性細菌及螺旋體等。毒性小，但需要皮試。（2）各種半合成抗生素的原料：氨芐青霉素，磺芐青霉素，乙氧萘青霉素頭孢菌素母核。,6.8.1概述－應用（3）,6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic6APA）苯乙酰衍生物。側鏈基團不同，形成不同的青霉素G：芐基青霉素，C6H5CH2-CO-，為主雙氫霉素F：戊青霉素X：對羥芐基青霉素F：2-戊烯基青霉素K：庚青霉素V：苯氧甲基青霉素產品：鈉、鉀、普魯卡因、二芐基乙二胺,6.8.1概述－分子結構及衍生物（4）,產黃青霉：Penicilliumchrosogenum孢子:綠色和黃色菌落：平坦或皺褶，圓形。青霉穗:分生孢子鏈狀??深層培養(yǎng)菌絲：球狀和絲狀兩種。,6.8.2青霉素生產菌的生物學特性,第1期：分生孢子萌發(fā)，具有小泡。第2期：菌絲繁殖，嗜堿性，類脂肪小顆粒。第3期：脂肪包涵體，貯藏物，嗜堿性很強。第4期：空泡，嗜堿性減弱，開始產生抗生素。第5期：大空泡，中性染色大顆粒，脂肪包涵體消失，青霉素產量最高。第6期：個別細胞自溶，胞內無顆粒，釋放氨，pH上升。第7期：菌絲完全自溶，僅有空細胞壁。,發(fā)酵培養(yǎng)下的生長過程及細胞學變化,規(guī)定時間取樣，顯微鏡觀察7個時期的態(tài)變化，控制發(fā)酵。1－4期為菌絲生長期，3期的菌體適宜種子。4－5期為生產期，生產能力最強，通過工程措施，延長此期，獲得高產。第6期到來之前結束發(fā)酵。,鏡檢控制,青霉素生產流程框圖,斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)米孢子：移植到小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長7天，25℃注意：每批孢子必需進行嚴格搖瓶試驗，測定效價及雜菌情況。,6.8.3發(fā)酵工藝過程,一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等。空氣流量1：3（體積比）；300-350rpm；pH自然，溫度271℃,40h二級種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10％培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等。1:1-1.5；250-280rpm；pH自然，251℃。10-14h質量：菌絲致密，菌絲粗壯，III期，倍增期6-8h,2、種子罐培養(yǎng)工藝,三級罐：生產罐；接種量20％培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油.參數(shù)條件：通氣量1：0.8-1.2；150-200r/min；前60小時:pH6.4-6.6，26℃；60小時后:pH6.7,24℃。,3、生產罐培養(yǎng)工藝,操作方式：反復分批式發(fā)酵發(fā)酵罐：100M3，裝料80M3.帶放:6-10次，帶放量10％，間隔24h。發(fā)酵周期：180-220h,4、發(fā)酵培養(yǎng)與過程控制,青霉素的生產周期,發(fā)酵動力學,前40小時：培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物40小時后：低速連續(xù)補加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，維持一定的最適濃度。半饑餓狀態(tài)：延長合成期，提高產量。碳源占成本12％以上，采用糖化液流加,降低成本。糖與6APA結合形成糖基-6APA，影響青霉素產量。,（1）過程控制——補料分批操作控制基質濃度,根據(jù)殘?zhí)恰H、尾氣中CO2和O2含量。葡萄糖的波動范圍較窄，濃度過低使抗生素合成速度減慢或停止，過高則導致呼吸活性下降，甚至引起自溶。殘?zhí)?.3-0.6％左右，pH開始升高時流加糖。濃度：500kg/M3，流速:1.0-2.5kg/M3.h,流加碳源控制,玉米漿:最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。補加無機氮源：硫酸銨、氨水、尿素氨基氮濃度：0.01-0.05%。,流加氮源控制,無機鹽：硫、磷、鎂、鉀等。鐵對青霉素合成有毒，30-40ug/ml以下。罐壁涂環(huán)氧樹脂保護層。,鹽離子控制,時期：合成階段種類：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸毒性：抑制細胞生長和青霉素合成。策略：低濃度流加濃度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%控制：保持供應速率略大于生物合成需要。,（2）添加青霉素側鏈前體,表面活性劑：新潔爾滅、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、單油酸酯、單月桂酸酯、三油酸酯可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇其他：剪切保護劑；分散劑,提高產量的其他物質流加,適宜菌絲生長溫度30℃，分泌青霉素20℃。20℃青霉素破壞少，周期很長。變溫控制，不同階段不同溫度。生長階段:較高溫度，縮短生長時間；生產階段適當降低溫度，以利于青霉素合成。前期控制26℃左右，后期降溫控制24℃,（3）溫度控制,合成適宜pH6.4－6.6左右，避免超過7.0直接加酸或堿：自動控制流加葡萄糖：恒速；變速，依賴pH變化快慢。pH下降：補加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量pH上升：補加糖、生理酸性物質（硫酸銨、油脂）,（4）pH控制,＜30％飽和度，產率急劇下降；＜10％，造成不可逆的損害。臨界溶氧濃度：30％。通氣比：1：0.8－1.5。適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧調整攪拌轉速:各階段的生長和耗氧量不同。,（5）溶氧控制,天然油脂：玉米油；化學消沫劑：泡敵。策略：少量多次。注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。,（6）消沫,青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定易溶于有機溶劑，水中溶解度很小青霉素鹽很穩(wěn)定；降解產物具有致敏性防止降解，條件溫和、快速。,2.8.4提煉工藝過程,青霉素的存在部位：發(fā)酵液濃度較低：10－30Kg/M3含有大量雜質：菌體細胞、核酸、雜蛋白質、細胞壁多糖等、殘留的培養(yǎng)基、色素、鹽離子、代謝產物等目的：濃縮目的產物，去除大部分雜質，改變發(fā)酵液的流變學特征，利于后續(xù)的分離純化過程。預處理:發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白,1、預處理,鼓式真空過濾機過濾：一次濾液：pH6.2-7.2，略渾，棕黃或綠色，蛋白質含量0.5-2.0%。板框式過濾機過濾：硫酸調節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土為助慮劑。二次濾液：澄清透明，用于提?。ㄊ章?0％）,2、過濾,原理：青霉素游離酸易溶于有機溶劑，而霉素鹽易溶于水。萃取劑：青霉素分配系數(shù)高的有機溶劑。工業(yè)上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白質：加0.05-0.1%乳化劑PPB。萃?。?－3次。,3、溶劑萃取,正相萃?。核峄痯H1.8-2.0，濾液：醋酸丁酯＝1：0.3，碟片式離心機分離（濃縮1.5-2.1）反相萃?。簆H6.8-7.4（磷酸鹽、碳酸鹽緩沖液）。把青霉素從丁酯中提取到緩沖液中。反復萃取2－3次，達到結晶要求。萃取條件：10℃下。萃取罐冷凍鹽水冷卻。,逆流萃取過程,萃取液中添加活性炭，除去色素過濾，除去活性炭。,4、脫色,加醋酸鈉－乙醇溶液反應：得到結晶鈉鹽。加醋酸鉀－乙醇溶液：得到青霉素鉀鹽。,5、結晶——直接結晶,萃取液，再用0.5MNaOH萃取pH6.4-6.8下得到鈉鹽水濃縮液。加3-4倍體積丁醇，16-26℃，真空0.67-1.3KPa）下蒸餾。水和丁醇形成共沸物而蒸出。鈉鹽結晶析出。結晶經過洗滌、干燥（60℃真空16h），磨粉，裝桶，得到青霉素產品。,5、結晶——共沸蒸餾結晶,青霉素的概述生產菌特性發(fā)酵工藝過程提煉工藝過程,小結,（1）青霉素發(fā)酵工藝的建立對抗生素工業(yè)有何意義？（2）如何根據(jù)青霉素生產菌特性進行發(fā)酵過程控制？（3）青霉素發(fā)酵過程的控制原理及其關鍵點是什么？（4）青霉素提煉工藝中采用了哪些單元操作，為什么？,思考題,