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華東理工大學(xué)國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心(上海)王永紅2011.11.24,微生物菌種高通量篩選技術(shù)與裝置,內(nèi)容提綱,高通量篩選在微生物育種中的重要意義菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國(guó)際進(jìn)展高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范,高通量篩選在微生物育種中的重要意義,1、菌種是發(fā)酵技術(shù)的源頭2、菌種是發(fā)酵技術(shù)的核心之核心3、菌種提高不增加設(shè)備材料投入,菌種發(fā)酵水平是企業(yè)產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的體現(xiàn),青霉素：5萬——12萬u/ml（國(guó)內(nèi)）8萬——20萬u/ml（國(guó)外）紅霉素：5000——8000/10000u/ml（國(guó)內(nèi)）10000——15000u/ml（國(guó)外）阿維菌素：4000——8400u/ml（國(guó)內(nèi)）10000u/ml以上（國(guó)外）,案例,育種工作中兩大任務(wù)：突變與篩選,高通量篩選在微生物育種中的重要意義,突變僅是前提篩選才是關(guān)鍵,,我國(guó)現(xiàn)有菌種篩選儀器裝備與技術(shù)國(guó)際相比存在巨大差距我國(guó)：傳統(tǒng)方法，篩選方式半個(gè)世紀(jì)沒有明顯改進(jìn)國(guó)際：高通量篩選技術(shù)(Highthroughputscreening,HTS),高通量篩選在微生物育種中的重要意義,,,內(nèi)容提綱,高通量篩選在微生物育種中的重要意義菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國(guó)際進(jìn)展高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范,1929，1940s-1950sPfizer公司：土霉素的發(fā)現(xiàn)56名科學(xué)家、10萬份土樣、歷時(shí)1年25%市場(chǎng)1984年，Pfizer提出AutomationProject.1990年，在Nagoya,Japan實(shí)施1萬株份/周,高通量篩選技術(shù)的起源,,微生物菌種篩選一般流程概率事件,菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國(guó)際進(jìn)展,通量限制步驟,微生物菌種篩選儀器裝備發(fā)展趨勢(shì)：自動(dòng)化、微型化、高通量培養(yǎng)基滅菌、分裝；倒平板；挑取單菌落、接種；培養(yǎng)；目的產(chǎn)物抽提；測(cè)定；數(shù)據(jù)收集處理等過程單元自動(dòng)化與系統(tǒng)集成自動(dòng)化（通量匹配）,菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國(guó)際進(jìn)展,,FillingUnit分裝速率：400-1200dishes/h分裝量：4-45ml/0.5-0.6sec平動(dòng)規(guī)格：直徑92-98mm可調(diào)高度15-21mm可調(diào)滅菌方式：253.7nm紫外線滅菌尺寸重量：45cm(L)*30cm(D)*61cm(H),15kg★StackingUnit堆疊速率：可調(diào)，與輸送機(jī)自動(dòng)配合。堆疊高度：2-15板平皿，可調(diào)堆疊桌面：500500mm可擴(kuò)充尺寸重量：81cm(L)*49cm(D)*45cm(H),13kg,全自動(dòng)培養(yǎng)基分裝系統(tǒng),750皿/小時(shí),自動(dòng)滅菌培養(yǎng)基制備機(jī),,,,,出發(fā)株,誘變等,10倍稀釋,涂平板,單菌落,初篩,復(fù)篩,工藝,放大,接種,倒平板,培養(yǎng)基,保藏,活化,前處理,檢測(cè),,自動(dòng)細(xì)菌平板稀釋儀,4600個(gè)克隆/小時(shí),,培養(yǎng),,,,出發(fā)株,誘變等,10倍稀釋,涂平板,單菌落,初篩,復(fù)篩,工藝,放大,接種,倒平板,培養(yǎng)基,保藏,活化,前處理,檢測(cè),,,,,出發(fā)株,誘變等,10倍稀釋,涂平板,單菌落,初篩,復(fù)篩,工藝,放大,接種,倒平板,培養(yǎng)基,保藏,活化,前處理,檢測(cè),,培養(yǎng)基分裝,,,,,傳統(tǒng)方法,,高通量方法：96、384、1536/min,,傳統(tǒng)方法：1-2/min（分光光度計(jì)）1/15-30min（HPLC）,,,,,,,出發(fā)株,誘變等,10倍稀釋,涂平板,單菌落,初篩,復(fù)篩,驗(yàn)證,放大,接種,倒平板,培養(yǎng)基,保藏,活化,前處理,檢測(cè),培養(yǎng)基分裝,,,,,1微孔板式反應(yīng)器2微流控式芯片實(shí)驗(yàn)室3搖瓶形式的微型反應(yīng)器,1,2,3,2056valves,256compartmentscontainingbacterialexpressinganenzyme,24個(gè)，5ml,12個(gè)，30ml,24個(gè)，1ml,多通道多參數(shù)微型反應(yīng)器,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用微型反應(yīng)器,左圖4.92.32.2m，整個(gè)箱體有溫濕度控制，箱體內(nèi)，條形碼閱讀器、蓋板站、封板器、液體處理裝置、搖床、光度計(jì)、離心機(jī)、冷藏室等。平行地實(shí)現(xiàn)樣品準(zhǔn)備、運(yùn)行、監(jiān)控768個(gè)（16個(gè)48孔板）。,系統(tǒng)集成自動(dòng)化：四個(gè)層次,,Orbitor工作站,重量輕only55lbs.只有25公斤高可靠性Collisiondetection&recovery沖突檢測(cè)與恢復(fù)Platesensinginthegripper微孔板傳感器Servogripper–doesnotdropaplatewhenthepowergoesout!伺服抓板手-即使停電也不會(huì)讓一個(gè)板子掉落運(yùn)送一塊板子只需4秒鐘Bi-directionaltelescopingarm雙向伸縮手Unlimited3600rotation無限360度轉(zhuǎn)動(dòng)Nohardstops無急停死角Motionblending運(yùn)動(dòng)混合smoothmovements平穩(wěn)移動(dòng),Orbitor結(jié)構(gòu)剖解,Bi-directionaltelescopingarm雙向伸縮抓板手Rotatingbase旋轉(zhuǎn)平臺(tái)Internalre-grip內(nèi)部固定裝置Hotelmountx4板子堆棧*4,1.,4.,3.,2.,操作靈活性,PCdriven微機(jī)控制Nocontrollerrequired無需其它控制裝置Add-onstoragecapability可搭配存儲(chǔ)能力Smallfootprint小的占地空間和軌跡Feedupto4instrumentswithease可連接4臺(tái)儀器Fitswithinawidevarietyofbiosafetycabinets適應(yīng)多種型號(hào)的生物安全柜,內(nèi)容提綱,高通量篩選在微生物育種中的重要意義菌種高通量篩選技術(shù)國(guó)際進(jìn)展高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范,高通量篩選技術(shù),Scaleup,,,Scaledown,微型化,高通量,標(biāo)準(zhǔn)化,對(duì)高通量篩選技術(shù)存在認(rèn)識(shí)上的誤區(qū),認(rèn)為微型化只要按比例縮小即可，忽略參數(shù)相關(guān)性問題；對(duì)操作條件的平行性沒有足夠的認(rèn)識(shí)僅注重培養(yǎng)環(huán)節(jié)高通量，忽略其他步驟匹配和瓶頸的轉(zhuǎn)移問題對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化重于最優(yōu)化的認(rèn)識(shí)不足高通量篩選是提高成功幾率的一種技術(shù)手段,菌種高通量篩選技術(shù)組成,菌種高通量篩選技術(shù),通量匹配,限制瓶頸在不斷克服和轉(zhuǎn)移,菌種高通量篩選技術(shù),菌種高通量篩選技術(shù)是一整套高通量技術(shù)的有機(jī)整合和合理匹配,紅霉素生產(chǎn)菌株的微型化培養(yǎng)及分析,微型化培養(yǎng),就搖瓶與微孔板之間的生理發(fā)酵參數(shù)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了研究，以證實(shí)微型化培養(yǎng)方法的可行性，為紅霉素產(chǎn)生菌高通量篩選奠定了基礎(chǔ)。,微型化培養(yǎng)--動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較,2.1氧氣傳遞系數(shù),2.2物料混合,流場(chǎng)特性,OTR與混合,三、國(guó)家生化工程中心的高通量篩選工作基礎(chǔ),,,,微型化培養(yǎng)--發(fā)酵參數(shù)比較,2.3生物效價(jià),2.4總糖的對(duì)應(yīng)性實(shí)驗(yàn),微型化培養(yǎng)--發(fā)酵參數(shù)比較,2.5還原糖的對(duì)應(yīng)性實(shí)驗(yàn),2.6生物量,微型化培養(yǎng)--裝置圖,種子（挖塊）,發(fā)酵（孔徑2cm）,微型化分析,建立與微型化發(fā)酵培養(yǎng)配套的檢測(cè)方法，才能真正意義上實(shí)現(xiàn)篩選的高通量。生物檢測(cè)法化學(xué)檢測(cè)法,生物檢測(cè)法,生物檢定法又分管碟法和比濁法兩種，管碟法是最常用的生物檢定法，也是我國(guó)2005版之前藥典收錄的唯一一種微生物檢定法。與管碟法比較，比濁法具有快速(檢驗(yàn)僅需3～4h)、易于操作、采用液體培養(yǎng)法、無擴(kuò)散因素影響、靈敏度高和精密度較好等優(yōu)點(diǎn)，適用于絕大部分抗生素和含抗生素樣品的含量測(cè)定。,化學(xué)檢測(cè)法,紅霉素分子在酸性條件下水解生成黃色絡(luò)合物，此顏色與含量成正比，符合朗格爾比色定律。,紅霉素檢測(cè)方法,微型化分析--生物檢測(cè)法,微量比濁法測(cè)定紅霉素生物效價(jià)的可行性,微型化分析--生物檢測(cè)法,微型化分析--生物檢測(cè)法,檢驗(yàn)96孔板的準(zhǔn)確度與精密度,微型化分析--化學(xué)檢測(cè)法,,紅霉素化學(xué)效價(jià)測(cè)定結(jié)果比較,微型化分析--化學(xué)檢測(cè)法,樣品前處理對(duì)紅霉素效價(jià)檢測(cè)的影響分析,微型化分析--化學(xué)檢測(cè)法,,高通量化學(xué)檢測(cè)方法驗(yàn)證,標(biāo)準(zhǔn)品加入法是在樣品溶液中加入一系列梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行顯色測(cè)定，然后按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟測(cè)定吸光度,繪制吸光度-加入濃度曲線,用外推法求得樣品溶液的濃度。兩條直線切入橫座標(biāo)上所間的距離，即是樣品中紅霉素的化學(xué)效價(jià)，為47.8μ/ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定的結(jié)果為48.02μ/ml，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.00324,Y1=0.0046X-0.0164,Y2=0.0046X+0.2202,高通量（微型化）抗生素效價(jià)分析方法,生物效價(jià)高通量分析方法：基于比濁法原理設(shè)計(jì)生物效價(jià)高通量分析方法，使分析時(shí)間從20多小時(shí)縮短到4小時(shí)，分析樣品量從1ml降到10ul，鑒定菌培養(yǎng)基從30ml降到90ul，一次檢測(cè)樣品數(shù)量可達(dá)到成百上千份，而且僅需1人操作，傳統(tǒng)生物效價(jià)分析，每天每人分析樣品數(shù)量50份左右。?化學(xué)效價(jià)高通量分析方法：開發(fā)了可以與自動(dòng)化液體處理工作站相匹配的微量化化學(xué)分析路線，篩選通量更高，樣品檢測(cè)體積更小，反應(yīng)體積從20ml降到500ul，檢測(cè)體積從5ml降到100ul，分析時(shí)間更短，1小時(shí)之內(nèi)完成上千份樣品分析。?,微型化平臺(tái)應(yīng)用,單菌落培養(yǎng),高通量培養(yǎng)技術(shù),裝液量：500—2000ul,24孔,48孔,96孔,固體培養(yǎng)和菌種保藏,可滅菌、重復(fù)使用壽命長(zhǎng)、成本低、易清洗、能統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)、防交叉污染、透氣性好、防止水分蒸發(fā),孔板蓋,微孔板固定架,板數(shù)：882＝128,孔數(shù)：12824＝307212848＝614412896＝12288,多通道可調(diào)深孔板取樣適配器,專用菌落瓊脂柱打孔器,微型化平臺(tái)應(yīng)用,對(duì)誘變后96個(gè)菌株分別進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)和微型化培養(yǎng)，5天后測(cè)定其生物活性，結(jié)果如圖。,微型化平臺(tái)應(yīng)用,微型化平臺(tái)應(yīng)用,總結(jié)：高通量篩選技術(shù)的優(yōu)勢(shì)（1）,操作平行性結(jié)果可比性效率(一周到一個(gè)月完成常規(guī)方法一年的工作量)成本：人力、時(shí)間、空間、經(jīng)濟(jì),總結(jié)：高通量篩選技術(shù)的優(yōu)勢(shì)（2）,1.高產(chǎn)菌株的篩選數(shù)量性狀：1—多關(guān)系，無模型，依靠篩選數(shù)量如：賴氨酸高產(chǎn)菌株篩選質(zhì)量性狀：0—1關(guān)系，有模型，無需龐大篩選數(shù)量。如：賴氨酸缺陷菌株篩選其他：各種氨基酸、有機(jī)酸、維生素、抗生素、生物基產(chǎn)品等高產(chǎn)篩選,總結(jié)：高通量篩選技術(shù)的優(yōu)勢(shì)（3）,2.發(fā)酵原材料（培養(yǎng)基）的生物檢驗(yàn)直接檢驗(yàn)原材料的應(yīng)用效果精細(xì)調(diào)節(jié)原材料的配比和用量不同原材料與菌株的對(duì)應(yīng)關(guān)系特點(diǎn)：建立原材料數(shù)據(jù)庫(kù)和菌株數(shù)據(jù)庫(kù)長(zhǎng)期性、基礎(chǔ)性工作,謝謝！,