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胰島細胞自身抗體的檢測及其臨床意義,.,,公司簡介,深圳市伯勞特生物制品有限公司是深圳市高新技術(shù)企業(yè)。公司有多年從事免疫類產(chǎn)品研究的專業(yè)人才和豐富臨床經(jīng)驗的醫(yī)學(xué)專家。在國內(nèi)外醫(yī)學(xué)專家的指導(dǎo)下，致力于最新一代診斷試劑的開發(fā)經(jīng)營。,.,概 述,糖尿病 （diabetes）是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各種致病因子作用于機體導(dǎo)致胰島功能減退、胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)等而引發(fā)的糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合征，臨床上以高血糖為主要特點，典型病例可出現(xiàn)多尿、多飲、多食、消瘦等表現(xiàn)，即“三多一少”癥狀。,.,糖尿病分型診斷的主要依據(jù),(1) 臨床資料 ：起病年齡 、種族 、是否需要胰島素治療、家族史、起病時的體質(zhì)指數(shù) ； (2)胰島自身抗體 ：GADA、ICA、IAA、IA-2 (3)HLA—II基因型； (4)胰島功能：如 C肽測定 。 準確的分型是實施預(yù)防及治療的基本前提,.,1型糖尿病,1型糖尿?。鹤陨砻庖呦到y(tǒng)錯誤地攻擊和損傷胰島β細胞，使胰島素的合成和分泌減少或完全缺乏的自身免疫性疾病 診斷依據(jù)：空腹胰島素低于5μIU/ml（國際單位），空腹血糖超過6.8mmol/L（毫摩爾)以上,胰島細胞自身抗體檢測陽性,.,1型糖尿病的病因,1、遺傳因素（發(fā)病基礎(chǔ)） 2、免疫因素：有胰島炎存在，且T、B 淋巴細胞浸潤現(xiàn)象顯著。 3、病毒感染因素：柯薩奇病毒，風疹病毒，巨細胞病毒，腮腺炎病毒等 。 4、環(huán)境因素：包括嬰兒期牛奶喂養(yǎng)、預(yù)防接種疫苗、氣候、地理、毒素以及應(yīng)激等，促使1型糖尿病的發(fā)病。,.,1型糖尿病的病因,絕大多數(shù)1型糖尿病是自身免疫性疾病、遺傳因素和環(huán)境因素共同參與其發(fā)病過程。某些外界因素作用于有遺傳易感性的個體，激活了T淋巴細胞介導(dǎo)的一系列自身免疫反應(yīng)，引起選擇性胰島β細胞破壞和功能衰竭，體內(nèi)胰島素分泌不足進行性加重，導(dǎo)致糖尿病。,.,1型糖尿病 LADA,成人遲發(fā)型（隱匿性）自身免疫性糖尿?。↙ADA）早期表現(xiàn)為起病緩慢、年齡偏大、無酮癥出現(xiàn)和常伴有肥胖，不易與I-DM鑒別，但胰島細胞自身抗體檢測為陽性，表明胰島β細胞功能已發(fā)生漸進性破壞，病情緩慢發(fā)展，一定時間后發(fā)展為I-DM。 LADA是1型糖尿病的一個亞型，以在遺傳與環(huán)境多種因素參與下，胰島β細胞發(fā)生緩慢的進行性損傷直至功能衰竭為特征。,.,LADA診斷標準： 1、發(fā)病年齡≥30 2、胰島細胞自身抗體陽性 3、診斷后至少6個月不需要胰島素治療 它具有胰島自身免疫異常，胰島β細胞遭自身免疫破壞，隨后可出現(xiàn)β細胞功能明顯降低，最終口服抗糖尿病藥物失效，必須使用胰島素來控制病情。,1型糖尿病 LADA,.,2型糖尿病,以胰島素抵抗(體內(nèi)周圍組織對胰島素的敏感性降低，外周組織如肌肉、脂肪對胰島素促進葡萄糖的吸收、轉(zhuǎn)化、利用發(fā)生了抵抗)為主伴胰島素分泌不足，導(dǎo)致血糖升高的代謝性疾病。 發(fā)病因素：遺傳、肥胖、年齡和飲食等。 診斷依據(jù)：空腹胰島素水平高于5.5μIU/ml（國際單位）但同時并存有高血糖，即空腹血糖高于6.8mmol/L（毫摩爾）以上時即可診斷為2型糖尿病。,.,其他特殊類型糖尿病,①胰島B細胞功能缺陷; ②胰島素作用的遺傳缺陷; ③胰島外分泌疾病; ④內(nèi)分泌疾病; ⑤藥物或化學(xué)物誘導(dǎo); ⑥感染; ⑦免疫介導(dǎo)伴糖尿病的其他遺傳綜合征; ⑧妊娠糖尿病。,.,概 述,1型糖尿?。涸跓o癥狀期及發(fā)病后一定時期中，可檢出針對胰島β細胞的自身抗體 臨床意義較大的為：胰島細胞抗體(ICA)、谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)、胰島素自身抗體(IAA)、蛋白酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A) 確認免疫介導(dǎo)1型糖尿病，主要依賴在糖尿病患者中檢出針對胰島β細胞各種抗原的自身免疫抗體,.,概 述,非糖尿病患者胰島細胞自身抗體陽性可預(yù)示以后發(fā)展為糖尿病的可能，2型糖尿病陽性患者說明以后可能產(chǎn)生嚴重的胰島功能損害，進而轉(zhuǎn)變?yōu)?型糖尿病。因此糖尿病自身抗體被認為是2型向1型轉(zhuǎn)化的標志。,.,胰島細胞抗體(ICA),針對胰島細胞內(nèi)所具有的胞質(zhì)成分的多種抗原的混合抗體 它是1型糖尿病預(yù)測中應(yīng)用最早的免疫學(xué)標志，在1型糖尿病患者“健康”一級親屬陽性率達到30%,.,胰島細胞抗體(ICA),,ICA陽性預(yù)示胰島β細胞的自身免疫損害，ICA陽性與將來成為臨床期1型糖尿病有關(guān)，高滴度的ICA預(yù)測性更強 兒童中ICA陽性亦對1型糖尿病有較高的預(yù)測率。,.,在新診斷中1型糖尿病中陽性率為60%～90%，發(fā)病幾年前即可陽性，存在時間短，通常在臨床起病后2-3年內(nèi)消失。約10-15%病人持續(xù)陽性，往往伴有甲狀腺和胃壁細胞自身抗體，同時存在其他自身免疫性內(nèi)分泌腺病。,胰島細胞抗體(ICA),.,胰島素自身抗體(IAA),IAA是一組能與胰島素結(jié)合的抗體。 抗胰島素抗體有兩種 抗胰島素自身抗體，屬自身免疫抗體 使用了外源性胰島素產(chǎn)生的抗體。 IAA不是糖尿病的特異抗體，在胰島素自身免疫綜合征、甲狀腺疾病也可出現(xiàn)，甚至不少正常人也為陽性,.,胰島素自身抗體(IAA),單純IAA陽性對進展為1型糖尿病的預(yù)測價值是較低的，單純的IAA陽性不能作為1型糖尿病的標志，僅表明有進展為糖尿病的自身免疫傾向。 陽性率隨年齡的增加而下降，并與HLA基因型有關(guān)。據(jù)報道，5歲以下兒童新診斷1型糖尿病的病人陽性率為50%,滴度也較高。,.,谷氨酸脫羧酶抗體(GADA),谷氨酸脫羧酶（GAD）是人體正常的蛋白酶，催化谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?氨基丁酸，參與胰島β細胞合成與分泌胰島素。 在患者出現(xiàn)1型糖尿病臨床表現(xiàn)前數(shù)年甚至十余年即可出現(xiàn)，是最早出現(xiàn)的自身抗體 。 目前認為GAD是破壞胰島細胞，引起1型糖尿病的關(guān)鍵抗原，并且極可能是1型糖尿病自身免疫的始動靶抗原。,.,GADA可作為1型糖尿病預(yù)測的指標，在初發(fā)1型糖尿病患者中，GADA的檢出率很高，一般為60%～80%，最多的可達96%，而2型糖尿病和正常人中的檢出率很低(1%～2%) 國外報道在糖尿病前期個體中有82%的GADA陽性，可作為普查手段，篩查1型糖尿病的高危人群和個體,谷氨酸脫羧酶抗體(GADA),.,谷氨酸脫羧酶抗體(GADA),GADA陽性還可見于僵人綜合癥、Graves病（毒性彌漫性甲狀腺腫 ）及不伴1型糖尿病的多發(fā)性自身免疫內(nèi)分泌腺?、裥筒∪?它與柯薩奇病毒具有相似氨基酸片段，能特異的與HLA分子結(jié)合并被呈遞給T淋巴細胞，導(dǎo)致胰島β細胞損傷和1型糖尿病。,.,GADA可作為成人遲發(fā)自身免疫性糖尿病(LADA)的預(yù)測和早期診斷指標，此類患者常可出現(xiàn)GADA的高水平，并穩(wěn)定維持 與ICA和IAA相比，GADA與LADA關(guān)系更密切，可以將LADA與2型糖尿病區(qū)別開來，為正確分型提供確切的指標，從而更好地指導(dǎo)治療。,谷氨酸脫羧酶抗體(GADA),.,蛋白酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A),蛋白酪氨酸磷酸酶(IA-2)是1型糖尿病重要的胰島細胞自身抗原，是自身反應(yīng)性T淋巴細胞的靶分子， IA-2有13個T細胞抗原肽，它的主要抗原肽與麻疹病毒、巨細胞病毒、人輪狀病毒等多種病毒以及牛奶、豆類等食物蛋白的氨基酸序列有高度相似性，因此T細胞有可能被上述病毒或食物蛋白激活，觸發(fā)胰島細胞自身免疫反應(yīng)是胰島細胞破壞。,.,蛋白酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A),IA-2A對胰島β細胞損害的標志性作用比GADA更具特異性，IA-2A在1型糖尿病初診后多年仍存在，對1型糖尿病診斷價值較大 IA-2A在1型糖尿病患者的一級親屬中抗體陽性預(yù)報率較高，可作為1型糖尿病高危人群篩查指標,.,蛋白酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A),檢測IA-2A對于1型糖尿病的診斷與預(yù)測有著重要的臨床意義。 但IA-2A主要與經(jīng)典的1型糖尿病相關(guān)，對LADA的診斷價值遠不如GADA，在LADA的診斷中，IA-2A的檢測需與其它胰島細胞自身抗體聯(lián)合進行。,.,胰島自身抗體檢測的臨床意義,指導(dǎo)糖尿病臨床分型 預(yù)測β細胞功能衰竭 在高危人群中篩查1型糖尿病 預(yù)測治療的療效,.,指導(dǎo)糖尿病臨床分型,1型糖尿病的臨床表現(xiàn)存在明顯的差異 經(jīng)典1型糖尿病常以酮癥酸中毒的方式急性起病，以青少年為多數(shù) LADA則如同2型糖尿病患者一樣緩慢發(fā)展，在成年后起病，最初并不依賴胰島素 LADA的診斷依靠胰島自身抗體的檢測,.,血清胰島自身抗體是胰島β細胞自身免疫破壞的標志 至少有一種以上胰島自身抗體陽性是LADA診斷的重要依據(jù) 多種抗體聯(lián)合檢測更有助于鑒別LADA和2型糖尿病。,,指導(dǎo)糖尿病臨床分型,.,指導(dǎo)糖尿病臨床分型,聯(lián)合檢測GAD、ICA、IAA及IA-2抗體是預(yù)測1型糖尿病最可靠的免疫學(xué)標志。 98%新診斷的1型糖尿病病人至少一種抗體陽性，80%存在兩種以上抗體，而對照人群無一人存在兩種以上抗體。,.,指導(dǎo)糖尿病臨床分型,為了排除可能的干擾，對于IAA陽性者，還需要注意是否接受過胰島素治療，如接受過胰島素治療，其療程必須小于2周。,.,胰島自身抗體檢測的臨床意義,指導(dǎo)糖尿病臨床分型 預(yù)測β細胞功能衰竭 在高危人群中篩查1型糖尿病 預(yù)測治療的療效,.,預(yù)測β細胞功能衰竭,I-DM的形成一般歷經(jīng)下面四個階段： ①遺傳易感性+環(huán)境因素（病毒、化學(xué) 毒性物質(zhì)和飲食）誘發(fā) ②自身抗體的出現(xiàn) ③胰島素分泌逐漸喪失 ④糖尿病,.,血清抗體在預(yù)測β細胞功能衰竭時， ICA的陽性預(yù)測值要高于GADA和IA-2A。 在診斷糖尿病后，大多數(shù)患者GADA可持續(xù)陽性 而ICA陽性患者隨病程進展可變成ICA陰性，這種陰性亦提示已經(jīng)出現(xiàn)β細胞功能的衰竭。,預(yù)測β細胞功能衰竭,.,胰島自身抗體檢測的臨床意義,指導(dǎo)糖尿病臨床分型 預(yù)測β細胞功能衰竭 在高危人群中篩查1型糖尿病 預(yù)測治療的療效,.,美國1型糖尿病預(yù)防試驗(Diabetes prevention trial type1)中，對1型糖尿病患者親屬中的非糖尿病個體進行了ICA、IAA、GADA和IA-2A抗體篩查 結(jié)果發(fā)現(xiàn)5.9%的個體有一種抗體陽性，2.3%有2種以上的抗體陽性,在高危人群中篩查1型糖尿病,.,多種抗體聯(lián)合篩查敏感性進一步提高 在隨訪中有些最初僅一種抗體陽性者可轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾N抗體陽性。,在高危人群中篩查1型糖尿病,.,1型糖尿病可能會從胎兒或嬰兒時就已經(jīng)開始，1型糖尿病孕婦在臍帶血中可以檢測到糖尿病相關(guān)的自身抗體，這些抗體可能經(jīng)過血循環(huán)而傳遞給胎兒，臍帶血抗體陽性可能反映胎兒的β細胞已經(jīng)存在自身免疫,在高危人群中篩查1型糖尿病,.,在高危人群中篩查1型糖尿病,抗體陽性孕婦的嬰兒發(fā)生糖尿病的危險性為2%～3%，對于這些特殊群體，進行臍帶血糖尿病相關(guān)抗體檢測可有助于嬰幼兒糖尿病的早期發(fā)現(xiàn)與干預(yù)。,.,胰島自身抗體檢測的臨床意義,指導(dǎo)糖尿病臨床分型 預(yù)測β細胞功能衰竭 在高危人群中篩查1型糖尿病 預(yù)測治療的療效,.,預(yù)測治療的療效(胰島移植),部分患者移植后血清GADA和IA-2A抗體水平可升高，原來陰性者可出現(xiàn)陽性，這提示胰島移植引起了自身抗原再次暴露給免疫系統(tǒng)，誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，這部分患者移植成功、不依賴胰島素的比例較低,.,預(yù)測治療的療效(胰島移植),移植前后自身抗體均為陰性的糖尿病患者，移植成功、不依賴胰島素的比例較高。 故GADA和IA-2A抗體可預(yù)示胰島移植后的效果，其中以GADA水平的變化更為重要,.,預(yù)測治療的療效(干預(yù)治療),1型糖尿病的干預(yù)治療主要是阻斷胰島β細胞進行性的自身免疫性破壞，保護殘存胰島β細胞，從而延緩病情進展。有資料表明： I-DM患者有剩余β細胞功能者，比無剩余β細胞功能者在強化胰島素治療后血糖控制更好。 有多種藥物進入研究。目前在臨床上可應(yīng)用免疫抑制劑（如環(huán)孢霉素等）,.,預(yù)測治療的療效(干預(yù)治療),免疫抑制劑—環(huán)孢霉素可抑制血清ICA、IAA水平，環(huán)孢霉素干預(yù)治療后胰島β細胞功能可有所恢復(fù)，C肽水平升高，部分患者出現(xiàn)臨床緩解（蜜月期）而不需要胰島素治療,.,預(yù)測治療的療效(干預(yù)治療),血清IA-2A狀態(tài)對預(yù)測療效有較大的價值。 IA-2A陰性者C肽水平升高更為明顯，臨床緩解率更高，復(fù)發(fā)率（再出現(xiàn)依賴胰島素）較低。 環(huán)孢霉素本身對血清IA-2A水平無影響，環(huán)孢霉素治療后血清IA-2A的陽性率以及滴度水平無明顯變化。,.,預(yù)測治療的療效(干預(yù)治療),GADA亦可預(yù)示環(huán)孢霉素等應(yīng)用后β細胞恢復(fù)情況 GADA常用于1型糖尿病的免疫預(yù)防監(jiān)測， 1型糖尿病病情好轉(zhuǎn)與血清GADA轉(zhuǎn)陰有相關(guān)關(guān)系 GADA是目前療效監(jiān)測的較好指標。,.,小 結(jié),胰島自身抗體檢測有著重要的臨床意義，這些自身抗體在1型糖尿病中出現(xiàn)情況、時間和強度并不一致，用于診斷則各抗體的敏感性和特異性均不同。 各個自身抗體有其各自的特點和臨床價值， 并將隨著研究方法的發(fā)展發(fā)揮越來越多的作用,.,小 結(jié),單一抗體檢測結(jié)果應(yīng)用于臨床常有較大的局限性。 目前國際上逐漸達成一種共識，即聯(lián)合檢測多種抗體可提高1型糖尿病診斷和篩查的敏感性、特異性和準確性，為臨床工作提供更多有價值的參考。,.,產(chǎn)品檢測原理,將胰腺細胞提取的混合蛋白抗原（含有胰島素、谷氨酸脫羧酶和胰島細胞抗原等多種細胞蛋白成份）用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳(PAGE)按分子量大小依次分開，再通過印跡技術(shù)轉(zhuǎn)移至印跡膜上，其印跡膜條上即含有按分子量大小不同排列的各種胰島細胞自身抗原成份。將其放入反應(yīng)槽與待測血清反應(yīng)，如待測血清含有自身抗體，將會分別與相應(yīng)抗原結(jié)合，再加入酶聯(lián)免疫顯色試劑，就會在抗原、抗體結(jié)合位置出現(xiàn)顯色區(qū)帶，與標準帶對照即可判斷待測血清中含有何種抗體。,.,.,產(chǎn)品用途,用于糖尿病分型診斷，同時為臨床糖 尿病治療、預(yù)測和預(yù)防提供重要的參考 依據(jù)。,.,標本要求,靜脈取血2－5ml，置干燥試管待凝固后離心分離血清，如當日不能檢測血清標本保存于－20℃ ，嚴重溶血、有絮狀物或霉變的血清標本會影響測試。 本檢查無任何禁忌癥，不需要空腹可隨時采血檢測。,.,糖尿病自身抗體免疫印跡試劑盒的 操作步驟,實驗要準備的材料： 蒸餾水若干； 1000ul可調(diào)加樣槍一支、10ul加樣槍一支及相應(yīng)的加樣槍吸嘴若干； 500ml帶蓋子有刻度的干凈瓶子； 搖床一臺； 廢物桶一個等。,.,1 在量杯中將濃縮洗滌液用蒸餾水按 1：20 的比例稀釋成洗滌應(yīng)用液。 ( 在2-8℃貯存的濃縮洗滌液會有結(jié)晶析出，將整瓶（25ml）濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋至500ml，放入試劑瓶中，標簽上注明配制時間，保存于2-8℃，有效期6個月，如有絮狀物或霉變應(yīng)廢棄。) 2 每槽加入工作液1ml，放在搖床上搖動5分鐘后直接加入待測血清或全血10ul， 放在搖床上搖動30分鐘。 3 取出反應(yīng)槽，棄去槽中液體，并在平鋪的紙巾上將其倒置輕磕以拍干剩余液體，每槽加入洗滌液1ml，搖動洗滌5分鐘，棄去槽中液體，并在平鋪的紙巾上將其倒置輕磕以拍干剩余液體，重復(fù)洗滌3次；,糖尿病自身抗體免疫印跡試劑盒的操作步驟,.,4每槽加入工作液1000ul，再加入酶聯(lián)試劑20ul，放在搖床上搖動30分鐘。 5 取出反應(yīng)槽，棄去槽中液體，并在平鋪的紙巾上將其倒置輕磕以拍干剩余液體，每槽加入洗滌液1ml，搖動洗滌5分鐘，棄去槽中液體，并在平鋪的紙巾上將其倒置輕磕以拍干剩余液體，重復(fù)洗滌3次； 6 加入顯色劑 1ml， 置搖床上反應(yīng)5-6分鐘。 7 棄去液體，用自來水沖洗后取出印跡膜，等干后對比《標準帶》判斷結(jié)果。,.,結(jié)果判斷,將印跡膜上起始線與標準帶起始線對齊，觀察陽性顯色區(qū)帶與 對應(yīng)的標準帶位置即可判斷顯色區(qū)帶是何種自身抗體。,,,,,糖尿病抗體免疫印跡檢測之結(jié)果判斷 相關(guān)抗體 相應(yīng)條帶 ICA（IA-2A）—120KD 胰島細胞抗體 ICA—64KD ICA—40KD 谷氨酸脫羧酶抗體 GADA—65KD 胰島素抗體 IAA—5.8KD,.,55,糖尿病自身抗體免疫印跡試劑盒特點,國內(nèi)唯一糖尿病自身抗體免疫印跡檢測試劑； 聯(lián)合檢測，同時檢測多種抗體（IA-2A 、ICA、GADA、IAA）； 取材方便，操作簡單； 特異性強（99.6%）； 敏感性高（98%）； 可隨時進行檢測（單人份或多人份）。,.,,謝謝,.,