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1ICS 07.080A 21中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)GB/T XXXXX—201X 動(dòng)物源性 I 型膠原蛋白成分測(cè)定 聚丙烯酰胺凝膠電泳法Determination of the triple helix structural of creatural type Ι collagen——Polyacrylamide gel electrophoresis（征求意見稿）201X-XX-XX 發(fā)布 201X-XX-XX 實(shí)施中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 質(zhì) 量 監(jiān) 督 檢 驗(yàn) 檢 疫 總 局中 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn) 化 管 理 委 員 會(huì)發(fā) 布GB/T××××—201× 前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照 GB/T 1.1—2009 給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位： 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：GB/T××××—201×1動(dòng)物源性 I 型膠原蛋白成分測(cè)定 聚丙烯酰胺凝膠電泳法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物源性 I 型膠原蛋白成分測(cè)定聚丙烯酰胺凝膠電泳法的原理、試劑材料、儀器設(shè)備、操作步驟、結(jié)果分析。本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物源性 I 型膠原 三股螺旋結(jié)構(gòu)測(cè)定。2 規(guī)范性引用文件 下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 9695.23 肉與肉制品羥脯氨酸含量測(cè)定GB/T 23527 蛋白酶制劑GB/T 6682-2008 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB 601—1988 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的配制和標(biāo)定NYT 1663-2008 乳與乳制品中 β-乳球蛋白的測(cè)定 聚丙烯酰胺凝膠電泳法YY/T 1453-2016 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 Ⅰ型膠原蛋白表征方法YY/T 0606.6—200* 組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第 6 部分：I 型膠原蛋白3 術(shù)語(yǔ)與定義本標(biāo)準(zhǔn)下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1I 型膠原 type I collagen在廣泛存在于動(dòng)物體中的一種結(jié)構(gòu)蛋白，起到支撐作用并能聚集成纖維，是膠原纖維組分中的一部分。4 原理I 型膠原經(jīng)特異的膠原酶水解 ，經(jīng)電泳判斷三螺旋結(jié)構(gòu)。5 試劑材料GB/T××××—201×2除非另有說(shuō)明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的數(shù)據(jù)；實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合 GB/T 6682 中一級(jí)水的規(guī)定。5.1 4 mol/L 鹽酸溶液量取 36 mL 濃鹽酸（HCl）注入 50mL 水中，定容至 100mL，混勻，按照 GB 601—1988 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的配制和標(biāo)定中方法進(jìn)行標(biāo)定。5.2 蛋白酶溶液精確稱取 2800 U/mg 酶活力的 胃蛋白酶，配制成胃蛋白酶量分別為 10 000 ~ 20 000 U/g 的溶液。5.3 0.5 mol/L 乙酸取冰醋酸 15mL，加水稀釋并定容到 500 mL。5.4 1 mol/L 濃縮膠緩沖液貯備液，pH 6.8稱取 6.06 g 三羥甲基氨基甲烷，加適量水溶解，用鹽酸調(diào) pH 值至 6.8，用水定容至 50 mL，4 °C下保存。5.5 分離膠緩沖液貯備液，1.5mol/L，pH 8.8稱取 9.08 g 三羥甲基氨基甲烷，加適量水溶解，用鹽酸調(diào) pH 值至 8.8，用水定容至 50 mL，4 °C下保存。5.6 丙烯酰胺單體貯備液稱取 14.55 g 丙烯酰胺和 0.45 g N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺 ，先用 40 mL 水溶解，攪拌，直至溶液變澄清透明，再用水稀釋至 50 mL，過(guò)濾，備用。該貯備液在 4℃下棕色瓶中可保存一個(gè)月。5.7 100 g/L 十二烷基磺酸鈉溶液準(zhǔn)確稱取 5 g 十二烷基磺酸鈉，用水溶解定容至 50mL，室溫保存；5.8 10%（v/v）N, N, N’, N’-四甲基乙二胺溶液量取 0.10 mL N, N, N’, N’-四甲基乙二胺 ，加水稀釋定容至 1.00 mL，貯存于 4℃。5.9 10%（w/v）過(guò)硫酸銨溶液稱取 0.1 g 過(guò)硫酸銨，加入 1 mL 的去離子水，將固體粉末徹底溶解，貯存于 4℃。另外，使用前配制.5.10 電極緩沖液，pH 8.3稱取 3.0 g 三羥甲基氨基甲烷，14.4 g 甘氨酸，1.0 g 十二烷基磺酸鈉，加入十二烷基磺酸鈉溶液10 mL，溶解，用鹽酸調(diào) pH 值至 8.3，加水定容至 1000mL；5.11 0.08 mol/L 樣品緩沖液精確稱取 4 mg 溴酚藍(lán)，溶解于 5.00 mL 水中，分別量取 1.60 mL 濃縮膠緩沖液貯備液、4.00 mLGB/T××××—201×3十二烷基磺酸鈉溶液、2.20 mL 丙三醇，全部混合后用水稀釋定容至 20 mL, 4 °C 保存。此溶液用于非還原 SDS-PAGE。如用于還原 SDS-PAGE，則再加 2mL β-巰基乙醇；5.12 2.5 g/L 考馬斯亮藍(lán)熱色液，稱取 0.25 g 考馬斯亮藍(lán) R-250 和 10 g 硫酸銨，分別加入 20 mL 乙醇、10 mL 磷酸，溶解混勻，用水定容至 100 mL。5.13 脫色液用量筒分別量取 50 mL 甲醇或者乙醇、75 mL 乙酸、875 mL 水，待溶液混和均勻后加入的廣口瓶；備用。5.14 固定液取量 250mL 乙醇，60mL 冰醋酸，加水稀釋至 500mL。 5.15 1.00mg/mLI 型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液精確稱取 0.0100g I 型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度 ≥90%） ，用樣品緩沖液定容至 10mL，4°C 下保存。6 儀器與設(shè)備6.1 天平，感量 0.0001 g6.2 電泳儀6.3 電泳槽，100mm×83mm6.4 微量注射器，10 μL6.5 離心機(jī)，不低于 8000 r/min。6.6 凝膠成像儀6.7 薄層成像掃描儀7 操作步驟7.1 試樣制備7.1.1 膠原原樣試樣前處理稱取 1g 樣品，精確到 0.1mg，加適量 0.5M 乙酸溶解，定容至 10mL。取 10mL 液體樣品，磁力攪拌器攪拌 4h，離心 5min，取上清液分裝，在 4℃保存，備用。7.1.2 膠原制品試樣前處理支架材料：將膠原支架裁剪成尺寸為 10 mm×10 mm×24 mm 的試樣，浸泡在 PBS 溶液中，以備實(shí)驗(yàn)使用。按 7.1.1 操作。 GB/T××××—201×4補(bǔ)片：將膠原補(bǔ)片裁剪成尺寸為 10 mm×10 mm×24 mm 的試樣；再將裁剪后的試樣清洗浸泡在0.1%~40% (W/V)的堿溶液中，浸泡 0.5 ~ 24h。清洗至 PH 為 5 ~ 8 后生理鹽水浸泡約 0.5 - 48h，瀝去多余水分，2 ~ 8℃組織搗碎后分散進(jìn)酶解液中，2 ~ 40℃環(huán)境酶解 1 ~ 72h；酶解完畢后調(diào) PH 值至 7 ~ 13，2 - 40℃靜置 2 ~ 24h；30~150 目濾網(wǎng)過(guò)濾，去除未酶解物。20%-50%(W/V)鹽溶液鹽析，收集固形物，截留分子量為 4000~8000 的透析袋透析，去除多余離子和雜質(zhì)，獲得多型膠原，最后將多型膠原混合物分散至水中，調(diào) pH 值至 1~5，30~150 目濾網(wǎng)過(guò)濾，去除析出物，將濾液鹽析后透析，即可得到膠原。按 7.1.1 操作。敷料：將膠原敷料裁剪成尺寸為 10 mm×10 mm×24 mm 的試樣，浸泡在 PBS 溶液中，以備實(shí)驗(yàn)使用。按 7.1.1 操作。7.2 前處理將待測(cè)的 7.1 的樣品平均分成兩組，每組兩只試管。一組暫不做處理，稱 A 管，另一組于 60℃水浴進(jìn)行加熱 30min，稱為 B 管 。將兩組樣品中分別加入 10 000 ~ 20 000 U/g 胃蛋白酶溶液，在 20℃（酶最適溫度）反應(yīng) 5min 后取出。取 A、B 反應(yīng)液，加入樣品制備液， 100℃加熱 5min 以使蛋白質(zhì)變性，制備電泳樣品。7.3 分離膠制備按表 1 配制 12%分離膠 20mL，混勻后加入到長(zhǎng)短玻璃間的縫隙中，約 60mm~70mm 高。沿長(zhǎng)玻璃板板壁緩慢注入約 5mm 高的水，進(jìn)行水封。約 30min 后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合，傾倒去水封層的水，再用濾紙條吸去多余水分。表 1 不連續(xù)凝膠的凝膠配方貯液 3%濃縮膠 12%分離膠丙烯酰胺單體貯備液 2.5 mL 12 mL濃縮膠緩沖液貯備液 0.6 mL /分離膠緩沖液貯備液 / 7.5 mL十二烷基磺酸鈉溶液 50 μL 300 μL水 1.82 mL 10 μLN, N, N’, N’-四甲基乙二胺溶液 5 μL 20 μL過(guò)硫酸銨溶液 25 μL 200 μL7.4 濃縮膠制備按表 1 配制 3 % 濃縮膠 10 mL，混勻后加入到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約GB/T××××—201×55mm 處。輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，約 30min 后凝膠聚合，再放置 20min ~ 30min，使凝膠老化。7.5 裝槽取出已配好的凝膠板，夾于電泳裝置相應(yīng)的位置上，取出樣品梳，將電極緩沖液注滿電泳槽前后槽。7.6 上樣在供試品孔中加入電泳樣品，標(biāo)注好各樣品位置。7.7 電泳把電泳裝置和電泳儀正確連接，調(diào)電壓 150V，開始電泳，待藍(lán)色條帶約泳動(dòng)到濃縮膠與分離膠交接處時(shí)，調(diào)電壓 200V 繼續(xù)電泳，等藍(lán)色條帶到底部時(shí)停止電泳。7.8 固定電泳完畢，取出膠片，置固定液中 30 分鐘。7.9 染色從固定液中取出膠片，置染色液中約 0.5 小時(shí)。7.10 脫色用脫色液脫色至凝膠背景透明。7.11 保存脫色完畢后，凝膠保存在保存液中。7.12 結(jié)果處理待凝膠在保存液中完全透明后可使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行拍照，轉(zhuǎn)換成電子數(shù)據(jù)后再進(jìn)行進(jìn)一步處理。結(jié)果分析：A、B 兩組樣品，經(jīng)過(guò)電泳之后，如果 B 組蛋白沒(méi)有分子量小于 10 萬(wàn)以下的肽鏈，而 A 組樣品中有分子量小于 10 萬(wàn)以下的肽鏈出現(xiàn)，則可判定為此膠原具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)；如果 A，B 兩組蛋白均有分子量小于 10 萬(wàn)以下的肽鏈出現(xiàn)，則可判定為此 I 型膠原三螺旋結(jié)構(gòu)保留不完整。7.13 分析用光密度計(jì)對(duì)凝膠進(jìn)行測(cè)定分析，根據(jù)光密度值計(jì)算 I 型膠原的含量。8 結(jié)果分析按照式（1）計(jì)算：GB/T××××—201×6??=????????????????×????????×??????×??1??2×??×100 (1)式中：ODs ——試樣溶液中 I 型膠原蛋白的光密度值；Cstd ——標(biāo)準(zhǔn)溶液中 I 型膠原蛋白的濃度（mg/mL） ；Vs ——樣品定容體積（mL） ；Odstd ——I 型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的光密度值；V2——式樣的上樣體積（μL） ；V1—— I 型膠原標(biāo)準(zhǔn)溶液上樣體積（μL） ；F ——稀釋倍數(shù)；m——式樣的質(zhì)量（g） 。__________________________