《（江蘇專(zhuān)版）2019版高考生物二輪復(fù)習(xí) 專(zhuān)題八 現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題講義（含解析）.doc》由會(huì)員分享，可在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)《（江蘇專(zhuān)版）2019版高考生物二輪復(fù)習(xí) 專(zhuān)題八 現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題講義（含解析）.doc（51頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題 [理清——知識(shí)聯(lián)系] [記清——主干術(shù)語(yǔ)] 1．基因工程操作中用到的基本工具有限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和載體。 2．限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識(shí)別特定的核苷酸序列，并在特定的位點(diǎn)上進(jìn)行切割。 3．質(zhì)粒是常用的載體，它是一種小型的環(huán)狀DNA分子，具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)及標(biāo)記基因。 4．基因工程的基本操作程序：目的基因的獲取→基因表達(dá)載體的構(gòu)建→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定。 5．基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。 6．目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞常用顯微注射法，導(dǎo)入微生物細(xì)胞常用感受態(tài)細(xì)胞法。 7．檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因常用DNA分子雜交技術(shù)，檢測(cè)目的基因是否進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄同樣是采用分子雜交技術(shù)，檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)常用抗原—抗體雜交技術(shù)。 8．蛋白質(zhì)工程的操作過(guò)程：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因)→基因表達(dá)→產(chǎn)生需要的蛋白質(zhì)。 9．植物組織培養(yǎng)的基本過(guò)程： 外植體愈傷組織根、芽→植物體。 10．植物體細(xì)胞雜交需要用酶解法制備原生質(zhì)體，所用的酶包括纖維素酶和果膠酶。 11．人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法分為物理法和化學(xué)法，物理法包括離心、振動(dòng)、電激等，化學(xué)法一般用聚乙二醇作為誘導(dǎo)劑。 12．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)需滿(mǎn)足的條件有充足的營(yíng)養(yǎng)、適宜的溫度和pH、氣體及無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境。 13．單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高，并可以大量制備的優(yōu)點(diǎn)。 14．誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合常用的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇、滅活的病毒、電激等。 15．早期胚胎發(fā)育的過(guò)程：受精卵→卵裂期→桑椹胚→囊胚→原腸胚。 16．胚胎的早期培養(yǎng)所需培養(yǎng)液的成分包括：無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)鹽(兩鹽)；維生素、激素(兩素)；氨基酸、核苷酸(兩酸)以及水、血清等。 17．胚胎移植的基本程序：對(duì)供、受體的選擇和處理→配種或進(jìn)行人工授精→對(duì)胚胎的收集、檢查、培養(yǎng)或保存→胚胎移植→移植后的檢查。 18．胚胎移植過(guò)程中兩次使用激素，第一次用孕激素對(duì)供、受體進(jìn)行同期發(fā)情處理，第二次用促性腺激素對(duì)供體進(jìn)行超數(shù)排卵處理。 19．生態(tài)工程建設(shè)的目的是遵循自然界物質(zhì)循環(huán)的規(guī)律，充分發(fā)揮資源的生產(chǎn)潛力，防止環(huán)境污染，達(dá)到經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)效益的同步發(fā)展。 20．生態(tài)工程所遵循的基本原理有物質(zhì)循環(huán)再生原理、物種多樣性原理、協(xié)調(diào)與平衡原理、整體性原理及系統(tǒng)學(xué)和工程學(xué)原理。 [澄清——思維誤區(qū)] 關(guān)注點(diǎn)1　對(duì)基因工程中的“載體”與細(xì)胞膜上的“載體”區(qū)分不清 [澄清]　基因工程中的載體是DNA分子，其功能是攜帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞；細(xì)胞膜上的載體是蛋白質(zhì)，其功能是協(xié)助某些物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。 關(guān)注點(diǎn)2　誤認(rèn)為限制酶是一種酶 [澄清]　限制酶是一類(lèi)酶，而不是一種酶。 關(guān)注點(diǎn)3　誤認(rèn)為啟動(dòng)子是起始密碼子(RNA)，終止子是終止密碼子(RNA) [澄清]　啟動(dòng)子(DNA片段)≠起始密碼子(信使RNA上的三個(gè)相鄰堿基)；終止子(DNA片段)≠終止密碼子(信使RNA上的三個(gè)相鄰堿基)。 關(guān)注點(diǎn)4　對(duì)蛋白質(zhì)工程的實(shí)質(zhì)與基因工程的實(shí)質(zhì)認(rèn)識(shí)不清 [澄清]　蛋白質(zhì)工程是定向改造或生產(chǎn)人類(lèi)所需蛋白質(zhì)(可以為自然界中不存在的蛋白質(zhì))，而基因工程是定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類(lèi)所需的生物類(lèi)型或生物產(chǎn)品(一般生產(chǎn)自然界中已存在的蛋白質(zhì))。 關(guān)注點(diǎn)5　誤認(rèn)為植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生新個(gè)體屬于有性生殖 [澄清]　植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生新個(gè)體不屬于有性生殖，而屬于無(wú)性繁殖，細(xì)胞分裂方式為有絲分裂，包括脫分化和再分化兩個(gè)階段。 關(guān)注點(diǎn)6　誤認(rèn)為獲取細(xì)胞產(chǎn)品與人工種子的時(shí)期相同 [澄清]　獲取細(xì)胞產(chǎn)品的時(shí)期應(yīng)為脫分化之后再分化之前的愈傷組織，而制作人工種子需要在再分化后形成的胚狀體階段。 關(guān)注點(diǎn)7　對(duì)植物組織培養(yǎng)與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)別不明 [澄清]　(1)植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)都存在細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程，但植物細(xì)胞可以先分裂再分化，而動(dòng)物細(xì)胞只分裂不分化。 (2)植物組織培養(yǎng)可以培養(yǎng)成新個(gè)體，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只能培養(yǎng)出一團(tuán)細(xì)胞，不能培養(yǎng)成一個(gè)新個(gè)體。 關(guān)注點(diǎn)8　對(duì)受精標(biāo)志與受精完成的標(biāo)志認(rèn)識(shí)不清 [澄清]　(1)卵子是否受精的標(biāo)志是第二極體的形成(即在透明帶和卵細(xì)胞膜間隙觀察到兩個(gè)極體)。 (2)受精完成的標(biāo)志是雌雄原核融合成含二倍染色體的合子。 關(guān)注點(diǎn)9　誤認(rèn)為胚胎發(fā)育的過(guò)程中，細(xì)胞的全能性完全相同 [澄清]　胚胎發(fā)育的過(guò)程中，細(xì)胞的全能性并非完全相同，桑椹胚階段的細(xì)胞具有全能性，囊胚是開(kāi)始分化的階段，原腸胚時(shí)期已出現(xiàn)高度分化。隨著個(gè)體的發(fā)育，細(xì)胞的全能性越來(lái)越低。 關(guān)注點(diǎn)10　對(duì)胚胎移植中的“同種”認(rèn)識(shí)不清 [澄清]　同種動(dòng)物之間進(jìn)行胚胎移植易成功。這里的“同種”是指“同一物種”。 關(guān)注點(diǎn)11　誤認(rèn)為胚胎分割是有性生殖 [澄清]　胚胎是由受精卵形成的，屬于有性生殖； 胚胎分割技術(shù)屬于無(wú)性生殖，也屬于克隆。 關(guān)注點(diǎn)12　認(rèn)為不同的生態(tài)工程所依據(jù)的原理相同 [澄清]　建立不同的生態(tài)工程時(shí)要依據(jù)不同的原理，因地制宜，不能相互照搬。 關(guān)注點(diǎn)13　誤認(rèn)為實(shí)現(xiàn)生態(tài)經(jīng)濟(jì)有時(shí)可以不遵循生態(tài)學(xué)的基本原理 [澄清]　實(shí)現(xiàn)生態(tài)經(jīng)濟(jì)一定要遵循生態(tài)學(xué)的基本原理，如果違背這些原理，就會(huì)使生態(tài)系統(tǒng)偏離穩(wěn)態(tài)，甚至導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)崩潰。 關(guān)注點(diǎn)14　誤認(rèn)為污染物是不能利用的資源 [澄清]　對(duì)環(huán)境造成危害的污染物，采取一定的措施和技術(shù)，就能夠進(jìn)行回收和循環(huán)利用，這樣不但能夠減少環(huán)境污染，而且能提高資源的利用率，減少資源的浪費(fèi)。 關(guān)注點(diǎn)15　誤認(rèn)為提高能量利用率＝提高能量傳遞效率 [澄清]　提高能量的利用率，可通過(guò)縮短食物鏈和能量的多級(jí)利用來(lái)實(shí)現(xiàn)。提高能量的傳遞效率，需通過(guò)提高下一營(yíng)養(yǎng)級(jí)的同化量來(lái)實(shí)現(xiàn)。 2個(gè)主攻點(diǎn)之(一)　基因工程和克隆技術(shù) 一、基因工程 1．基因工程的基本工具(填圖) 2．基因工程的基本操作程序(填空) (1)目的基因的獲取途徑： 方法 具體操作 直接 分離 從自然界已有的物種中分離，如從基因文庫(kù)中獲取 人 工 合 成 化學(xué) 方法 已知核苷酸序列的?shì)^小基因，直接利用DNA合成儀用化學(xué)方法合成，不需要模板 逆轉(zhuǎn) 錄法 以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下人工合成 PCR 技術(shù) 擴(kuò)增 ①原理：DNA復(fù)制 ②條件：模板DNA、引物、脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶 (2)基因表達(dá)載體——重組質(zhì)粒的構(gòu)建： ①表達(dá)載體的組成：目的基因＋啟動(dòng)子＋終止子＋標(biāo)記基因＋復(fù)制原點(diǎn)。 ②啟動(dòng)子和終止子：?jiǎn)?dòng)子是RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄；終止子是終止轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)。 (3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞： 植物細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞 微生物細(xì)胞 常用 方法 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法 顯微注射技術(shù) Ca2＋處理法 受體 細(xì)胞 受精卵、體細(xì)胞 受精卵 原核細(xì)胞 (4)目的基因的檢測(cè)與鑒定： ①導(dǎo)入檢測(cè)：DNA分子雜交技術(shù)(使用DNA探針)。 ②表達(dá)檢測(cè) ③個(gè)體生物學(xué)水平鑒定，如對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行抗蟲(chóng)或抗病等接種實(shí)驗(yàn)。 3．蛋白質(zhì)工程(填空) 二、克隆技術(shù) 1．植物組織培養(yǎng)技術(shù)(填圖) 2．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(填圖) 3．動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)(填圖) 4．動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體(填圖) 考向(一)　基因工程的操作工具、原理及過(guò)程 [真題導(dǎo)向] 1．(2014江蘇高考，多選)下列關(guān)于基因工程技術(shù)的敘述，錯(cuò)誤的是(　　) A．切割質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶均特異性地識(shí)別6個(gè)核苷酸序列 B．PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng) C．載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標(biāo)記基因 D．抗蟲(chóng)基因即使成功地插入到植物細(xì)胞染色體上也未必能正常表達(dá) 解析：選ABC　限制性核酸內(nèi)切酶大多特異性識(shí)別6個(gè)核苷酸序列，但并非都只識(shí)別6個(gè)核苷酸序列；PCR中耐高溫的DNA聚合酶只是在延伸階段發(fā)揮催化作用；載體質(zhì)粒上抗生素抗性基因可作為標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇，而不是抗生素合成基因；目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不一定都能正常表達(dá)。 2．(2017江蘇高考)金屬硫蛋白(MT)是一類(lèi)廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，某研究小組計(jì)劃通過(guò)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬?gòu)U水的凈化處理。PCR擴(kuò)增過(guò)程示意圖如下，請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)從高表達(dá)MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過(guò)________獲得________用于PCR擴(kuò)增。 (2)設(shè)計(jì)一對(duì)與MT基因兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物(引物1和引物2)，為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當(dāng)?shù)腳_______________位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形成________________，而造成引物自連。 (3)圖中步驟1代表________，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個(gè)步驟組成一輪循環(huán)。 (4)PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過(guò)高會(huì)破壞________________的堿基配對(duì)。退火溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，長(zhǎng)度相同但________的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。 (5)如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以采取的改進(jìn)措施有________(填序號(hào)：①升高退火溫度?、诮档屯嘶饻囟取、壑匦略O(shè)計(jì)引物)。 解析：(1)PCR技術(shù)可在體外對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，模板可以是mRNA經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。(2)設(shè)計(jì)一對(duì)與MT基因兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物(引物1和引物2)時(shí)，需在引物中增加適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶的識(shí)別序列，便于目的基因與質(zhì)粒的連接。為了避免引物自連，設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形成堿基互補(bǔ)配對(duì)。(3)根據(jù)PCR的過(guò)程可知，圖中步驟1為變性，步驟2為退火(復(fù)性)，步驟3為延伸，這三個(gè)步驟構(gòu)成一個(gè)循環(huán)。(4)退火溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，過(guò)高的退火溫度會(huì)破壞引物與模板的堿基配對(duì)。因G、C之間的氫鍵數(shù)多于A、T之間的氫鍵數(shù)，故GC含量高的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。(5)如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，可能的原因是退火溫度過(guò)高使擴(kuò)增效率降低，也可能是未按照目的基因兩端的核苷酸序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，因此可以采取的措施是降低退火溫度、重新設(shè)計(jì)引物等。 答案：(1)逆轉(zhuǎn)錄　cDNA　(2)限制性核酸內(nèi)切酶　堿基互補(bǔ)配對(duì)　(3)變性　(4)引物與模板　GC含量高 (5)②③ 　 (1)原理：利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，在體外將基因的核苷酸序列不斷地加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。 (2)條件及作用： 條件 作用 在一定的緩沖液中進(jìn)行 提供相對(duì)穩(wěn)定的pH環(huán)境 四種脫氧核苷酸 作為合成DNA子鏈的原料 DNA母鏈 作為DNA復(fù)制的模板 Taq DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈 引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸 溫度 控制 90～95 ℃ 變性：使DNA片段雙鏈解開(kāi) 55～60 ℃ 復(fù)性：使解開(kāi)的兩條DNA單鏈分別與相應(yīng)的引物結(jié)合 70～75 ℃ 延伸：Taq DNA聚合酶催化子鏈合成 (3)解題規(guī)律總結(jié)： ①模型圖示： ②規(guī)律總結(jié)： 循環(huán)數(shù) 第一輪 第二輪 第三輪 第n輪 DNA分子數(shù) 2 4 8 2n 含引物的DNA分子數(shù) 2 4 8 2n 含引物A(或B)的DNA分子 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同時(shí)含引物A、B的DNA分子數(shù) 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的引物數(shù)量 2＝22－2 6＝23－2 14＝24－2 2n＋1－2 含與脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA分子數(shù) 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n DNA分子種類(lèi) 2 4 5 5 3．(2016江蘇高考)下表是幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。請(qǐng)回答下列問(wèn)題： 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ HindⅢ 識(shí)別序 列及切 割位點(diǎn) 圖1 圖2 (1)用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用__________________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過(guò)________酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于________態(tài)的大腸桿菌。 (2)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加________，平板上長(zhǎng)出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中_________________________。 (3)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為_(kāi)_______________________，對(duì)于該部位，這兩種酶________(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開(kāi)。 (4)若用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒最多可能獲得________種大小不同的DNA片段。 解析：(1)基因工程中選擇合適的限制酶切割質(zhì)粒和目的基因時(shí)，應(yīng)保留目的基因和至少一個(gè)標(biāo)記基因結(jié)構(gòu)的完整性，即遵循“目的基因切兩側(cè)，標(biāo)記基因留一個(gè)”的基本原則，最好選擇切割產(chǎn)生不同末端的兩種限制酶同時(shí)切割質(zhì)粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入帶來(lái)的不正常表達(dá)，因此據(jù)圖分析應(yīng)選擇的限制酶為BclⅠ和HindⅢ，切割后質(zhì)粒上保留的四環(huán)素抗性基因作為標(biāo)記基因。酶切后的載體和目的基因通過(guò)DNA連接酶的作用形成重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒需要導(dǎo)入Ca2＋處理后的處于感受態(tài)的大腸桿菌(處于感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性大大增加，便于重組質(zhì)粒進(jìn)入)。(2)由上述分析可知，為了篩選出導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)先配制含四環(huán)素的選擇培養(yǎng)基，平板上長(zhǎng)出的菌落為導(dǎo)入普通質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒的大腸桿菌菌落，進(jìn)一步鑒定出導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌，可利用PCR擴(kuò)增的方式,結(jié)合電泳技術(shù)來(lái)分析處理。DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?在PCR過(guò)程中，當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后,DNA聚合酶只能從引物的3′端延伸DNA鏈,因此應(yīng)選擇引物甲和引物丙。(3)因?yàn)锽clⅠ和BamHⅠ酶切產(chǎn)生的黏性末端相同,所以可以被DNA連接酶連接,連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為，但是連接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和BamHⅠ的識(shí)別序列，連接部位不能被這兩種酶切開(kāi)。(4)由圖可知，能被限制酶BclⅠ和BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ識(shí)別并切割，因此圖中質(zhì)粒上存在3個(gè)Sau3A Ⅰ的切割位點(diǎn)，若將3個(gè)切割位點(diǎn)之間的DNA片段分別編號(hào)為a、b和c，則完全酶切(3個(gè)切割位點(diǎn)均被切割)會(huì)產(chǎn)生3種大小的DNA片段，即為a、b和c；考慮只切1個(gè)切割位點(diǎn)，有三種情況，都產(chǎn)生一種大小的DNA片段，即大小均為a＋b＋c；考慮切2個(gè)切割位點(diǎn)，則會(huì)產(chǎn)生a＋b、c、a＋c、b、b＋c、a幾種不同大小的DNA片段。綜上所述，若用Sau3AⅠ識(shí)別并切割圖中質(zhì)粒，最多可獲得7種大小的DNA片段，即為a＋b＋c、a＋b、a＋c、b＋c、a、b、c。 答案：(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA連接　感受　(2)四環(huán)素　引物甲和引物丙　 (3) 都不能　(4)7 　 (1)基因工程中有3種工具，但工具酶只有2種。限制酶是一類(lèi)酶，不是一種酶。限制酶的化學(xué)成分為蛋白質(zhì)，其作用的發(fā)揮需要適宜的理化條件，高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿均易使之變性失活。 (2)在切割含目的基因的DNA分子時(shí)，需用限制酶切割兩次此DNA分子，產(chǎn)生4個(gè)末端。 (3)限制酶和DNA連接酶的作用部位都是脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵(不是氫鍵), 只是一個(gè)切開(kāi)，一個(gè)連接。限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。 (4)限制酶切割位點(diǎn)所處的位置必須是在所需的標(biāo)記基因之外，這樣才能保證標(biāo)記基因的完整性，有利于對(duì)目的基因的檢測(cè)。 (5)為使目的基因與載體形成相同的DNA片段末端連接，通常使用同一種限制酶將二者切割，但如果不同的限制酶切割DNA分子所產(chǎn)生的末端也存在互補(bǔ)關(guān)系時(shí)，則兩末端也可連接。用兩種限制酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，可避免質(zhì)粒和質(zhì)粒之間、目的基因和目的基因之間的連接。 [過(guò)關(guān)練習(xí)] 1.將經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的DNA和質(zhì)粒用相同的限制酶進(jìn)行如右圖所示的切割，電泳得到純凈的B片段和D片段，將兩種片段置于適宜的緩沖液中用DNA連接酶處理。如果只考慮兩個(gè)片段的環(huán)狀連接，則能形成不同核苷酸序列的環(huán)狀DNA的種類(lèi)是(　　) A．6種　　　　　　　　 B．3種 C．2種 D．1種 解析：選A　只考慮兩個(gè)片段的環(huán)狀連接，能形成的環(huán)狀DNA有B片段與B片段同向連接的、B片段與B片段反向連接的、D片段與D片段同向連接的、D片段與D片段反向連接的、B片段與D片段同向連接的及B片段與D片段反向連接的，共6種。 2．(2018徐州模擬)下列有關(guān)基因工程技術(shù)的敘述，正確的是(　　) A．不同的限制酶切割形成的黏性末端一定不同 B．PCR反應(yīng)中周期性的溫度設(shè)置是特定的，與擴(kuò)增的目的基因和引物無(wú)關(guān) C．在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)通常需要大量的目的基因和載體 D．質(zhì)粒上的目的基因都必須整合到受體細(xì)胞的DNA上才能表達(dá) 解析：選C　不同的限制酶切割形成的黏性末端可能相同，也可能不同；PCR反應(yīng)中周期性的溫度可在一定范圍內(nèi)設(shè)置，不是特定的；在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)通常需要大量的目的基因和載體，這樣獲得基因表達(dá)載體的概率更 高；質(zhì)粒本身是DNA，也能自我復(fù)制，所以進(jìn)入受體細(xì)胞以后，既可以自己進(jìn)行表達(dá)，也可以整合到受體細(xì)胞的DNA上并表達(dá)。 3．下圖為綠色熒光小鼠制備流程圖，Gfp是綠色熒光蛋白基因。請(qǐng)據(jù)圖回答問(wèn)題： (1)據(jù)圖分析可推知，載體上的Neo為_(kāi)_______基因，其表達(dá)產(chǎn)物可與________發(fā)揮作用而最終將____________的胚胎干細(xì)胞篩選出來(lái)。 (2)完成過(guò)程①需要的工具酶是____________，完成過(guò)程②常用的方法是___________，完成過(guò)程⑤后，胚胎干細(xì)胞應(yīng)與囊胚中的________部位相結(jié)合。 (3)進(jìn)行過(guò)程⑥之前，要對(duì)代孕母鼠用某種激素處理，目的是_____________________。 (4)胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)裝置應(yīng)置于________________的氣體環(huán)境中，以保證培養(yǎng)環(huán)境pH的相對(duì)穩(wěn)定。 解析：(1)根據(jù)題意知，Gfp是目的基因，所以載體上的Neo為標(biāo)記基因。根據(jù)題圖可知，其表達(dá)產(chǎn)物可與G418發(fā)揮作用而最終將導(dǎo)入目的基因的胚胎干細(xì)胞篩選出來(lái)。(2)完成過(guò)程①需要的工具酶是DNA連接酶，完成過(guò)程②常用的方法是顯微注射法，完成過(guò)程⑤后，胚胎干細(xì)胞應(yīng)與囊胚中的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)部位相結(jié)合。(3)過(guò)程⑥是胚胎移植，進(jìn)行胚胎移植之前，要對(duì)代孕母鼠進(jìn)行同期發(fā)情處理。(4)細(xì)胞培養(yǎng)液中通入含5%的CO2的空氣可以保證培養(yǎng)環(huán)境pH的相對(duì)穩(wěn)定。 答案：(1)標(biāo)記　G418　導(dǎo)入目的基因　(2)DNA連接酶 顯微注射法　內(nèi)細(xì)胞團(tuán)　(3)使其同期發(fā)情　(4)含一定量(5%)的CO2 考向(二)　綜合考查基因工程的應(yīng)用 [真題導(dǎo)向] 1．(2018江蘇高考)為生產(chǎn)具有特定性能的α淀粉酶，研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了α淀粉酶基因(1 656個(gè)堿基對(duì))，利用基因工程大量制備α淀粉酶，實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)下圖。請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的________________。 (2)為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的________端加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是_______________ ________________________________________________________________________。 (3)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)的溫度和時(shí)間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定，下列選項(xiàng)中________的設(shè)定與引物有關(guān)，________的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度有關(guān)。(填序號(hào)) ①變性溫度?、谕嘶饻囟取、垩由鞙囟取、茏冃詴r(shí)間?、萃嘶饡r(shí)間?、扪由鞎r(shí)間 (4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α淀粉酶的mRNA 的部分堿基序列： 圖中虛線(xiàn)框內(nèi)mRNA片段包含________個(gè)密碼子，如虛線(xiàn)框后的序列未知，預(yù)測(cè)虛線(xiàn)框后的第一個(gè)密碼子最多有________種。 (5)獲得工程菌表達(dá)的α淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測(cè)定酶活性，結(jié)果如下： 緩沖液 50 mmol/L Na2HPO4KH2PO4 50 mmol/L TrisHCl 50 mmol/L GlyNaOH pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5 酶相對(duì) 活性(%) 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步判斷該α淀粉酶活性最高的條件為_(kāi)_______________________ ___________________________________________________。 解析：(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的基因組DNA作為模板，并依據(jù)α淀粉酶基因兩端的部分核苷酸序列合成兩條引物。(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，只能從3′端延伸DNA子鏈，為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的5′端加上限制性酶切位點(diǎn)，并且要注意在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，這樣既能防止目的基因、載體的自身連接，又能確保目的基因與表達(dá)載體的定向連接。(3)PCR技術(shù)包括變性、退火(復(fù)性)和延伸三步，變性溫度決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA的解鏈，且時(shí)間很短；退火時(shí)引物結(jié)合到互補(bǔ)的DNA單鏈上，退火溫度由引物復(fù)性溫度決定，其溫度設(shè)定與引物的長(zhǎng)度、堿基組成及濃度等有關(guān)；延伸時(shí)間與產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度有關(guān)，產(chǎn)物在1 kb以?xún)?nèi)的延伸時(shí)間為1 min左右，3～4 kb的延伸時(shí)間為3～4 min。(4)圖中虛線(xiàn)框內(nèi)共含有24個(gè)堿基，mRNA上3個(gè)相鄰的堿基編碼1個(gè)氨基酸，故共包含8個(gè)密碼子。虛線(xiàn)框后的第1個(gè)密碼子的第1個(gè)堿基是U，第2和第3個(gè)堿基各有4種可能性，因此共有16種可能性。題干表明控制α淀粉酶的基因有1 656個(gè)堿基對(duì)，說(shuō)明圖中虛線(xiàn)框后的第一個(gè)密碼子肯定不是終止密碼子(3種終止密碼子為UAA、UAG、UGA)，故虛線(xiàn)框后第一個(gè)密碼子實(shí)際最多有16－3＝13(種)可能性。(5)分析表格中的數(shù)據(jù)，酶相對(duì)活性最高為99.5%，對(duì)應(yīng)的條件是pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L TrisHCl。 答案：(1)基因組DNA　(2)5′　使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連　(3)②?、蕖?4)8　13 (5)pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L TrisHCl 2．(2015江蘇高考)胰島素A、B鏈分別表達(dá)法是生產(chǎn)胰島素的方法之一。下圖1是該方法所用的基因表達(dá)載體，圖2表示利用大腸桿菌作為工程菌生產(chǎn)人胰島素的基本流程(融合蛋白A、B分別表示β半乳糖苷酶與胰島素A、B鏈融合的蛋白)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)圖1基因表達(dá)載體中沒(méi)有標(biāo)注出來(lái)的基本結(jié)構(gòu)是________。 (2)圖1中啟動(dòng)子是________酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能啟動(dòng)目的基因的表達(dá)；氨芐青霉素抗性基因的作用是_____________________________________________________。 (3)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)必需的工具酶有____________________。 (4)β半乳糖苷酶與胰島素A鏈或B鏈融合表達(dá)，可將胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點(diǎn)隱藏在內(nèi)部，其意義在于________________________________________________________。 (5)溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，用溴化氰處理相應(yīng)的融合蛋白能獲得完整的A鏈或B鏈，且β半乳糖苷酶被切成多個(gè)肽段，這是因?yàn)開(kāi)________________________ _____________________________________________________________________________。 (6)根據(jù)圖2中胰島素的結(jié)構(gòu)，請(qǐng)推測(cè)每個(gè)胰島素分子中所含游離氨基的數(shù)量。你的推測(cè)結(jié)果是________，理由是______________________________________________________ ________________________________________________________________________。 解析：(1)基因表達(dá)載體中應(yīng)具有啟動(dòng)子、目的基因、終止子、標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)。(2)啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能啟動(dòng)目的基因的表達(dá)。圖中的氨芐青霉素抗性基因充當(dāng)了標(biāo)記基因，可用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌。(3)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，需要用同種限制酶分別切割目的基因和載體，然后用DNA連接酶將目的基因和載體連接。(4)胰島素肽鏈上具有蛋白酶的切割位點(diǎn)，會(huì)導(dǎo)致胰島素被菌體內(nèi)的蛋白酶降解，而通過(guò)融合表達(dá)將切割位點(diǎn)隱藏在內(nèi)部可防止胰島素的A、B鏈被菌體內(nèi)的蛋白酶降解。(5)根據(jù)溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，并結(jié)合β半乳糖苷酶被切成多個(gè)肽段，獲得了完整的胰島素A鏈、B鏈這一信息，可以推測(cè)β半乳糖苷酶中必然含有多個(gè)甲硫氨酸，胰島素A鏈、B鏈不含甲硫氨酸。(6)每一條肽鏈的兩個(gè)末端分別含有一個(gè)氨基和一個(gè)羧基，某些氨基酸的R基中也含有氨基，因此含兩條肽鏈的胰島素中至少含有2個(gè)游離的氨基。 答案：(1)終止子　(2)RNA聚合　作為標(biāo)記基因，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來(lái)　(3)限制酶和DNA連接酶　(4)防止胰島素的A、B鏈被菌體內(nèi)蛋白酶降解　(5)β半乳糖苷酶中含多個(gè)甲硫氨酸，而胰島素A、B鏈中不含甲硫氨酸　(6)至少2個(gè)　兩條肽鏈的一端各有一個(gè)游離的氨基，氨基酸R基團(tuán)中可能還含有游離的氨基 　 (1)基因工程操作過(guò)程中只有第三步(將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞)沒(méi)有堿基互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象。 (2)目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的，基因表達(dá)需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入到啟動(dòng)子與終止子之間的部位。 (3)植物細(xì)胞的全能性較高，可經(jīng)植物組織培養(yǎng)成為完整植物體，因此受體細(xì)胞可以是受精卵也可以是體細(xì)胞；動(dòng)物基因工程中的受體細(xì)胞一般是受精卵。 (4)基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子(DNA片段)≠起始密碼子(信使RNA上的三個(gè)相鄰堿基)；終止子(DNA片段)≠終止密碼子(信使RNA上的三個(gè)相鄰堿基)。 (5)基因表達(dá)載體的構(gòu)建是最核心的一步，在體外進(jìn)行。個(gè)體水平上的檢測(cè)和鑒定是衡量基因工程操作是否成功的最簡(jiǎn)單最有效的方法。 [過(guò)關(guān)練習(xí)] 1．甲型流感病毒為RNA病毒，易引起流感大規(guī)模流行。我國(guó)科學(xué)家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法，主要環(huán)節(jié)如下。 (1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖能力。以病毒RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成對(duì)應(yīng)DNA后，利用________技術(shù)擴(kuò)增，并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內(nèi)個(gè)別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比，改造后的基因表達(dá)時(shí)不能合成完整長(zhǎng)度的________，因此不能產(chǎn)生子代病毒。將該改造基因、表面抗原等其他基因分別構(gòu)建重組質(zhì)粒，并保存。 (2)構(gòu)建適合改造病毒增殖的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。設(shè)計(jì)合成一種特殊tRNA的基因，其產(chǎn)物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對(duì)結(jié)合，并可攜帶一個(gè)非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與________連接后導(dǎo)入宿主細(xì)胞。提取宿主細(xì)胞的________進(jìn)行分子雜交鑒定，篩選獲得成功表達(dá)上述tRNA的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。 (3)利用轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞制備疫苗。將(1)中的重組質(zhì)粒導(dǎo)入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，并在補(bǔ)加__________的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，則該宿主細(xì)胞能利用上述特殊tRNA，翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，產(chǎn)生大量子代病毒，用于制備疫苗。特殊tRNA基因轉(zhuǎn)錄時(shí)，識(shí)別其啟動(dòng)子的酶是________(單選)。 A．病毒的DNA聚合酶　 B．宿主的DNA聚合酶 C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶 解析：(1)體外進(jìn)行DNA擴(kuò)增采用的技術(shù)手段是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))。將基因內(nèi)個(gè)別編碼氨基酸的序列改造成編碼終止密碼子的序列后，在翻譯時(shí)終止密碼子提前出現(xiàn)，不能合成完整長(zhǎng)度的多肽(或蛋白質(zhì))。(2)為了使目的基因能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并正常表達(dá)，需要將目的基因與載體(運(yùn)載體)連接后導(dǎo)入受體細(xì)胞。利用分子雜交技術(shù)，鑒定篩選獲得成功表達(dá)目的RNA的細(xì)胞時(shí)，需提取宿主細(xì)胞的總RNA。(3)將(1)中的重組質(zhì)粒導(dǎo)入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞內(nèi)由于沒(méi)有Uaa，翻譯將會(huì)在終止密碼子處停止，將不能翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻譯出完整蛋白，需要在培養(yǎng)基中加入U(xiǎn)aa。轉(zhuǎn)錄時(shí)，識(shí)別啟動(dòng)子的酶為RNA聚合酶，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄在宿主細(xì)胞中進(jìn)行，所以轉(zhuǎn)錄用的酶為宿主細(xì)胞的RNA聚合酶。 答案：(1)PCR　多肽(或蛋白質(zhì))　(2)載體　總RNA (3)非天然氨基酸(Uaa)　D 2．(2019屆高三常州四校調(diào)研)如圖為利用奶牛的乳汁生產(chǎn)胰島素的流程圖?；卮鹣铝袉?wèn)題： (1)質(zhì)粒載體的基本組成單位是________________，質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的條件有__________________________________________________________(答出兩點(diǎn)即可)。而作為基因表達(dá)載體，除了滿(mǎn)足上述基本條件外，還需要具有啟動(dòng)子和終止子。 (2)據(jù)圖分折，最好選用________________(填限制酶名稱(chēng))分別切割含目的基因的DNA分子和質(zhì)粒分子。當(dāng)胰島素基因和質(zhì)粒載體連接時(shí)，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是__________________。 (3)要使胰島素基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，需要通過(guò)質(zhì)粒載體，而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，原因是____________________________________________________。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受精卵的方法是______________；經(jīng)檢測(cè)，胰島素基因已導(dǎo)入受體細(xì)胞的基因組中，但轉(zhuǎn)基因奶牛通過(guò)乳腺生物反應(yīng)器未生產(chǎn)出胰島素，根據(jù)中心法則分析，其原因可能是________________________________________________________________________。 (4)通過(guò)乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)胰島素，需提前對(duì)形成的受精卵進(jìn)行篩選，保留含性染色體組成為_(kāi)__________(填“XX”或“XY”)的類(lèi)型。 解析：(1)質(zhì)粒載體是小型環(huán)狀DNA，其基本組成單位是脫氧核苷酸，質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的條件有具有自我復(fù)制的能力、有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、含有標(biāo)記基因。作為基因表達(dá)載體，除了滿(mǎn)足上述基本條件外，還需要具有啟動(dòng)子和終止子。(2)據(jù)圖分折，最好選用SmaⅠ、PstⅠ分別切割含目的基因的DNA分子和質(zhì)粒分子。當(dāng)胰島素基因和質(zhì)粒載體連接時(shí)，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵。(3)要使胰島素基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，需要通過(guò)質(zhì)粒載體，而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，原因是目的基因無(wú)復(fù)制原點(diǎn)，無(wú)表達(dá)所需的啟動(dòng)子。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受精卵的方法是顯微注射法；經(jīng)檢測(cè)，胰島素基因已導(dǎo)入受體細(xì)胞的基因組中，但轉(zhuǎn)基因奶牛通過(guò)乳腺生物反應(yīng)器未生產(chǎn)出胰島素，根據(jù)中心法則分析,其原因可能是胰島素基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯異常。(4)通過(guò)乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)胰島素，需提前對(duì)形成的受精卵進(jìn)行篩選，要選雌性的受精卵，故保留含性染色體組成為XX的類(lèi)型。 答案：(1)脫氧核苷酸　具有自我復(fù)制的能力、有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、含有標(biāo)記基因　(2)SmaⅠ、PstⅠ　磷酸二酯鍵　(3)目的基因無(wú)復(fù)制原點(diǎn)和無(wú)表達(dá)所需的啟動(dòng)子　顯微注射法　(目的基因的)轉(zhuǎn)錄或翻譯異常　(4)XX 考向(三)　克隆技術(shù)及應(yīng)用 [真題導(dǎo)向] 1．(2018江蘇高考)花藥離體培養(yǎng)是重要的育種手段。下圖是某二倍體植物花藥育種過(guò)程的示意圖，下列敘述正確的是(　　) A．為了防止微生物污染，過(guò)程①所用的花藥需在70%乙醇中浸泡30 min B．過(guò)程②的培養(yǎng)基中需添加較高濃度的細(xì)胞分裂素以利于根的分化 C．過(guò)程③逐步分化的植株中可篩選獲得純合的二倍體 D．過(guò)程④應(yīng)將煉苗后的植株移栽到含有蔗糖和多種植物激素的基質(zhì)上 解析：選C　通常將花藥用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精浸泡30 s，立即取出，在無(wú)菌水中清洗；過(guò)程②為脫分化形成愈傷組織的過(guò)程，所用培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的比例應(yīng)適中；過(guò)程③為再分化，因用秋水仙素處理了由花藥形成的愈傷組織細(xì)胞，故能篩選獲得純合的二倍體；過(guò)程④應(yīng)將煉苗后的植株移栽到土壤中。 2.(2018江蘇高考，多選)如圖為細(xì)胞融合的示意圖，下列敘述正確的是(　　) A．若a細(xì)胞和b細(xì)胞是植物細(xì)胞，需先去分化再誘導(dǎo)融合 B．a(chǎn)細(xì)胞和b細(xì)胞之間的融合需要促融處理后才能實(shí)現(xiàn) C．c細(xì)胞的形成與a、b細(xì)胞膜的流動(dòng)性都有關(guān) D．c細(xì)胞將同時(shí)表達(dá)a細(xì)胞和b細(xì)胞中的所有基因 解析：選BC　若a細(xì)胞和b細(xì)胞是植物細(xì)胞，應(yīng)先用纖維素酶和果膠酶去除細(xì)胞壁，然后再誘導(dǎo)融合；a細(xì)胞和b細(xì)胞之間的融合需要借助物理、化學(xué)等方法處理后才能實(shí)現(xiàn)；細(xì)胞的融合與細(xì)胞膜的流動(dòng)性有關(guān)；融合后的c細(xì)胞中的基因進(jìn)行選擇性表達(dá)，只能表達(dá)a、b兩細(xì)胞的部分基因。 3．(2014江蘇高考)為了獲得植物次生代謝產(chǎn)物，先用植物外植體獲得愈傷組織，然后在液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。 請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)外植體經(jīng)誘導(dǎo)后形成愈傷組織的過(guò)程稱(chēng)為_(kāi)__________________________________。 (2)在愈傷組織懸浮培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞干重、蔗糖濃度和pH的變化如上圖所示。細(xì)胞干重在12 d后下降的原因有_________________________；培養(yǎng)液中蔗糖的作用是_____________、______________。 (3)多倍體愈傷組織細(xì)胞產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物量常高于二倍體。二倍體愈傷組織細(xì)胞經(jīng)______________處理，會(huì)產(chǎn)生染色體加倍的細(xì)胞。為檢測(cè)愈傷組織細(xì)胞染色體數(shù)目，壓片前常用纖維素酶和________酶解離愈傷組織。若愈傷組織細(xì)胞(2n)經(jīng)誘導(dǎo)處理后，觀察到染色體數(shù)為8n的細(xì)胞，合理的解釋是______________________________________________、 ____________________________。 (4)為了更好地獲得次生代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)中采用植物細(xì)胞的固定化技術(shù)，其原理與酵母細(xì)胞固定化類(lèi)似。 下列說(shuō)法正確的有____________(填序號(hào))。 ①選取旺盛生長(zhǎng)的愈傷組織細(xì)胞包埋 ②必須在光照條件下培養(yǎng) ③培養(yǎng)過(guò)程中需通空氣 ④固定化后植物細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)變慢 解析：(1)外植體是植物體離體的組織、器官或細(xì)胞，誘導(dǎo)形成愈傷組織的過(guò)程稱(chēng)為脫分化。(2)在培養(yǎng)過(guò)程中，蔗糖除為細(xì)胞提供能源，還具有調(diào)節(jié)滲透壓的作用。隨著蔗糖的消耗，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)減少，同時(shí)，細(xì)胞代謝產(chǎn)物、廢物增加，使pH降低(偏酸)，不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。(3)秋水仙素或低溫處理都可誘導(dǎo)細(xì)胞染色體數(shù)目加倍。纖維素酶和果膠酶處理細(xì)胞壁，可以使細(xì)胞之間易于分離(解離)。(4)獲得植物次生代謝產(chǎn)物應(yīng)選用生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織；愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸，故需要通氣；愈傷組織沒(méi)有葉綠體，產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的過(guò)程不需要光照；固定化細(xì)胞所用包埋材料會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的擴(kuò)散，使固定化后的植物細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢。 答案：(1)脫分化　(2)蔗糖濃度下降，pH降低　提供能源　調(diào)節(jié)滲透壓　(3)秋水仙素(低溫)　果膠　經(jīng)加倍到4n的細(xì)胞處于有絲分裂后期　經(jīng)加倍到8n的細(xì)胞處于有絲分裂中期　(4)①③④ (1)植物細(xì)胞A和植物細(xì)胞B雜交獲得的雜種細(xì)胞的類(lèi)型有三種：AA型、BB型、AB型，符合要求的只有AB型，需要進(jìn)行篩選。 (2)雜種細(xì)胞形成的標(biāo)志：生成新的細(xì)胞壁。 (3)雜種植株遺傳物質(zhì)的變化：雜種植株的變異類(lèi)型屬于染色體變異，雜種植株的染色體數(shù)通常是兩親本細(xì)胞染色體數(shù)目之和，雜種植株屬于異源多倍體。 (4)植物組織培養(yǎng)時(shí)植物激素和光照的使用： ①植物激素的使用：脫分化階段先使用生長(zhǎng)素，后使用細(xì)胞分裂素，以促進(jìn)細(xì)胞的分裂；再分化階段需要調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例，當(dāng)生長(zhǎng)素比例低時(shí)，利于芽的形成，生長(zhǎng)素比例較高時(shí)，可促進(jìn)根的形成。 ②光照的使用：脫分化階段不需要給予光照，再分化階段需要給予光照，以利于葉綠素的形成。 (5)利用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)物時(shí)，有時(shí)只需將外植體培養(yǎng)到愈傷組織，從愈傷組織中獲取產(chǎn)物。 [過(guò)關(guān)練習(xí)] 1．下列有關(guān)細(xì)胞工程的敘述，正確的是(　　) A．PEG是促細(xì)胞融合劑，可直接誘導(dǎo)植物細(xì)胞融合 B．用原生質(zhì)體制備人工種子，要防止細(xì)胞破裂 C．骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)免疫處理，可直接獲得單克隆抗體 D．核移植克隆的動(dòng)物，其線(xiàn)粒體DNA來(lái)自供卵母體 解析：選D　PEG是促細(xì)胞融合劑，能誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體融合，融合前需先用酶解法去除植物細(xì)胞的細(xì)胞壁；制備人工種子應(yīng)該用組織培養(yǎng)形成的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽等為材料，而不是原生質(zhì)體；單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的，骨髓瘤細(xì)胞不能分泌抗體；利用核移植技術(shù)克隆動(dòng)物時(shí)，是將體細(xì)胞的細(xì)胞核移入去除細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，所以克隆動(dòng)物的線(xiàn)粒體DNA來(lái)自供卵母體。 2．設(shè)計(jì)植物體細(xì)胞雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)，如果期望獲得性狀優(yōu)良的作物新品種，通常不需要考慮的是(　　) A．選擇具有優(yōu)良性狀的親本 B．選擇能去除細(xì)胞壁的酶 C．親本間的生殖隔離 D．培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的濃度及比例 解析：選C　設(shè)計(jì)植物體細(xì)胞雜交的目的是期望獲得性狀優(yōu)良的作物新品種，所以需要選擇具有優(yōu)良性狀的親本；由于細(xì)胞壁的存在會(huì)阻礙細(xì)胞的融合，所以要用纖維素酶和果膠酶去除細(xì)胞壁；由于植物體細(xì)胞雜交可以打破物種間的界限，故不需要考慮親本間的生殖隔離；培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的濃度及比例會(huì)影響細(xì)胞的脫分化和再分化。 3．胰島B細(xì)胞移植是一種有效治療糖尿病的方法。利用小鼠再生胰腺提取物(RPE) 可定向誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)分化成胰島B細(xì)胞。請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)取人羊膜組織刮除血塊、上皮細(xì)胞，沖洗后剪碎，然后用________________酶處理，最終制成hAMSCs 懸液。將細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到一定階段時(shí)，出現(xiàn)________________現(xiàn)象，此時(shí)細(xì)胞停止分裂增殖，這時(shí)需要將細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)處理，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 (2)取傳至第 3 代的hAMSCs放入細(xì)胞培養(yǎng)板，同時(shí)加入RPE 進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。該代hAMSCs 能保持細(xì)胞正常的________________。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)15天后，提取細(xì)胞的______________，用胰島素基因探針進(jìn)行分子雜交，可初步檢測(cè) hAMSCs 是否分化成胰島 B 細(xì)胞。(3)用人的雜交瘤細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)人源單克隆抗體難以成功，因此單克隆抗體大都來(lái)自鼠源。但鼠源單抗在人體內(nèi)使用時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫原性，為解決這一問(wèn)題，發(fā)明了嵌合抗體，大致過(guò)程如圖所示： 嵌合抗體能降低鼠源抗體的免疫原性，從圖中可以推測(cè)，免疫原性的產(chǎn)生主要與抗體的________(填“V區(qū)”或“C區(qū)”)有關(guān)，嵌合抗體的生產(chǎn)屬于_______________工程范疇。 解析：(1)用胰蛋白酶(或膠原蛋白酶)處理人羊膜組織，可制成hAMSCs懸液。將細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到一定階段時(shí)，會(huì)出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。(2)10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞可以保持正常的二倍體核型，因此傳至第 3 代的hAMSCs能保持細(xì)胞正常的(二倍體)核型。細(xì)胞分化的實(shí)質(zhì)是基因的選擇性表達(dá)，因此要檢測(cè) hAMSCs 是否分化成胰島 B 細(xì)胞，可提取細(xì)胞的RNA(或mRNA)，用胰島素基因探針進(jìn)行分子雜交。(3)從圖中可以推測(cè)，免疫原性的產(chǎn)生主要與抗體的C區(qū)有關(guān)。嵌合抗體的生產(chǎn)屬于蛋白質(zhì)工程范疇。 答案：(1)胰蛋白(或膠原蛋白)　接觸抑制　(2)(二倍體)核型　RNA　(3)C區(qū)　蛋白質(zhì)　 一、選擇題 1．(2019屆高三南京六校聯(lián)考)用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分別降解一個(gè)1 000 bp(1 bp即1個(gè)堿基對(duì))的DNA分子， 對(duì)降解產(chǎn)物分別進(jìn)行凝膠電泳，在電場(chǎng)的作用下，降解產(chǎn)物分開(kāi)，凝膠電泳結(jié)果如圖所示。該DNA分子的酶切圖譜(單位：bp)正確的是(　　) 解析：選C　根據(jù)電泳圖可知KpnⅠ 切割只得到1種DNA片段，判斷該DNA分子是環(huán)狀，且該DNA分子上只有1個(gè)KpnⅠ 切點(diǎn)。EcoRⅠ 切割得到2種DNA片段，說(shuō)明該DNA分子上有兩個(gè)EcoRⅠ 切點(diǎn)。據(jù)此分析選項(xiàng)中的酶切圖譜，只有C項(xiàng)符合。 2．中華鱘是地球上最古老的脊椎動(dòng)物，被稱(chēng)為“活化石”。研究者試圖通過(guò)蛋白質(zhì)工程改造中華鱘體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)，使其更加適應(yīng)現(xiàn)在的水域環(huán)境。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是(　　) A．該工程可以定向改變蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu) B．改造蛋白質(zhì)是通過(guò)改造基因結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)的 C．改造后的中華鱘和現(xiàn)有中華鱘仍是同一物種 D．改造后的中華鱘的后代不具有改造的蛋白質(zhì) 解析：選D　蛋白質(zhì)工程通過(guò)對(duì)基因進(jìn)行人工合成或修飾，最終定向改變蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)；改造后的中華鱘遺傳物質(zhì)變化不大，和現(xiàn)有中華鱘不存在生殖隔離，仍是同一物種；改造后的中華鱘含有控制新蛋白質(zhì)合成的基因，所以后代具有改造的蛋白質(zhì)。 3．(2018江蘇六市二模)農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒是植物基因工程中常用的運(yùn)載體，下列相關(guān)敘述正確的是(　　) A．Ti質(zhì)粒是能夠自主復(fù)制的單鏈DNA B．Ti質(zhì)粒中磷酸基團(tuán)都與兩個(gè)脫氧核糖相連接 C．重組Ti質(zhì)粒的受體細(xì)胞只能是植物愈傷組織細(xì)胞 D．Ti質(zhì)粒上的基因可全部整合到受體細(xì)胞染色體上 解析：選B　Ti質(zhì)粒是能夠自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子，其分子內(nèi)部的磷酸基團(tuán)都與兩個(gè)脫氧核糖相連接。重組Ti質(zhì)粒的受體細(xì)胞可以是植物愈傷組織細(xì)胞，也可以是其他的植物細(xì)胞，如植物的受精卵細(xì)胞。農(nóng)桿菌有Ti質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒上有一段TDNA，目的基因需插入Ti質(zhì)粒上的TDNA中形成重組質(zhì)粒載體，再導(dǎo)入農(nóng)桿菌，然后讓含重組質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌侵染植物，只有Ti質(zhì)粒上的TDNA片段(內(nèi)有目的基因)而不是Ti質(zhì)粒上的全部基因整合到受體細(xì)胞染色體上。 4．下列關(guān)于人胰島素基因表達(dá)載體的敘述，正確的是(　　) A．表達(dá)載體中的胰島素基因可通過(guò)人肝細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄獲得 B．表達(dá)載體的復(fù)制和胰島素基因的表達(dá)均始于復(fù)制原(起)點(diǎn) C．借助抗生素抗性基因可以將含胰島素基因的受體細(xì)胞篩選出來(lái) D．表達(dá)載體中的啟動(dòng)子和終止密碼子均在胰島素基因的轉(zhuǎn)錄中起作用 解析：選C　 胰島素基因在人體肝細(xì)胞中不表達(dá)，所以從肝細(xì)胞中不能提取到胰島素基因轉(zhuǎn)錄成的mRNA；基因的表達(dá)始于啟動(dòng)子，基因的復(fù)制始于復(fù)制原點(diǎn)；抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因，可以將含胰島素基因的受體細(xì)胞篩選出來(lái)；啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)，終止密碼子是翻譯的終點(diǎn)。 5．下列關(guān)于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的敘述，正確的是(　　) A．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中往往使用液體培養(yǎng)基 B．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的目的是為了培養(yǎng)動(dòng)物個(gè)體 C．在培養(yǎng)過(guò)程中通常要通入5%的CO2刺激細(xì)胞呼吸 D．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中可用胃蛋白酶將動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞 解析：選A　動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的目的是為了獲得細(xì)胞群或細(xì)胞產(chǎn)物；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中通常要通入5%的CO2的作用是維持培養(yǎng)液的pH；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中用胰蛋白酶或膠原蛋白酶將動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞。 6．植物細(xì)胞工程作為一門(mén)新興的生物技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于社會(huì)生產(chǎn)，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是(　　) A．人工種子是用人工薄膜為種皮包被植物愈傷組織形成的 B．植物微型繁殖運(yùn)用了植物組織培養(yǎng)技術(shù)，可快速繁殖良種植物 C．作物脫毒常選取植物的莖尖，因?yàn)樵撎幉《据^少或無(wú)病毒 D．植物細(xì)胞融合中常用的融合手段有離心、振動(dòng)、電激和PEG法 解析：選A　人工種子常使用人工薄膜作為種皮包被胚狀體。 7．(2018江蘇四校聯(lián)考)下列關(guān)于植物組織培養(yǎng)及其應(yīng)用的敘述，正確的是(　　) A．離體的植物組織、器官必須經(jīng)過(guò)滅菌才能接種到組織培養(yǎng)基中 B．以植物芽尖為材料通過(guò)組織培養(yǎng)可以獲得抗毒新品種 C．生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素的調(diào)節(jié)作用在組織培養(yǎng)中非常重要 D．以人工膜包裹植物愈傷組織和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可制得人工種子 解析：選C　離體的植物組織、器官必須經(jīng)過(guò)消毒(滅菌會(huì)殺死植物組織和器官)才能接種到組織培養(yǎng)基中；以芽尖為材料通過(guò)組織培養(yǎng)可以獲得脫毒苗，但不屬于新品種，抗病毒的新品種需通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得；生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)作用在組織培養(yǎng)中非常重要；以人工膜包裹胚狀體和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可制得人工種子。 8．下列關(guān)于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的敘述，錯(cuò)誤的是(　　) A．生物組織經(jīng)胰蛋白酶消化處理制成細(xì)胞懸液，再培養(yǎng)可獲得單層細(xì)胞 B．研究中使用的細(xì)胞通常培養(yǎng)至10代以?xún)?nèi)，以保持正常的二倍體核型 C．為防止雜菌污染，生物組織、培養(yǎng)液及培養(yǎng)用具需要進(jìn)行滅菌處理 D．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是制備單克隆抗體、細(xì)胞核移植、胚胎工程等技術(shù)的基礎(chǔ) 解析：選C　生物組織滅菌處理后會(huì)死亡，無(wú)法培養(yǎng)，生物組織通常做消毒處理。 9．(2018揚(yáng)州一模，多選)利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)羧酸酯酶(CarE)制劑的流程如下圖所示，下列有關(guān)敘述正確的是(　　) A．過(guò)程①需使用逆轉(zhuǎn)錄酶 B．過(guò)程②利用PCR擴(kuò)增CarE基因需使用解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶 C．過(guò)程③可用NaCl溶液處理大腸桿菌，使之成為感受態(tài)細(xì)胞 D．過(guò)程④可利用DNA分子雜交鑒定目的基因是否已導(dǎo)入受體細(xì)胞 解析：選AD　利用PCR擴(kuò)增基因時(shí)，通過(guò)高溫使DNA解旋，不需要解旋酶，但需要耐高溫的DNA聚合酶；用CaCl2溶液處理大腸桿菌，使其成為感受態(tài)細(xì)胞。 10．(多選)超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，具有延緩衰老的功效。下圖為培養(yǎng)轉(zhuǎn)SOD基因胡蘿卜新品種的過(guò)程，相關(guān)敘述正確的是(　　) 　 A．過(guò)程①通常采用顯微注射法將攜帶SOD基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞 B．過(guò)程②③除培養(yǎng)基中所含激素比例不同外，其他條件完全相同 C．將愈傷組織分散成單個(gè)細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)也可能獲得大量SOD D．該育種方式獲得的轉(zhuǎn)基因胡蘿卜自交后代可能會(huì)出現(xiàn)性狀分離 解析：選CD　植物基因工程中，目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的常用方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，脫分化(②)和再分化(③)階段使用的培養(yǎng)基除植物激素的比例不同外，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量也不完全相同，并且脫分化階段不需要光照，再分化階段需要光照。 二、非選擇題 11．如圖是利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)治療遺傳性糖尿病(基因缺陷導(dǎo)致胰島B細(xì)胞不能正常合成胰島素)的過(guò)程圖解，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題： (1)圖中①結(jié)構(gòu)表示________，選擇____________(時(shí)期)的卵母細(xì)胞去核后作為受體細(xì)胞構(gòu)建重組細(xì)胞A。 (2)②所示的細(xì)胞是________________，將健康胰島素基因?qū)擘谥械某Ｓ梅椒ㄊ莀_______________。 (3)在培養(yǎng)液