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蘭小鵬簡介1959 3出生 醫(yī)學(xué)博士 主任技師 教授 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院全軍醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心副主任 檢驗(yàn)科主任 中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)會血栓和止血專家委員會委員 南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)會主任委員 南京軍區(qū)器官移植研究所副所長 福建省醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)會副主任委員 第二軍醫(yī)大學(xué)和福建醫(yī)科大學(xué)碩士研究生導(dǎo)師 研究方向?yàn)樽陨砻庖卟〉膶?shí)驗(yàn)診斷以及腫瘤的基因治療 獲軍隊(duì)科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)一項(xiàng) 三等獎(jiǎng)一項(xiàng) 四等獎(jiǎng)一項(xiàng) 榮立三等功一次 被評為南京軍區(qū) 優(yōu)秀中青年科技人才 發(fā)表論文30余篇 參編專著三部 自身免疫病是一大類以產(chǎn)生各種各樣的自身抗體為特征的全身或局部性疾病 如系統(tǒng)性紅斑狼瘡 SLE 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 RA 皮肌炎 硬皮病以及免疫性不孕癥等 其較高的發(fā)病率和嚴(yán)重的危害程度越來越受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注 由于不同的自身免疫病具有不同的自身抗體譜 因此自身抗體的研究對自身免疫病的診斷 鑒別診斷 治療及療效監(jiān)測均有重要的意義 迄今為止 已發(fā)現(xiàn)的自身抗體將近100種 應(yīng)用于臨床的自身抗體也已達(dá)數(shù)十種 新的自身抗體還在不斷的被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用 DNA自身抗體作為一種經(jīng)典的且被廣泛應(yīng)用的自身抗體 在自身免疫病的研究中發(fā)揮了重要的作用 但DNA作為一種特殊的自身抗體 還存在許多未解之謎 因此 人們對DNA自身抗體的研究和探索始終沒有停止 本次講座主要討論一下DNA抗原以及其相對應(yīng)的DNA自身抗體的研究和臨床應(yīng)用 DNA自身抗體的研究進(jìn)展 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院全軍檢驗(yàn)中心 CenterforLabMedicinePLA CenterforLabMedicinePLA 蘭小鵬 一 DNA抗原的分子特性 1 DNA分子的基本構(gòu)象 右手雙螺旋 B DNA 左手雙螺旋DNA Z DNA B DNA和Z DNA又稱雙鏈DNA doublestrandedDNA ds DNA 或天然DNA nativeDNA nDNA 單鏈DNA singlestrandedDNA ss DNA 或稱變性DNA 2 DNA分子的抗原特性 不同構(gòu)象的分子之間的抗原性差別甚大 但又彼此交叉 還可互相轉(zhuǎn)變 DNA分子具有多抗原決定簇的特點(diǎn) 與抗體結(jié)合時(shí)的親和力較高 DNA抗原具有多聚陰離子特性 易產(chǎn)生非特異結(jié)合反應(yīng) ds DNA的抗原決定簇存在于ds DNA分子的構(gòu)象之中 DNA抗體與DNA的結(jié)合能力與DNA抗原的分子量有一定的關(guān)系 分子量越大 結(jié)合率越高 只有35bp以上的片段才能有效地與抗ds DNA抗體結(jié)合 DNA抗體與DNA的結(jié)合能力與DNA抗原分子的堿基組成有關(guān) G C含量高的DNA分子更易與抗體結(jié)合 DNA分子中含有某些復(fù)雜或特殊的結(jié)構(gòu)時(shí) 更易與抗體結(jié)合 如含有較多的重復(fù)序列 CpG及甲基胞密啶 mC 二 Ds DNA分子的免疫原性 用常規(guī)的免疫方法 ds DNA一般不能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生相應(yīng)的抗體 來源于原核生物的ds DNA比真核生物的ds DNA更容易通過免疫動(dòng)物來制備抗體 在某些特定的情況下 真核細(xì)胞的ds DNA才具有免疫原性 三 DNA的單克隆自身抗體與常規(guī)的單克隆技術(shù)相比 自身單克隆抗體的制備更為簡便 不需要人工免疫動(dòng)物 直接將自身免疫病的動(dòng)物模型的脾細(xì)胞或病人的外周血淋巴細(xì)胞與相應(yīng)的瘤細(xì)胞株融合就可建立雜交瘤 采用不同的抗原進(jìn)行篩選 則可獲得多種單克隆抗體 按融合細(xì)胞的來源不同 DNA抗體的雜交瘤可分為三類 1 鼠 鼠雜交瘤 將近交的SLE小鼠模型的脾細(xì)胞與鼠的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合 2 人 鼠雜交瘤 用SLE病人能分泌DNA抗體的B細(xì)胞與鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合 人 人雜交瘤 用SLE病人的外周血淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞與人的骨髓瘤細(xì)胞融合 另外將經(jīng)過EB病毒轉(zhuǎn)化的SLE病人的B淋巴細(xì)胞進(jìn)行克隆 這種轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞亦可分泌抗ds DNA 此法更為簡便 因?yàn)榧?xì)胞融合的步驟也不需要了 但這種EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的量比較少 人 人DNA雜交瘤及其分泌的抗DNA抗體研究的意義 1 通過分析單克隆抗體的特異性 可以更進(jìn)一步地了解DNA在SLE中的作用 2 作為抗原 DNA抗體又可誘導(dǎo)抗DNA抗體的獨(dú)特型抗體 這種抗獨(dú)特型有助于研究SLE產(chǎn)生DNA抗體的調(diào)控機(jī)制 3 這種雜交瘤細(xì)胞本身可用于分析與自身抗體的產(chǎn)生有關(guān)的基因結(jié)構(gòu) DNA的單克隆抗體存在的問題1 代表性的問題 作為一種多抗原決定簇的分子 由其引發(fā)的免疫反應(yīng)包含了許許多多針對不同抗原決定簇的多克隆抗體 顯然 只針對一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)決定簇的單克隆抗體 代表不了DNA引起的整個(gè)免疫反應(yīng) 2 單克隆抗體可能因靜電引力與 粘性 分子呈非特異結(jié)合 3 由于不同來源的分子之間的相似性以及某些在化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上與DNA相似的化合物的存在 使DNA單克隆抗體的交叉反應(yīng)顯得尤為突出 四 DNA抗體的交叉反應(yīng)幾乎所有的DNA單克隆和多克隆抗體既能與ds DNA又可與ss DNA反應(yīng) 而且在多數(shù)情況下 DNA抗體與ss DNA的親和力更高 但是單純針對ss DNA的抗ss DNA抗體則只能與ss DNA結(jié)合不能與ds DNA結(jié)合 DNA抗體能結(jié)合的分子包括Z DNA 某些人互合成的多核苷酸如poly I poly dT poly dAdT POLY dGdC 等 不少多聚陰離子化合物如心磷脂和其它磷脂 硫酸右旋糖酐 透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素以及硫酸肝素等都可與ds DNA抗體結(jié)合 研究和了解抗DNA的交叉反應(yīng)的臨床意義 1 解釋SLE病人出現(xiàn)梅毒試驗(yàn)陽性的現(xiàn)象 2 利用抗ds DNA抗體與硫酸右旋糖酐 DS 的反應(yīng) 可將DS吸附在硝酸纖維素柱上 用來去除SLE病人血中的抗ds DNA抗體 3 對抗ds DNA抗體和ds DNA在SLE的發(fā)病機(jī)制中的重新評價(jià) 傳統(tǒng)的觀點(diǎn) 免疫復(fù)合物沉積學(xué)說 新的觀點(diǎn) DNA抗體可能通過與腎小球某些成分上的抗原的交叉反應(yīng) 或者通過電荷的作用 直接結(jié)合在腎小球基底膜上 產(chǎn)生阻塞或?qū)е卵a(bǔ)體介導(dǎo)的炎癥和組織損害 五 DS DNA抗體的獨(dú)特型獨(dú)特型 Idiotype Id 通常是指位于抗體可變區(qū)的抗原決定簇 私有Id privateId 只存在于某一種類型抗體中的Id 公共Id publicId 幾種或多種抗體共同擁有的Id 16 6公共Id 在活動(dòng)性的SLE中 有一半以上的病人血清中的DNA抗體帶有的一種公共Id 16 6Id與SLE的活動(dòng)性有關(guān) 病情活動(dòng)時(shí) 16 6Id的滴度上升 反之則下降 SLE病人受損的組織中亦顯示有16 6的沉積 研究16 6Id的重要意義是 16 6Id可以誘導(dǎo)正常的小鼠發(fā)展成SLE 因此SLE極有可能是一種由Id誘導(dǎo)的疾病 兩種假設(shè) 1 6 6Id Ab1 免疫小鼠 刺激產(chǎn)生了抗 16 6Id Ab2 Ab2又可刺激小鼠產(chǎn)生抗 抗 16 6Id Ab3 Ab3則帶有原來的病理性16 6Id 這種抗體可能就是抗 DNA抗體 后者可導(dǎo)致SLE的發(fā)生 2 針對16 6Id的抗 16 6Id與自身抗原 DNA 相似 因此 這種抗16 6Id的產(chǎn)生又使小鼠產(chǎn)生抗 抗 6 6Id 后者可與DNA反應(yīng) 六 抗ds DNA的檢測1 免疫螢光法 IFT 2 放射免疫法 RIA 3 ELISA4 斑點(diǎn)免疫金滲濾法 DIGFA 5 生物芯片法 優(yōu)點(diǎn) 1 目前仍為檢測抗ds DNA抗體的金標(biāo)準(zhǔn) 2 特異性高3 可同時(shí)檢測ANA和抗ds DNA抗體 4 可半定量檢測抗ds DNA抗體 滴度 缺點(diǎn) 1 敏感性不高 2 短膜蟲的培養(yǎng)和傳代比較費(fèi)時(shí)費(fèi)事 3 操作方法也比較煩瑣 不易標(biāo)準(zhǔn)化 4 近幾年也有假陽性報(bào)道 優(yōu)點(diǎn) 1 敏感性較高 2 可以定量測定ds DNA抗體 缺點(diǎn) 1 假陽性率較高 2 有放射性污染 優(yōu)點(diǎn) 1 方法比較穩(wěn)定 應(yīng)用廣泛 2 可以定量 但多數(shù)情況下只是定性測定 缺點(diǎn) 1 試劑盒大多為進(jìn)口產(chǎn)品 價(jià)格較高 2 操作步驟較多 比較費(fèi)時(shí) 優(yōu)點(diǎn) 1 快速 簡便 只需2分鐘 2個(gè)步驟 2 敏感性與ELISA相當(dāng) 特異性與免疫熒光法相近 缺點(diǎn) 不能定量 優(yōu)點(diǎn) 1 高通量 可同時(shí)檢測多份標(biāo)本 多種自身抗體 2 可定量測定 缺點(diǎn) 成本較高 可通過靈活多樣的組合降低成本 流式熒光檢測儀 Luminex100多功能流式點(diǎn)陣儀 流式熒光檢測儀 流式熒光技術(shù) 流式熒光技術(shù) 激光激發(fā)熒光的發(fā)光類技術(shù)之一 BeadBased SuspensionArray 基于微珠的 懸浮陣列LiquidChip QIAGEN 液態(tài)芯片 液體芯片 液相芯片F(xiàn)lexibleMulti AnalyteProfilingsystemxMAP多功能多指標(biāo)并行分析系統(tǒng)Bead MicrosphereArray微珠陣列 熒光編碼微球技術(shù) 共價(jià)交聯(lián)技術(shù) 蛋白 核酸反應(yīng)模式 核酸 抗原 抗體 檢測模式 通過類似流式細(xì)胞技術(shù) 逐顆分析紅色激光635nm 識別不同編碼的微球綠色激光532nm 用于檢測檢測信號 檢測流程 固相反應(yīng)模式 流式熒光反應(yīng)模式 微量標(biāo)本 1次檢測 100個(gè)指標(biāo) 七 抗ds DNA在SLE診斷和治療監(jiān)測中的作用1 抗ds DNA是公論的SLE的標(biāo)志抗體 1982年國際風(fēng)濕病協(xié)會把抗ds DNA陽性列為SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一 2 抗ds DNA在活動(dòng)性SLE的病人中陽性率高 可達(dá) 以上 3 抗ds DNA可以作為監(jiān)測SLE病情的指標(biāo) 4 帶有16 6Id的抗ds DNA可以傳遞SLE 5 去除血液中的抗ds DNA可以使SLE的癥狀得到緩解 謝謝