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課時(shí)訓(xùn)練31　微生物的利用 1.(2018浙江金麗衢十二校8月高三第一次聯(lián)考)某同學(xué)要從土壤中分離出能分解尿素的細(xì)菌,并統(tǒng)計(jì)單位體積土壤樣液的活菌數(shù)目。按照培養(yǎng)基的配方稱取,并將各種物質(zhì)溶解后,用蒸餾水定容、滅菌,制成固體培養(yǎng)基備用?；卮鹣铝袉栴}。 (1)配制該培養(yǎng)基應(yīng)加入的凝固劑和顯色劑分別是　　　　　　　　　　　　,加入培養(yǎng)基的三角瓶需用　　　　　　蓋上后滅菌。 (2)培養(yǎng)分解尿素的細(xì)菌時(shí),在接種前需要檢測(cè)培養(yǎng)基是否被污染。采用的檢測(cè)方法是 　。 (3)若要統(tǒng)計(jì)土壤樣品中尿素分解菌的數(shù)目,宜采用　　　　　　　　　　　法接種,根據(jù)土壤樣品的稀釋倍數(shù)和接種稀釋液的體積,統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)目就能大約推測(cè)出樣品中的活菌數(shù)。一同學(xué)在稀釋倍數(shù)為10-4的培養(yǎng)基中測(cè)得平板上菌落數(shù)的平均值為24.6,則每升樣品中的活菌數(shù)是　　　　　　　個(gè)。與血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法相比,此計(jì)數(shù)方法測(cè)得的菌體數(shù)較　　　,其原因是　 　。 答案(1)瓊脂糖和酚紅(順序不可顛倒)　封口膜　(2)將未接種的培養(yǎng)基在適宜溫度下放置適宜的時(shí)間(或37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)),觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生　(3)稀釋涂布平板　2.46109　少　由于兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌連接在一起,往往統(tǒng)計(jì)的是一個(gè)菌落或死菌未計(jì)入,故用此方法測(cè)得的細(xì)菌數(shù)偏低(其他合理答案也可) 解析(1)從土壤中分離能分解尿素的細(xì)菌用尿素作為唯一氮源,凝固劑要加入瓊脂糖,顯色劑用酚紅。滅菌時(shí)三角瓶要用封口膜蓋住。(2)檢測(cè)培養(yǎng)基是否被污染,將未接種的培養(yǎng)基在適宜溫度下放置適宜的時(shí)間(或在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)),觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生,若沒有菌落出現(xiàn),說明沒有污染。(3)稀釋涂布平板法可用于計(jì)數(shù)。由于兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌連接在一起,往往統(tǒng)計(jì)的是一個(gè)菌落或死菌未計(jì)入,故用此方法測(cè)得的細(xì)菌數(shù)偏低。稀釋109倍,接種0.1 mL平板菌落平均值為24.6,則每升活菌數(shù)為2.46109個(gè)。 2.回答與微生物培養(yǎng)及應(yīng)用有關(guān)的問題。 (1)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓蒸汽滅菌時(shí),滅菌時(shí)間應(yīng)從　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　時(shí)開始計(jì)時(shí)。對(duì)于不耐熱的液體培養(yǎng)基,一般可將其轉(zhuǎn)入G6玻璃砂漏斗中,采用　　　　方式可較快地進(jìn)行過濾滅菌。 (2)與釀造果醋相比,利用大米、高粱等富含淀粉的原料制醋,需增加　　　　　　　　　　　　　　　　　的過程。某醋化醋桿菌培養(yǎng)基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇組成,其中甘露醇的主要作用是　　　　　　　　。 (3)為篩選胞外α-淀粉酶分泌型菌種,一般從　　　(A.果園樹下　B.肉類加工廠周圍　C.米酒廠周圍　D.枯樹周圍)獲得土樣,用無菌水稀釋,涂布到含有淀粉的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng),一段時(shí)間后在培養(yǎng)基表面滴加碘液,可在菌落周圍觀察到透明的水解圈。若要篩選酶活性較高的菌種,需挑選若干個(gè)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　比值大的菌落,分別利用液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)增。然后將培養(yǎng)液離心,取　　　　　　用于檢測(cè)酶活性。 (4)植物組織培養(yǎng)時(shí),先配制MS培養(yǎng)基,再加入一定比例的植物激素,當(dāng)生長(zhǎng)素相對(duì)較多時(shí),可促進(jìn)　　　　。 (5)植物組織培養(yǎng)和微生物培養(yǎng)都需要無菌操作,下列不適宜用高壓蒸汽滅菌的是(　　) A.接種環(huán)和鑷子 B.三角瓶和廣口瓶 C.發(fā)芽培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基 D.用于培養(yǎng)的幼莖和幼芽 答案(1)達(dá)到設(shè)定的溫度或壓力值　抽濾 (2)將淀粉分解成糖　作為碳源 (3)C　水解圈直徑與菌落直徑　上清液 (4)生根 (5)D 解析(1)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓蒸汽滅菌時(shí),滅菌時(shí)間應(yīng)從達(dá)到一定壓強(qiáng)(或自主設(shè)定的壓強(qiáng)或溫度值)時(shí)開始計(jì)時(shí)。對(duì)于不耐熱的液體培養(yǎng)基,一般可將其轉(zhuǎn)入G6玻璃砂漏斗中,采用抽濾方式可較快地進(jìn)行過濾滅菌。(2)與釀造果醋相比,利用大米、高粱等富含淀粉的原料制醋,需增加將淀粉水解為糖的過程。某醋化醋桿菌培養(yǎng)基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇組成,其中甘露醇的主要作用是作為碳源,并維持反應(yīng)體系的滲透壓。(3)胞外α-淀粉酶分泌型菌種,主要存活在含有大量淀粉的場(chǎng)所,C項(xiàng)符合題意。微生物在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí),消耗相應(yīng)物質(zhì),本題目中淀粉被水解消耗,會(huì)出現(xiàn)淀粉的水解圈,可通過判斷水解圈與菌落直徑比值確定菌種的分解能力,一般該比值越大,分解能力越強(qiáng)。該實(shí)驗(yàn)獲取的是胞外α-淀粉酶,因此離心后取上清液用于檢測(cè)酶活性。(4)植物組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)素相對(duì)較多時(shí),有利于生根,而細(xì)胞分裂素相對(duì)較多時(shí),則有利于生芽。(5)高壓蒸汽滅菌常用于培養(yǎng)基、培養(yǎng)器材等的滅菌,而用于培養(yǎng)的幼莖和幼芽則不能進(jìn)行任何滅菌操作,否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 3.飼養(yǎng)動(dòng)物常用的植物飼料中含有難溶的植酸鈣等物質(zhì),很難被動(dòng)物吸收利用,還影響對(duì)其他營養(yǎng)物質(zhì)的利用。若在飼料中添加植酸酶,則能催化其水解成為可以吸收利用的磷酸鹽等。以下是科研人員從作物根部土壤中分離出產(chǎn)植酸酶的菌株的過程示意圖。請(qǐng)分析回答下列問題。 (1)為防止雜菌污染,要對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿等進(jìn)行　　　　　　　　　　　,而且須將接種后的培養(yǎng)皿呈　　　　狀態(tài)放置。 (2)接種以前進(jìn)行的一系列稀釋操作,目的是在培養(yǎng)皿表面形成　　　　　　　。根據(jù)土壤樣品的稀釋倍數(shù)和接種稀釋液的體積,統(tǒng)計(jì)平板上的　　　　　　就能大致推測(cè)出樣品中的活菌數(shù)。 (3)由于植酸鈣的不溶解性,使培養(yǎng)基中形成白色渾濁。產(chǎn)植酸酶的菌株會(huì)水解植酸鈣,菌落的周圍將形成透明的區(qū)域,根據(jù)透明區(qū)域的有無,可初步判斷該菌是否產(chǎn)植酸酶,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A~E五種菌株中,　　　是產(chǎn)植酸酶的最理想菌株。 (4)獲得目的菌以后,若要用于植酸酶的生產(chǎn),還需要進(jìn)行　　　　　　　　。 答案(1)(高壓蒸汽)滅菌　倒置　(2)單個(gè)菌落　菌落數(shù)　(3)E　(4)擴(kuò)大培養(yǎng) 解析(1)為防止雜菌污染,要對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進(jìn)行(高壓蒸汽)滅菌處理,而且須將接種后的培養(yǎng)皿呈倒置狀態(tài)放置,以防止污染。(2)接種以前對(duì)樣品進(jìn)行稀釋的目的是在培養(yǎng)皿表面形成單個(gè)菌落;根據(jù)土壤樣品的稀釋倍數(shù)和接種稀釋液的體積,統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)就能大致推測(cè)出樣品中的活菌數(shù)。(3)根據(jù)題意,菌落體積越小,透明圈越大,說明產(chǎn)植酸酶越多,故E是產(chǎn)植酸酶的最理想菌株。(4)獲得目的菌后,若用于植酸酶的生產(chǎn),還需要進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。 4.自生固氮菌是一類能獨(dú)立固定氮?dú)獾募?xì)菌,其中有些好氧種類能產(chǎn)生PHB(一種生物可降解的熱塑性塑料)?，F(xiàn)欲從活性污泥中分離、純化、篩選出高產(chǎn)PHB的固氮菌,操作流程如下,請(qǐng)回答下列問題。 采集土樣→富集培養(yǎng)→分離、純化培養(yǎng)→初步篩選PHB固氮菌→篩選高產(chǎn)PHB固氮菌→保存?zhèn)溆? (1)富集培養(yǎng)時(shí),為達(dá)到篩選自生固氮菌的目的,在配制培養(yǎng)液時(shí)不應(yīng)添加　　　　　　　。培養(yǎng)時(shí)要將裝有培養(yǎng)液的錐形瓶放置在搖床上振蕩培養(yǎng),主要目的是為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供　　　　　　　　　　。 (2)篩選高表達(dá)菌株的方法之一是經(jīng)涂布分離獲得　　　　　。進(jìn)行分離、純化培養(yǎng)時(shí),要先將培養(yǎng)基倒入　　　　　　中,制成平板,此時(shí)所使用的培養(yǎng)基與富集培養(yǎng)時(shí)有所不同,添加了一定量的　　　　　　　。 (3)在純化過程中,在固體培養(yǎng)基上劃線時(shí),下列操作正確的是　　　　。 A.接種環(huán)采用70%酒精滅菌 B.接種時(shí)應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行 C.劃線時(shí)要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)的劃線相連 D.劃線分離時(shí),需要把接種環(huán)深入到培養(yǎng)基中進(jìn)行接種 答案(1)含氮物質(zhì)(氮源)　充足的氧氣 (2)單菌落　培養(yǎng)皿　瓊脂(糖) (3)B 解析(1)固氮菌能夠固定氮?dú)?因此培養(yǎng)該細(xì)菌時(shí),培養(yǎng)基中不應(yīng)添加含氮物質(zhì)。進(jìn)行菌種擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí),將裝有培養(yǎng)液的錐形瓶放置在搖床上振蕩培養(yǎng),主要目的是為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供充足的氧氣。 (2)獲得高表達(dá)菌株的方法之一是經(jīng)涂布分離獲得單菌落。進(jìn)行分離純化,需要先將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)皿中,制備固體培養(yǎng)基平板,相比較液體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基中添加了一定量的凝固劑,由于本實(shí)驗(yàn)中不能加入含氮物質(zhì),因此凝固劑應(yīng)選擇瓊脂(糖)。 (3)接種環(huán)采用灼燒滅菌,A項(xiàng)錯(cuò)誤。接種操作應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行,防止空氣中雜菌的污染,B項(xiàng)正確。劃線分離的目的是通過劃線,降低菌種密度,進(jìn)而獲得單菌落,因此第一區(qū)不能與最后一區(qū)劃線相連,C項(xiàng)錯(cuò)誤。劃線分離時(shí),在培養(yǎng)基的表面上輕輕劃線,接種環(huán)不能深入到培養(yǎng)基中,D項(xiàng)錯(cuò)誤。 5.某村莊有一條小溪,近幾年由于上游幾家乳膠廠不斷向其中排放廢水,小溪變得不再清澈。某同學(xué)想測(cè)定該溪水中的細(xì)菌含量情況?；卮鹣铝袉栴}。 (1)先根據(jù)所學(xué)知識(shí)制備LB培養(yǎng)基。制備該培養(yǎng)基的步驟是計(jì)算→稱量→溶化→滅菌→倒平板,下列關(guān)于制備LB培養(yǎng)基的敘述,錯(cuò)誤的是　　　　。 A.培養(yǎng)基應(yīng)先調(diào)pH再進(jìn)行滅菌 B.培養(yǎng)基應(yīng)先滅菌再分裝到培養(yǎng)皿 C.熔化瓊脂時(shí)不能使培養(yǎng)基溢出或燒焦 D.滅菌時(shí)一般用高壓蒸汽滅菌鍋在121 ℃,500 g/cm2壓力下滅菌15 min (2)該同學(xué)利用上述制備的培養(yǎng)基來檢測(cè)水樣中的細(xì)菌數(shù)量,他所選擇的分離方法應(yīng)是　　　　　　　　　　;該同學(xué)在接種前,隨機(jī)取若干滅菌后的空白平板先培養(yǎng)了一段時(shí)間,這樣做的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　。接種在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行,工作臺(tái)上實(shí)驗(yàn)前一段時(shí)間需打開,實(shí)驗(yàn)中需關(guān)閉的是　　　(A.酒精燈　B.照明燈　C.紫外燈　D.過濾風(fēng))。 (3)值得注意的是,他所選擇的這種方法統(tǒng)計(jì)的結(jié)果往往比實(shí)際細(xì)菌的數(shù)目要低,這是因?yàn)棰佟　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　?②　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。(不考慮實(shí)驗(yàn)操作原因引起的細(xì)菌數(shù)目的變化) (4)該同學(xué)欲將分離出的某種細(xì)菌臨時(shí)保藏,應(yīng)接種到試管的　　　　培養(yǎng)基上,等菌落長(zhǎng)成后,放入冰箱低溫保藏。 答案(1)D (2)涂布分離法　檢查平板滅菌是否徹底　C (3)該方法只能統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目,死菌無法統(tǒng)計(jì)　當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí),平板上觀察到的只是一個(gè)菌落 (4)斜面 解析(1)高壓蒸汽滅菌一般滅菌條件是121 ℃,1 kg/cm2滅菌15 min,若是含有葡萄糖等易碳化的物質(zhì),則需要在121 ℃,500 g/cm2下滅菌30 min,D項(xiàng)錯(cuò)誤。(2)涂布分離法可以用于菌種數(shù)量的檢測(cè)。在接種前,一般需準(zhǔn)備滅菌的空白平板先培養(yǎng)一段時(shí)間,主要目的是檢測(cè)平板是否滅菌徹底。紫外燈對(duì)生物體有傷害,進(jìn)行倒平板、接種等操作時(shí),需要關(guān)閉超凈臺(tái)上的紫外燈。(3)采用涂布分離法進(jìn)行菌種的計(jì)數(shù),通常會(huì)比實(shí)際數(shù)目偏低,主要原因是涂布分離法只能統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目,死菌無法統(tǒng)計(jì),并且當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí),平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。(4)進(jìn)行菌種的臨時(shí)保藏,需先將菌種接種在斜面上,然后在37 ℃下培養(yǎng)12~24 h,最后置于4 ℃冰箱中保存。 6.苯酚及其衍生物廣泛存在于工業(yè)廢水中,對(duì)環(huán)境有嚴(yán)重危害。小明同學(xué)準(zhǔn)備依據(jù)下圖操作步驟,從處理廢水的活性污泥中分離篩選酚降解高效菌株。請(qǐng)回答下列問題。 (1)酚降解菌富集培養(yǎng)基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水,其中可作為碳源的有　　　　　　　　　　。 (2)將采集到的樣品接種培養(yǎng),苯酚用量應(yīng)隨轉(zhuǎn)接次數(shù)增加而逐漸　　　　,以達(dá)到富集酚降解菌的目的。若上圖平板中菌落過于密集,應(yīng)進(jìn)一步　　　　　　　　,以便于菌落計(jì)數(shù)與分離。制備平板培養(yǎng)基時(shí)除了需要水、營養(yǎng)物質(zhì)外,還必須添加　　　　　　。 (3)下圖為連續(xù)劃線法示意圖,在圖中　　　(填圖中序號(hào))區(qū)域更易獲得單菌落。 答案(1)蛋白胨、苯酚 (2)增加　稀釋涂布　凝固劑(瓊脂) (3)③ 解析本題考查土壤微生物的分離及計(jì)數(shù)。(1)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)一般都包括H2O、無機(jī)鹽、碳源、氮源,蛋白胨和苯酚中含有C元素,可作為碳源。 (2)要富集該菌,應(yīng)提高苯酚含量。若菌落過于密集,說明稀釋倍數(shù)不夠,應(yīng)進(jìn)一步稀釋,然后再涂布平板。制備固體培養(yǎng)基時(shí)需加入凝固劑瓊脂。 (3)用平板劃線法接種菌體,隨劃線次數(shù)的增加,菌體數(shù)量逐漸減少,故③區(qū)域更易獲得單菌落。 7.回答與微生物分離有關(guān)的問題。 由于酵母菌直接利用淀粉的能力很弱,有人將地衣芽孢桿菌的α- 淀粉酶基因轉(zhuǎn)入酵母菌中,經(jīng)篩選得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌種(過程如圖甲所示)。 (1)圖甲中,①過程需要的酶有　　　　　　　　　　　　　　　　　。為達(dá)到篩選目的,平板內(nèi)的固體培養(yǎng)基應(yīng)以　　　　　為唯一碳源。②③過程需要重復(fù)幾次,目的是進(jìn)一步篩選純化獲得　　　　　　　　　　　　的酵母菌。 (2)某同學(xué)嘗試③過程的操作,其中一個(gè)平板經(jīng)培養(yǎng)后的菌落分布如圖乙所示,該同學(xué)的接種方法是　　　　　　　　　　;推測(cè)該同學(xué)接種時(shí)可能的操作失誤是　　　　　　　　　。 (3)上述工程酵母菌培養(yǎng)過程中,有關(guān)操作正確的是　。 A.玻璃刮刀和接種環(huán)一樣,只需灼燒滅菌 B.培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)皿后進(jìn)行滅菌 C.倒平板和取菌液都必須在酒精燈火焰旁進(jìn)行 D.獲得的菌種如果需要保存,可置于37 ℃恒溫保存 答案(1)限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶　淀粉　分解淀粉能力強(qiáng) (2)涂布分離法　涂布不均勻 (3)C 解析(1)圖甲①過程表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建,該過程先要用同種限制性核酸內(nèi)切酶切割含有目的基因的外源DNA分子和質(zhì)粒,再用DNA連接酶將目的基因和載體連接起來形成重組質(zhì)粒。普通酵母菌直接利用淀粉的能力很弱,而工程酵母菌可以高效利用淀粉,所以用以淀粉為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基可以選出工程酵母菌。②③過程重復(fù)幾次的目的是純化獲得分解淀粉能力強(qiáng)的酵母菌。 (2)由圖乙可知,該同學(xué)采用的是涂布分離法,但菌落比較集中,沒有很好地分散開來,可能是涂布不均勻?qū)е碌摹? (3)玻璃刮刀需先用70%的酒精消毒,然后再灼燒滅菌,A項(xiàng)錯(cuò)誤。培養(yǎng)基先進(jìn)行滅菌后分裝到培養(yǎng)皿,B項(xiàng)錯(cuò)誤。倒平板和取菌液都必須在酒精燈火焰旁進(jìn)行,C項(xiàng)正確。獲得的菌種如果需要保存,若臨時(shí)保存,則置于4 ℃的冰箱中保存,若長(zhǎng)期保存則置于-20 ℃冷凍箱中保存,D項(xiàng)錯(cuò)誤。