PCR實用技巧 BIOX.CN 2005-5-13 9:37:19 來源：互聯(lián)網(wǎng) 　 增加PCR的特異性： 1.primersdesign 這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件 a.足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產量 b.GC%40%~~~~60%c.5端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性 d.避免3端GCrich,最后3個BASE不要有GC,或者最后5個有3個不要是GC e.避免3端的互補,否則容易造成DIMERf.避免3端的錯配g.避免內部形成二級結構 h.附加序列(RTsite,Promotersequence)加到5端,在算Tm值時不算,但在檢測互補和二級結構是要加上它們 i.使用兼并引物時,要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1uM-3uM) j.最好學會使用一種designsoftware.PP5,Oligo6,DNAstar,VectorNTI,Online　desginetal. *引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。 設定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。 有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。 根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。 為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃ 或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。 2.stabilityofprimers 定制引物的標準純度對于大多數(shù)PCR應用是足夠的。 引物產量受合成化學的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為水的pH經(jīng)常偏酸，會引起寡核苷的水解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個月。 3.optimizereactantsconcentration a.magnesiomions Mg離子的作用主要是dNTP-Mg與核酸骨架相互作用并能影響Polymerase的活性，一般的情況下Mg的濃度在0.5-5mM之間調整，同樣要記住的是在調整了dNTPs的濃度后要相應的調整Mg離子的濃度，對實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液 b.其他的離子 NH4+K+都會影響PCR，增加K+的濃度后,會因為中和了核酸骨架上磷酸基團的負電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的嚴謹性(stringency)，NH4+也有相同的作用.MBI公司的TAQ酶就提供了兩種BUFFER,一種是加Mg的一種是已經(jīng)混合了(NH4)2SO4的，當然,過高的陽離子濃度(KCL>0.2M)時,DNA在94度根本不會發(fā)生變性,當然也就無從談起PCR了. c.polymerase 不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度，一些高保真沒的效率要遠遠低于Taqpolymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.另外,一般的情況下,變性的溫度可以使用90~92度,變性的時間也可以縮短,從而保證polymerase的活性 d.template 50ulPCRSYSTEM ================================ humangDNA0.1ug-1ug E.Coli10ng-100ng LamadaDNA0.5ng-5ng PlasmidDNA0.1ng-10ng ================================ 4.termperature a.denaturation 常規(guī)是94度5分鐘,GCRich的摸板是95度5分鐘 除了GCRich外,常規(guī)的APPLICATIONS可以將這部分時間縮短到1到2分鐘,或者在CYCLE1時給予較長的時間,而取消開始的denaturation b.annealing 重點到了：一般情況下,是從55度開始.根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進行調整.有條件的可以做gradientpcr.退火的時間在30-60S,時間短一些可以得到更好的效果.因為,polymerase在annealingtemp.時也會有一些活性.所以在A.T.的時間過長,會極大的增加非特異性擴增的風險，另外,在對于一些困難戶,比如從gDNA里擴增大片段,還可使用twostepPCR. 5.touchdownPCR 原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子，ANNEALINGTEMP.55度 945min9430s6030s721min2cycles9430s5930s 721min2cycles9430s5830s721min2cycles9430s 5130s721min2cycles9430s5030s 721min20cycles725min 6.hotstartPCR 熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管TaqDNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產生非特異性的產物。這些非特異性產物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構建和操作，熱啟動PCR尤為有效。 限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產物的擴增。 熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入TaqDNA聚合酶，在反應體系達到90度時，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個方法過于煩瑣，尤其是對高通量應用，并容易造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。 ======================= ampliwaxPCRGems(PerkinElmer) TaqBeadHotStartPolymerase(Promega) Magnesiumwaxbeads(Stratagene). ========================= 象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應用。 還有一種方法是使用inactiveDNAPolymerase.polymerase被抗體抑制失活，當變性溫度超過70度時，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。 7.BoosterPCR 我們知道1ughumangenomicDNA大約在3X105冪個模板分子,這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結合.當模板的濃度過低,比如低于100個分子時,引物和模板之間就很難發(fā)生反應.引物容易自身進行反應形成二聚體.這樣就有來了個boosterPCR我一直找不到合適的詞來翻譯這個booster. 具體是這樣的.開始幾個cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的molarratio在107~108.以確保開始擴增的準確性.然后boostePrimer的濃度到正常的水平 8.循環(huán)數(shù)和長度 確定循環(huán)數(shù)的基本原理是:產物能夠保證你進一步分析操作的最小循環(huán)數(shù).因為過多的循環(huán)數(shù)容易造成ERRORS和非特異性產物的積累產物的量不夠,優(yōu)化的方法有: 1.增加TEMPLATE 2.增加循環(huán)數(shù) 如何確定循環(huán)數(shù),有一個方法. 做一個PCR體系,40循環(huán),50ul,分別在20,25,30,35循環(huán)時從體系中取5ul,一起跑電泳分析.從而確定最佳的循環(huán)數(shù) 另一個會影響PCR特異性的是PCRcycling時在兩個溫度間變化的速率(rampingrate).當然是越高越好.不過咱們大部分條件有限,就那么幾臺PCR儀,也沒有多少挑選的余地 9.thermalcycler PCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視.長時間的使用后需要調整PCR儀,以保證其能夠到達正確的溫度.現(xiàn)在的PCR儀基本上都有自檢功能(self-diagnosis). 10.PCRadditives 附加物或者說enhancer實在是多種多樣.基本上包括幾類,能夠增加反應退火效率的化學因子,DNA結合蛋白和一些商業(yè)試劑.基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯配,增加產物的長度和產量. 在GCRich情況中,additive可以造成配對堿基間的的不穩(wěn)定,從而提高擴增的效率.而在另一種情況下,additive由于造成錯配的primer-template復合物的極大的不穩(wěn)定,而提高了擴增的忠實性.要注意的是,沒有萬能的enhancer全部通用,需要你根據(jù)自己的情況,最好結合gradientpcr選擇最優(yōu)條件. ==================================================== dimethylsulfoxide(DMSO)upto10% formamideat5% trimethylammoniumchloride10-100uM detergentssuchasTween200.1-2.5% polyethyleneglycol(PEG)60005-15% glycerol10-15% singlestrandedDNAbindingproteins Gene32protein1nM E.colisingle-strandedDNAbindingprotein5uM 7deaza-dGTP(forGCrich)150uMwith50uMdGTP TaqExtender(stratagene) PerfectMatchPCREnhancer(stratagene) Q-solution(Qiagen) ==================================================== 要注意的是,DMSO,GLYCEROL等會抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最適的濃度 11.TemplateDNApreparation 提取DNA時的試劑會抑制PCR反應的順利進行.因此需要對TEMPLATEDNA進行純化.特別是SDS(<0.01%)的情況下就能強烈抑制PCR的進行.可以加入一些nonionic試劑,如Tween,Nonid,Trition之類的反過來抑制SDS.還有proteinaseK也要除干凈,不然會降解polymerase. 12.NestedPCR 簡單點說設計兩對引物,一對是長的,一對是包含在長引物內的,用長引物擴增的產物作為第二次擴增的模板,這樣可以增加產物的量.而且可以減少非特異性帶和錯配的情況. 增加PCR的保真性 高保真酶 高溫DNAPOLYMERASE是以單鏈DNA或RNA為模板，在dNTP和一些陽離子的存在情況下，在特定的引物指導下按3-5方向合成DNA.包括3種類型 a.5-3方向的DNA合成能力,沒有3-5方向的外切酶特性.如Taq及其突變體.這類酶的合成能力強,因為他不糾正合成中出現(xiàn)的突變 b.與a類似,有合成活性,沒有3-5的外切活性.但他們能以RNA為模板,合成DNA.如TthDNAPolymerase c.有DNA聚合活性,沒有逆轉錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfuDNAPolymerase.可以提高忠實性。但是這些聚合酶的產量比TaqDNA聚合酶低。 酶的混合物 將TaqDNA聚合酶同帶有3到5外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨TaqDNA聚合酶高的忠實性，并可以得到高產量及擴增長模板。 其他因素 除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會降低忠實性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加精確度如果四種核苷的濃度不同，忠實性會受影響。進行較少的PCR循環(huán)也會有助于增加忠實性，因為增加循環(huán)數(shù)目和產物長度就會增加突變可能性。 1．簡介 寡聚核苷酸引物的選擇，通常是整個擴增反應成功的關鍵。所選的引物序列將決定PCR產物的大小、位置、以及擴增區(qū)域的Tm值這個和擴增物產量有關的重要物理參數(shù)。好的引物設計可以避免背景和非特異產物的產生，甚至在RNA-PCR中也能識別cDNA或基因組模板。引物設計也極大的影響擴增產量：若使用設計粗糙的引物，產物將很少甚至沒有；而使用正確設計的引物得到的產物量可接近于反應指數(shù)期的產量理論值。當然，即使有了好的引物，依然需要進行反應條件的優(yōu)化，比如調整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。 計算機輔助引物設計比人工設計或隨機選取更有效。一些影響PCR反應中引物作用的因素諸如溶解溫度、引物間可能的同源性等，易于在計算機軟件中被編碼和限定。計算機的高速度可完成對引物位置、長度以及適應用戶特殊條件的其他有關引物的變換可能性的大量計算。通過對成千種組合的檢測，調整各項參數(shù)，可提出適合用戶特殊實驗的引物。因此通過計算機軟件選擇的引物的總體“質量”（由用戶在程序參數(shù)中設定）保證優(yōu)于通過人工導出的引物。 需要指出的是，引物不必與模板完全同源，因此可包含啟動子序列、限制酶識別位點或5’端的各種修飾，這種對引物的修飾不會妨礙PCR反應，而會在以后使用擴增子時發(fā)揮作用。 2．基本PCR引物設計參數(shù) 引物設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。特異性是指發(fā)生錯誤引發(fā)的頻率。特異性不好或劣等的引物會產生額外無關和不想要的PCR擴增子，在EB染色的瓊脂糖凝膠上可見到；引物效率是指在每一PCR循環(huán)中一對引物擴增的產物與理論上成倍增長量的接近程度。 ①引物長度； 特異性一般通過引物長度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫度設置在近于引物Tm值（引物/模板雙鏈體的解鏈溫度）幾度的范圍內，18到24個堿基的寡核苷酸鏈是有很好的序列特異性的。引物越長，擴增退火時被引發(fā)的模板越少。為優(yōu)化PCR反應，使用確保溶解溫度不低于54℃的最短的引物，可獲得最好的效率和特異性。 總的來說，最好在特異性允許的范圍內尋求安全性。每增加一個核苷酸，引物特異性提高4倍；這樣，大多數(shù)應用的最短引物長度為18個核苷酸。引物設計時使合成的寡核苷酸鏈（18～24聚物）適用于多種實驗條件仍不失為明智之舉。 ②引物的二級結構 包括引物自身二聚體、發(fā)卡結構、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結合從而影響引物效率。對于引物的3’末端形成的二聚體，應控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三個連續(xù)的堿基互補，因為此種情形的引物二聚體有進一步形成更穩(wěn)定結構的可能性，引物中間或5’端的要求可適當放寬。引物自身形成的發(fā)卡結構，也以3’端或近3’端對引物-模板結合影響更大；影響發(fā)卡結構的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外，與莖環(huán)結構形式亦有很大的關系。應盡量避免3’末端有發(fā)卡結構的引物。 ③引物GC含量和Tm值 PCR引物應該保持合理的GC含量。含有50％的G+C的20個堿基的寡核苷酸鏈的Tm值大概在56～62℃范圍內，這可為有效退火提供足夠熱度。一對引物的GC含量和Tm值應該協(xié)調。協(xié)調性差的引物對的效率和特異性都較差，因為降低了Tm值導致特異性的喪失。這種情況下引物Tm值越高，其錯誤引發(fā)的機率也越大。若采用太高的退火溫度，Tm值低的引物對可能完全不發(fā)揮作用。在從一批在特定序列范圍內已合成好的寡核苷酸中選擇一對新的引物時，這種GC含量和Tm值的協(xié)調非常關鍵。一般來說，一對引物的Tm值相差盡量不超過2～3攝氏度，同時引物和產物的Tm值也不要相差太大，20攝氏度范圍內較好。 ④引物的額外序列與退火溫度 若有額外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶結合位點、限制酶切位點或者GC發(fā)夾結構可以使用加長的引物。一般說來，引物5’端添加無關序列不會影響引物特異序列的退火。有時候，引物中添加了大量與模板不配對的堿基，可以在較低退火溫度的條件下進行4到5個擴增循環(huán)；然后在假定引物5’端序列已經(jīng)加入到模板中，計算得出的退火溫度下進行其余的循環(huán)。 在引物上添加限制酶位點時一個重要的考慮是大多數(shù)限制酶的有效切割要求在它們的識別序列的5’端有2至3個非特異的額外堿基，這樣就會增加引物的非模板特異序列的長度。長引物序列的另一個缺點是影響溶解溫度的精確計算，而這對于確定PCR反應時的退火溫度又是必須的。對于低于20個堿基的引物，Tm值可以根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)計算。而對于較長的引物，Tm值需要考慮動力學參數(shù)、從“最近鄰位”的計算方式得到，現(xiàn)有的PCR引物設計軟件大多數(shù)都采用這種方式。 ⑤引物的3’末端核苷酸組成 引物3’末端和模板的堿基完全配對對于獲得好的結果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6個核苷酸的錯配應盡可能的少。如果3’末端的錯配過多，通過降低反應的退火溫度來補償這種錯配不會有什么效果，反應幾乎注定要失敗。 引物3’末端的另一個問題是防止一對引物內的同源性。應特別注意引物不能互補，尤其是在3’末端。引物間的互補將導致不想要的引物雙鏈體的出現(xiàn)，這樣獲得的PCR產物其實是引物自身的擴增。這將會在引物雙鏈體產物和天然模板之間產生競爭PCR狀態(tài)，從而影響擴增成功。 引物3’末端的穩(wěn)定性由引物3’末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個堿基的ΔG。此值的大小對擴增有較大的影響，負值大，則3’末端穩(wěn)定性高，擴增效率更高，同時也更易于異位引發(fā)。 需要注意的是，引物3’末端應盡量避免T。實驗證明，以T結尾的引物即使與T,G或C錯配仍可有效延伸。 ⑥PCR產物的長度及在耙序列內的位置 所有的計算機程序都提供對PCR產物長度范圍的選擇。一般說來，PCR產物長度對擴增效率有影響。特定的應用情況下，PCR產物長度部分取決于模板材料。 預期產物的特定長度經(jīng)常取決于應用的需要。若目的是建立測定特異DNA片段的臨床檢驗方法，120～300bp的小DNA擴增產物可能是最好的。產物應具有好的特異性和高的產生效率，并含有能用于探針捕捉雜交實驗的足夠信息。這一長度范圍的產物可以通過采用兩步擴增循環(huán)方法得到，從而減少擴增時間。 其他PCR方法有不同的最佳產物長度。例如，通過定量的RNA-PCR檢測基因表達時，產物應該足夠大以便構成競爭性模板，這樣，產物和競爭物都能夠在凝膠上很容易的分辨出來。這些產物一般在250～750bp范圍內。 ⑦補充說明 若在cDNA序列內找尋PCR引物，需特別注意兩點：首先，盡力將引物和產物保持在mRNA的編碼區(qū)域內，因為這是生成蛋白質的獨特序列，不像3’末端非編碼區(qū)域與許多其他mRNA有同源性；第二，盡力把引物放在不同的外顯子上，以便使RNA特異的PCR產物與從污染DNA中產生的產物在大小上相區(qū)別。 若PCR的目的是克隆一個基因或cDNA的特異序列，產物的大小是根據(jù)具體應用預選的。在這里，計算機程序可以提供關于期望區(qū)域側翼選擇引物對的信息。 在選擇用來擴增來自不同物種DNA的引物時，應避開mRNA的5’和3’末端非翻譯區(qū)序列，因為它們可能沒有任何的同源性。 3．簡并引物設計 ①設計簡并引物時，一定要檢查靶擴增區(qū)域選定氨基酸遺傳密碼的簡并度。很顯然，我們期望選擇簡并度最低的氨基酸，達到提高特異性的目的。 ②充分注意物種對于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡并性。 ③應努力避免3’末端的簡并，對于大多數(shù)氨基酸殘基來說，意味著引物3’末端不要位于密碼子的第三位。 ④在一些多義位置使用脫氧次黃嘌呤（dI）代替簡并堿基。 4．測序引物設計 當然，測序引物的設計一般都由測序公司來完成，如果需要自己設計的話；那么除了按照上面所提到的引物設計通用標準外，還需要注意兩點： ①測序引物的特異性的標準掌握應該更嚴格一些，也就是說設計時更優(yōu)先考慮特異性。因為在測序反應中，如果引物與模板在非預期位置退火并引發(fā)鏈延伸，會對結果對來很大的干擾甚至造成結果無法識讀。 ②測序引物的Tm值適當高一些?，F(xiàn)在大部分測序反應均選用耐熱的測序級DNA聚合酶來催化，并采用PCR的熱循環(huán)程序。選用的測序引物的Tm值稍高一些，有助于使反應順利跨過待測模板的二級結構區(qū)，也有助于降低非特異反應。 5．探針的設計 探針的設計，根據(jù)不同的用途各有其設計特點，這里只是就通用的原則進行討論： ①探針的長短一般在20-50核苷酸之間，過長合成成本高，且易出現(xiàn)聚合酶合成錯誤，雜交時間長。太短則特異性下降。 ②注意G和C的含量努力控制在40-60％，同時一種堿基連續(xù)重復不超過4個，以免非特異性雜交產生。 ③探針自身序列不能形成二聚體，也不能有“發(fā)夾”結構存在，這一點上的要求就要比普通引物設計嚴格得多。 ④如果探針地靶目標是多個基因的混合物，就必須控制該探針與無關基因之間的相似性在70%以下。 PCR中常見問題分析與對策． PCR產物的電泳檢測時間 一般認為PCR產物應在48h以內完成電泳檢測，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型就會出現(xiàn)不規(guī)則，甚至消失。