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聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離血清蛋白 [實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯 (1)學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳原理。 (2)掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術(shù)。 (3)比較醋酸纖維薄膜電泳與聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離血清蛋白的操作效果。 [實(shí)驗(yàn)原理] 帶電質(zhì)點(diǎn)在電場作用下，會(huì)向兩極移動(dòng)；帶正電荷的移向負(fù)極，帶負(fù)電荷的移向正極，這種現(xiàn)象稱為電泳。 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在加速劑N，N，N，N—四甲基乙二胺(簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(簡稱AP)或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)。 [實(shí)驗(yàn)試劑] 1、待測樣品：新鮮血清 2、制備分離膠、濃縮膠有關(guān)試劑： (1)凝膠緩沖液：稱取1 mol/L HCl 48ml,Tris(三羥基氨基甲烷)36.6g,TEMED 0.23mL,加重蒸餾水至80mL 使其溶解，調(diào)pH8.9，然后加重蒸餾水定容至100mL ，至棕色瓶，冰箱儲(chǔ)藏。 (2)分離膠貯液，一般有兩種配法： ⅰ28％Acr-0.735％Bis貯液：丙烯酰胺28.0克，甲叉雙丙烯酰胺0.735克,加重蒸餾水使其溶解然后定容至100mL. ⅱ30％Acr-0.8％Bis貯液:Acr30.0克,Bis0.8克,加重蒸餾水使其溶解定容至100mL. 以上兩種溶液需用棕色試劑瓶盛放,4℃儲(chǔ)存,一般可放置一個(gè)月左右. (3)分析純過硫酸銨(AP)(AR)0.14g加重蒸水100mL,棕色瓶,4℃儲(chǔ)存僅能用一周,最好當(dāng)天配置.上述三種試劑用于制備分離膠. (4)濃縮膠緩沖液:稱取1mol/LHCL48mL,Tris5.98g,TEMED 0.46mL,加重蒸水至80mL,調(diào)pH6.7,用重蒸水定容至100mL,棕色瓶4℃儲(chǔ)存. (5)濃縮膠貯液:稱取Acr10g，Bis2.5g，加重蒸水溶解定容100mL，過濾后至棕色瓶4℃貯存。 (6)40％蔗糖溶液（W/V） (7)核黃素4.0mg,加重蒸水溶解,定容至100mL,棕色瓶4℃貯存.以上(4)-(7)4種溶液用于配置濃縮膠. 3.Tris-甘氨酸電極緩沖液(pH8.3) 稱取Tris 6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸餾水至900mL,調(diào)pH之后定容至1000mL,4℃貯存,使用前稀釋10倍. 4. 0.1％溴酚藍(lán)指示劑. 5.染色液 染色液種類較多,染色方法也不完全相同,詳細(xì)染色法如下: 方法 固定 染液 染色時(shí)間 脫色 氨基黑-10B 甲醇 7％乙酸 0.1mol/LNaOH中1％氨基黑 7％乙酸中0.5％-1％氨基黑 5 min(室溫) 2h(室溫) /10min(96℃) 5％乙醇 7％乙酸 考馬斯亮藍(lán)R250 20％磺基水楊酸 10％三氯乙酸 0.25％R250水液 10﹪三氯乙酸-10％R250 19:1(體積比) 5％磺基水楊酸和1％ R250 19:1(體積比) 5min(室溫) 30min室溫) 1h(室溫) 7％乙酸 10﹪三氯乙酸 90％甲酸 考馬斯亮藍(lán)G250 6％乙酸 12.5﹪三氯乙酸 6﹪乙酸中1％G250 12.5﹪三氯乙酸中0.1﹪G250 10min室溫) 30min室溫) 甲醇-水-濃氨 64:63:1 Ponceau 3R 12.5％三氯乙酸 0.1mol/LNaOH中0.1％3R 2min室溫 5％乙醇 固綠 7％乙酸 7％乙酸中1％固綠 2h(5℃) 7％乙酸 氨基萘酚磺酸 2mol/L HCL浸幾秒鐘 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液pH6.8中0.003％染料 3min 本實(shí)驗(yàn)采用0.05％考馬斯亮藍(lán)R250染色液中,含20％磺基水楊酸,其優(yōu)點(diǎn)是染色固定同時(shí)進(jìn)行,背景易脫色. 0.05％考馬斯亮藍(lán)R250的20％磺基水楊酸染液:考馬斯亮藍(lán)0.05g,磺基水楊酸20g,加蒸餾水至100mL,過濾后至試劑瓶內(nèi)保存. 6.脫色液 0.1mol/lNaCl溶液 7.保存液 甘油10mL,冰乙酸7mL,加蒸餾水至100mL 8.1％瓊脂糖溶液 瓊脂1g,加已稀釋10倍的電極緩沖液,加熱溶解,4℃貯存?zhèn)溆?，使用時(shí)取出加熱成液體，待稍微冷卻后用膠頭滴管吸取使用，膠頭滴管使用完后立即清洗干凈. [實(shí)驗(yàn)儀器] 夾心式垂直板電泳槽，樣品槽模板，直流穩(wěn)壓電源（電壓300—600V，電流50—100mA），吸量管（1mL，5mL，10mL），燒杯，細(xì)長頭滴管，1mL注射器及6號(hào)長針頭，微量注射器，水泵或油泵，真空干燥器，培養(yǎng)皿（直徑120mm），玻璃板，日光燈一臺(tái) [實(shí)驗(yàn)步驟] 一、 安裝夾心式垂直板電泳槽 夾心式垂直板電泳槽操作簡單，不易滲漏，其裝置如圖 1.導(dǎo)線接頭 2.下貯槽 3.凹形橡膠框 1.樣品槽模板 2.長玻璃板 4.樣品槽模板 5.固定螺絲 6.上貯槽 3.短玻璃板 4.凹形橡膠框 7.冷凝系統(tǒng) 各部件依下列順序組裝: (1) 裝上貯槽和固定螺絲，勿使上下貯槽在外連通，使用橡皮管時(shí)用夾子夾住. (2) 玻璃板洗凈后用吹風(fēng)機(jī)吹干，清洗玻璃板時(shí)不得用刷子刷，可用紗布或海綿擦洗，以免在玻璃表面上留下刮痕，清洗后不得用紙或布擦干，將長短玻璃板分別插在硅相框的凹形槽中，注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。 (3) 將已插好玻璃板的橡膠框平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對上貯槽。 (4) 將下貯槽的銷孔對準(zhǔn)已裝好螺絲銷釘?shù)纳腺A槽，雙手以對角線方式旋緊螺絲帽。 (5) 豎直電泳槽，在長玻璃板下端與硅?？蚪唤绲目p隙內(nèi)加入已融化的1％瓊脂，其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂應(yīng)避免里面有氣泡。 二、配膠 目前用于PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）凝膠貯液有30％Acr-0.8％Bis及28％Acr-0.735％Bis 2種，以它們?yōu)槟敢嚎梢耘渲貌煌瑵舛鹊姆蛛x膠。 不同濃度的分離膠及濃縮膠配置方法見下表： 試劑名稱 用量/mL 20mLPAA終濃度 20mLPAA終濃度 分離膠 5.5％ 7.0％ 10.0％ 5.0％ 7.5％ 10.0％ (1)分離膠緩沖液pH8.9Tris-HCl(TEMED) 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 (2)凝膠貯液 A.28％Acr-0.735％Bis 3.93 5.00 7.14 —— —— —— B.30％Acr-0.8％Bis —— —— —— 3.33 5.00 7.14 重蒸餾水 3.57 2.50 0.36 4.17 2.50 0.83 充分混勻后，置于真空干燥器中，抽氣10分鐘 （3）0.14％AP 10 10 10 10 10 10 濃縮膠 (4)濃縮膠緩沖液pH6.7Tris-HCl(TEMED) 2.5％PAA 1 3.75％PAA 1 （5）濃縮膠貯液 10％Acr-2.5％Bis 2 3 （6）40％蔗糖 4 3 充分混勻后，置于真空干燥器中，抽氣10分鐘 （7）0.004％核黃素 1 1 三、制備凝膠板 PAGE有連續(xù)體系和不連續(xù)體系，其灌膠方式不完全相同，分別敘述如下： a) 連續(xù)體系 本實(shí)驗(yàn)采用28％Acr-0.735％Bis 凝膠貯液，從冰箱取出各種貯液，平衡至室溫后，按上表的配比配制20mL 7.0％凝膠。前三種溶液混合在一小燒杯內(nèi)，（3）號(hào)液單獨(dú)放置一小燒杯。二者抽氣后混合均勻，立即用細(xì)長頭滴管將分離膠溶液加到凝膠膜長、短玻璃板間的夾縫內(nèi)，當(dāng)加至距離短玻璃板上緣約0.5cm時(shí)，停止加膠，輕輕將樣品槽模板（梳子）插入。在上、下貯槽中倒入蒸餾水，液面不能超過上貯槽的短玻璃板，防止蒸餾水進(jìn)入凝膠之中。作用是增加壓力，防止凝膠滲漏。凝膠液在混合后15min開始聚合，約30min-1h完成聚合作用。聚合后，在樣品槽模板梳齒下緣與凝膠界面間有折射率不同的透明帶。看到透明帶后繼續(xù)放置半小時(shí)，再用雙手取出樣品槽模板，動(dòng)作要輕，用力均勻，以防弄破加樣凹槽。凹槽中殘留液體可用窄濾紙條輕輕吸取，切勿插進(jìn)凝膠中，應(yīng)保持加樣槽凹面平整。放掉上、下貯槽中的蒸餾水，在上下兩個(gè)電極槽倒入電極緩沖液，液面應(yīng)沒過短玻璃板上方約0.5cm。 b) 不連續(xù)體系 不連續(xù)體系采用不同孔徑及pH的分離膠與濃縮膠，凝膠制備分兩步進(jìn)行。 i. 分離膠制備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，本實(shí)驗(yàn)需20mL pH8.9 7.0％PAA溶液，配置方法見凝膠配置表。其加膠方式不同于連續(xù)體系?；旌虾蟮哪z溶液，用細(xì)長頭的滴管加至長、短玻璃板的狹縫內(nèi)，加至距離樣品模板梳齒下端約1cm。用1mL注射器在凝膠表面輕輕加一層重蒸餾水,用于隔絕空氣,使膠面平整,為防止?jié)B漏,在上、下貯槽中加入略低于膠面的蒸餾水，上下槽兩側(cè)加入25oC～30oC溫水，有助于凝膠。約30min-60min凝膠完全聚合，可以看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線，用濾紙吸去多余的水，但不要碰破膠面。 ii. 濃縮膠的制備：濃縮膠為3.75％PAA，其配制方法見凝膠配置表。即（4）︰（5）︰（6）︰（7）=1︰3︰3︰1?；旌暇鶆蚝笥眉?xì)長頭的滴管將凝膠溶液加到長、短玻璃板的窄縫內(nèi)（即分離膠上方），距短玻璃板上端0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板。在上、下貯槽中加入蒸餾水，但是不能超過短玻璃板上緣。在距電極槽10cm處用日光燈或者太陽光照射，進(jìn)行光聚合，但是不要造成大的升溫。凝膠由淡黃透明變成乳白色，則表示聚合作用開始。繼續(xù)光照，使凝膠完全聚合，聚合完成后放置30-60min，輕輕取出樣品槽模板，用窄濾紙條吸去凹槽中多余的液體，加入電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約0.5cm，即可加樣。 注：本次試驗(yàn)采用不連續(xù)體系，以達(dá)到較好的分離效果 四、加樣 用微量注射器取5微升樣品，通過緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品，即可開始電泳。 五、電泳 將直流穩(wěn)壓電泳儀的正極與下槽相連，負(fù)極與上槽連接。接通冷卻水，打開電泳儀開關(guān)，開始時(shí)將電流調(diào)至10mA。待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，將電流調(diào)至20-30mA，當(dāng)藍(lán)色染料遷移至距離橡膠框下端1cm時(shí)，電泳完成。關(guān)閉冷卻水開關(guān)及電源。收集上、下貯槽電極緩沖液，取出硅膠框，用鋼鏟輕輕將一塊玻璃撬開移走，將凝膠板置于大培養(yǎng)皿中染色。 六、染色 本實(shí)驗(yàn)用0.05％考馬斯亮藍(lán)R250染色液，染色與固定同時(shí)進(jìn)行，染色時(shí)加熱，染色30min左右。 七、 脫色 用0.1mol/L的NaCl浸泡漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色褪去，但注意不要過久，能看清楚蛋白質(zhì)帶即可。 [注意事項(xiàng)] 1.器材不潔凈會(huì)影響凝膠聚合，所有器材均應(yīng)嚴(yán)格清洗。玻璃板應(yīng)浸泡在重鉻酸鉀洗液3-4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，用清水沖洗，再用紗布或海綿蘸洗滌液洗凈，最后用蒸餾水沖洗干凈，直接陰干或者用吹風(fēng)吹干。 2.用瓊脂封底和灌膠時(shí)不能出現(xiàn)氣泡，以免影響電泳時(shí)電流的通過。 3.取出樣品槽模板以及用濾紙吸取多余液體時(shí)應(yīng)注意不能弄破膠面，動(dòng)作要輕，用力要均勻。 4.電泳時(shí)正負(fù)極不能接錯(cuò)。 [思考題] 1. 為什么要在樣品中加入含少許溴酚藍(lán)的40％蔗糖溶液？蔗糖及溴酚藍(lán)的用途各是什么？ 2. 上、下電極緩沖液電泳后，能否混合存放？為什么？ 3. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程的體會(huì)，總結(jié)做好聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的關(guān)鍵步驟有哪些？ [評分標(biāo)準(zhǔn)] 1.按時(shí)上課：+5； 2.實(shí)驗(yàn)臺(tái)衛(wèi)生：+10； 3.實(shí)驗(yàn)操作：+25； 4.預(yù)習(xí)報(bào)告：+10； 5.實(shí)驗(yàn)報(bào)告：①實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、圖樣描述（+15）；②思考題的分析解答（+20）；③實(shí)驗(yàn)心得（+5）（自評、互評）；④實(shí)驗(yàn)日志（+10） 盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白(選學(xué)) 【目的和要求】 1.掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理。 2.學(xué)習(xí)盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)，包括制膠、灌膠、加樣、電泳、剝膠、染色及脫色等。 3.了解盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用，利用盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)和血清球蛋白-血清清蛋白-鐵氧還原蛋白的混合液。 【實(shí)驗(yàn)原理】 盤狀聚丙烯酰胺凝膠，是由丙烯酰胺單體和少量的交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺，在催化劑的作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。改變單體的濃度或單體與交聯(lián)劑的比例，可以得到不同孔徑的凝膠，將次凝膠灌裝于直立的玻璃管中，再加樣品，進(jìn)行電泳分離，稱為盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳。一般常采用7.5%的盤狀聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，2.4%的分離核酸。 盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳又常分為兩大類，第一類是連續(xù)的凝膠電泳，第二類是不連續(xù)的凝膠電泳 不連續(xù)的凝膠電泳亦可稱為盤狀電泳。在這種電泳過程中，除去一般的電荷效應(yīng)外，還有兩種物理效應(yīng)： （1）凝膠對樣品分子的篩選效應(yīng)：顆粒小，形狀為圓球形的樣品分子，移動(dòng)較快；顆粒大形狀不規(guī)則的樣品分子，通過凝膠孔洞時(shí)受到的阻力較大，移動(dòng)較慢。（2）不連續(xù)系統(tǒng)對樣品的濃縮效應(yīng)：高度的濃縮效應(yīng)，大大提高電泳分離的分辨率，特別適用于稀濃度的樣品的分離。 【實(shí)驗(yàn)試劑與儀器】 試劑：新鮮不溶血的動(dòng)物細(xì)胞，凝膠緩沖液（pH=8.9），分離膠緩沖液（28%Acr-0.735%Bis），濃縮膠緩沖液（pH=6.7），濃縮膠貯液，過硫酸銨溶液（當(dāng)天用當(dāng)天配置），核黃素銨溶液，40%蔗糖溶液，Tris-甘氨酸電極緩沖液（pH=8.3），0.1%溴酚藍(lán)指示劑，染色液，脫色液。 儀器：常壓電泳儀；圓盤電泳槽；玻璃管（內(nèi)徑約0.5cm～0.7cm，長度約8 cm～10cm）；有機(jī)玻璃架（或自制木頭架）；微量進(jìn)樣（100μl）器；5ml注射器；長、短注射針頭；長、短頸滴管；日光燈或100w白熾燈；乳膠管；玻璃球（或小段玻璃棒）；培養(yǎng)皿；燒杯；洗耳球。 【實(shí)驗(yàn)步驟】 1. 安裝圓形玻管 2. 取玻璃管洗凈烘干后將其下端口用parafilm三層或橡膠玻璃頭封嚴(yán)，然后垂直安裝在試管架上備用，或直接插于電泳槽內(nèi)。配膠 分離膠的配置比例為pH8.9的分離膠緩沖液2.50ml，28%凝膠貯液5.00ml，重蒸餾水2.50ml，0.14%AP10ml。加AP前需要充分混勻，放置與真空干燥器中抽氣10min。分離膠的終濃度為7%，終體積為8ml。 濃縮膠的配法：取濃縮膠緩沖液（pH6.7）1ml，濃縮膠貯液2ml，40%的蔗糖4ml，0.004%核黃素銨溶液1ml，加核黃素溶液前需要充分混勻，放置與真空干燥器中抽氣10min。所配濃縮膠濃度為2.5%，終體積為8ml。 3. 灌膠 不連續(xù)體系凝膠的灌注分兩步。分離膠的制備：混合好的凝膠溶液用細(xì)長頭滴管加至準(zhǔn)備好的玻璃管內(nèi)，加膠高度距上端口2cm左右，用1ml注射器在凝膠表面輕輕加一層重蒸餾水（沿管壁），約3~5mm，用于隔絕空氣，使膠面平整。30~60min后凝膠完全聚合，此時(shí)可見水與凝膠面有折射率不同的界線出現(xiàn)。用濾紙條吸去多余水分，勿碰膠面。 濃縮膠的制備：混合好的凝膠溶液用細(xì)長頭的滴管加到分離膠的上面，使其液面距上端約0.5cm，然后置于日光燈（約10cm遠(yuǎn)）或陽光下照射進(jìn)行光聚合。注意溫度不能太高，凝膠由淡黃色變?yōu)槿榘咨砻骶酆献饔瞄_始，繼續(xù)光照半小時(shí)，聚合即可完成。然后繼續(xù)放置30~60min，用濾紙條吸去多余水分。 4. 加樣，電泳 將制備好的凝膠玻璃管插入圓盤電泳槽上，加少量電極緩沖液檢查一下是否有滲漏現(xiàn)象，若有解決之。然后在上下極槽內(nèi)加入適量的電極緩沖液，使上下極電路暢通，然后加血清蛋白樣液5~10ul，加樣時(shí)用微量注射器將樣液通過緩沖液小心的加在凝膠表面，將所有玻璃管內(nèi)均加完樣品后即可開始電泳。按照上槽接負(fù)極，下槽接正極的方式接在直流穩(wěn)壓電泳儀上，開始電泳，電流約1mA/管，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，將電流調(diào)到3mA/管。當(dāng)染料移至距下端1cm時(shí)，將電流調(diào)回至零，關(guān)電源。分別收集上下極槽電泳緩沖液，4 保存，還可再用。 5. 固定染色 取出玻璃管，用注射器吸滿自來水后將長針頭插到凝膠與管壁之間，推動(dòng)注射器，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)玻璃管，使針頭在管壁與膠之間前進(jìn)，膠條在水的壓力及滑潤作用下自玻璃管中脫出。然后將干凈的膠條浸泡在染色液中，染色10min，同時(shí)也進(jìn)行了固定。 6．脫色 用水沖去膠條表面染料，置于脫色劑中浸泡漂洗，更換漂洗液數(shù)次，直到背景色脫去。 【主意事項(xiàng)】 1、貯液放冰箱中一般可保持1～2個(gè)月，但3號(hào)貯液只能保存一周。如有不溶物可過濾。 2、Acr和Bis對神經(jīng)系統(tǒng)有毒害，使用時(shí)要小心，注意勿與皮膚接觸。但聚合后的凝膠對人體無害。 3、電泳時(shí)的電流最好不超過5mA/管，以免產(chǎn)生過多熱量。室溫高時(shí)應(yīng)進(jìn)行冷卻或冷庫內(nèi)進(jìn)行電泳。 4、本實(shí)驗(yàn)需時(shí)間較長。在一次實(shí)驗(yàn)中可安排到脫色一步，再于下一次實(shí)驗(yàn)中觀察脫色后的膠條并繪圖。 5、在堿性條件下，凝膠易聚合，其聚合速度與Ap濃度平方根成正比，一般在室溫下，pH8.8時(shí)，7.5%丙烯酰胺溶液30min完成聚合作用，在pH4.3時(shí)聚合速度很低，約需90min才能聚合，此外應(yīng)選擇高純度的Acr和Bis。雜質(zhì)。某些金屬離子、低溫和氧分子能延長或阻止碳鏈的延長與聚合作用。 【思考問題】 1. 影響聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素有哪些？ 2. 聚丙烯酰胺凝膠不聚合的主要原因是什么？如何克服？ 3. 為什么要在樣品中加少許溴酚藍(lán)和一定濃度的甘油 ？