《生物選修一(考點(diǎn)).doc》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《生物選修一(考點(diǎn)).doc（15頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

選修1—1：《酶的應(yīng)用》 一、酶在洗滌等方面的應(yīng)用 【選學(xué)（了解）】——果膠酶及其應(yīng)用： 1. 果膠酶：→是指一類酶的總稱。包括：半乳糖醛酸酶、果膠分解酶和果膠酯酶。 2. 果膠酶的來(lái)源：→來(lái)自霉菌等微生物。常采用霉菌等微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)果膠酶。 ★提取果膠酶的條件：→低溫（0～4℃）、偏酸環(huán)境（pH：3～4）、激活劑（10%NaCL）。 3. 果膠酶的作用：→能分解植物細(xì)胞壁及胞間層的果膠。 4. 果膠酶的應(yīng)用：→常用于提高果汁的出汁率和澄清度。 5. 探究果膠酶作用的最適條件（最適溫度和pH）和用量的實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)： ◆遵循單一變量原則和對(duì)照實(shí)驗(yàn)原則。◆以果汁出汁量或澄清度作為判斷酶活性的指標(biāo)。 （一）酶在洗滌方面的應(yīng)用【A】 1. 普通洗衣粉的主要成分：→表面活性劑、軟水劑（三聚磷酸鈉）、堿劑、漂白劑、香精等。 ★表面活性劑：→是洗衣粉的核心成分，作用：→降低表面張力。 2. 加酶洗衣粉：→是指加入了蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶的洗衣粉。 （1）酶不能直接加入洗衣粉，所加的是用特殊化學(xué)物質(zhì)包裹成的復(fù)合酶制劑。 ①★加入洗衣粉的酶制劑不是固定化酶，其包裹材料能溶于水。 ②加入洗衣粉中的酶來(lái)源：→基因工程生產(chǎn)的酶。能耐酸、耐堿、耐較高溫度等。 （2）加酶洗衣粉降低了表面活性劑和三聚磷酸鈉的用量。 ★使用加酶洗衣粉不僅能增強(qiáng)了洗滌效果，還能減少對(duì)環(huán)境的污染（磷污染）。 （3）在洗滌劑中應(yīng)用最廣泛、效果最明顯的酶是：→ 堿性蛋白酶和堿性脂肪酶。 3. 酶制劑的洗滌原理： （1）堿性蛋白酶：→可將血漬、奶漬等中蛋白質(zhì)分解成可溶性氨基酸和易脫落小分子多肽。 （2）堿性脂肪酶：→可將油漬、汗?jié)n和口紅等中的脂肪水解成脂肪酸和甘油等。 （3）淀粉酶： →可將面、粥等中的淀粉水解為麥芽糖、葡萄糖等可溶性成分。 （4）纖維素酶：→本身不能去污垢，但能使纖維結(jié)構(gòu)變得蓬松，利于洗衣粉與纖維深處 污垢接觸，增強(qiáng)洗滌效果?！锢w維素酶能去除衣物浮毛，不會(huì)分解衣物纖維素。 4. 加酶洗衣粉使用注意事項(xiàng)： （1）不能用于洗滌：→毛織品和絲織品等蛋白質(zhì)類衣物 （2）不能用70℃及其以上水溫洗滌。（★適宜水溫：35～50℃；適宜pH：9～11）。 （3）不宜長(zhǎng)期存放（酶會(huì)失效）。◆加酶洗衣粉對(duì)人的皮膚有腐蝕性，應(yīng)注意防護(hù)。 （二）探究加酶洗衣粉洗滌效果實(shí)驗(yàn)【B】 1. 觀察指標(biāo)：→（各實(shí)驗(yàn)都是）污物消失時(shí)間（或污物縮小的面積）。 2. 各對(duì)照實(shí)驗(yàn)共有的無(wú)關(guān)變量： →水用量、洗衣粉用量、污物量、布的質(zhì)地大小、洗滌方式、浸泡和洗滌時(shí)間等。 3. 比較普通洗衣粉與加酶洗衣粉洗滌效果的實(shí)驗(yàn)： ★自變量：→洗衣粉種類。 無(wú)關(guān)變量：→除共有的外，還有水溫、pH、洗衣粉品牌。 4. 探究不同種類加酶洗衣粉洗滌效果的實(shí)驗(yàn)： ★自變量：→加酶洗衣粉種類。無(wú)關(guān)變量：→除共有的外，還有水溫、pH等。 5. 探究使用加酶洗衣粉的最適宜溫度實(shí)驗(yàn)：→各組溫度形成自身對(duì)照。 （1）自變量：→溫度。 無(wú)關(guān)變量：→除共有的外，還有pH等。 （2）應(yīng)在最適溫度左右等梯度設(shè)置多組溫度進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)?！餃囟忍荻仍叫≡綔?zhǔn)確。 6. 探究使用加酶洗衣粉的最適宜pH實(shí)驗(yàn)：→各組pH形成自身對(duì)照。 （1）自變量：→pH。 無(wú)關(guān)變量：→除共有的外，還有水溫等。 （2）應(yīng)在最適pH左右等梯度設(shè)置多組pH進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。★pH梯度越小越準(zhǔn)確。 二、制備和應(yīng)用固相酶： （一）固定化酶和固定化細(xì)胞技術(shù)及其應(yīng)用【A】： 1. 固定化酶：→是指用物理學(xué)或化學(xué)方法將酶與固相載體結(jié)合在一起形成的仍具有 酶活性的酶復(fù)合物。 ★固定化酶可以反復(fù)使用，原因是酶與水溶液反應(yīng)物和產(chǎn)物可以分離。 2. 制備固定化酶的主要方法：→包括：吸附法、交聯(lián)法、包埋法等。 交聯(lián)法 吸附法 包埋法 （1）吸附法：→利用離子鍵、物理吸附等 方法將酶分子吸附在固相載體的表面。 （2）交聯(lián)法：→利用（雙）多功能試劑進(jìn)行 酶與載體之間交聯(lián)，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 （3）包埋法：→將酶或細(xì)胞包埋在不溶于水的多孔載體中。 ◆常用固相載體：→海藻酸鈉、纖維素、瓊脂糖、明膠、聚丙烯酰胺、多孔玻璃等。 3.★制備固定化酶（細(xì)胞）的要求和方法選擇： （1）選擇的固定化方法及材料不能影響酶活性；要避免高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。 （2）制備固定化酶時(shí)：→常用吸附法和化學(xué)結(jié)合法，不用包埋法。 ★酶分子小，容易從包埋材料中漏出。 （3）制備固定化細(xì)胞時(shí)：→常用包埋法。 不用吸附法和化學(xué)結(jié)合法。 ★細(xì)胞個(gè)大，難以吸附或結(jié)合，不易從包埋材料中漏出。 4. 直接使用酶、固定化酶和固定化細(xì)胞的比較： 主要優(yōu)點(diǎn) 主要缺點(diǎn) 直接使用酶 催化效率高，耗能低、低污染。 不能反復(fù)使用，影響產(chǎn)品質(zhì)量。 固定化酶 ①能與產(chǎn)物分離，能反復(fù)使用。 ②★易與反應(yīng)物接觸。 不能催化系列反應(yīng)。 固定化細(xì)胞 ①能與產(chǎn)物分離，能反復(fù)使用。 ②★能催化系列反應(yīng)。 ③★酶活性高而穩(wěn)定、 ④★操作容易，成本更低 ◆酶不易與反應(yīng)物接觸，反應(yīng) 效率降低。 ◆只能用于生產(chǎn)胞外酶和分泌到細(xì)胞外的產(chǎn)物。 5. 固定化酶的應(yīng)用實(shí)例： （1）固定化葡萄糖異構(gòu)酶：→用于生產(chǎn)高果糖漿。見(jiàn)右圖： （2）固定化青霉素?；福骸糜谏a(chǎn)各種新型青霉素。 （3）尿糖試紙：→測(cè)試尿糖。（含量：淺藍(lán)→淺綠→棕色→淺棕色）。 ①尿糖試紙上含固定化葡萄糖酶和過(guò)氧化氫酶及無(wú)色化合物。 ②尿糖試紙不能反復(fù)使用，因?yàn)橛眠^(guò)的試紙上有顏色。 （4）固定化硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、一氧化氮還原酶：→進(jìn)行廢水處理。 （二）固定化酵母細(xì)胞的制備與應(yīng)用（實(shí)驗(yàn)）【B】 1. 制備固定化細(xì)胞常用凝膠包埋法。 ①★制備固定化酵母細(xì)胞常用海藻酸鈉凝膠包埋法。 ②★凝膠是多孔載體，調(diào)節(jié)凝膠溶液的濃度，可以改變凝膠的孔徑大小。 2. 制備固定化酵母細(xì)胞的方法步驟：→關(guān)鍵步驟：配制海藻酸鈉溶液。 （1）活化酵母細(xì)胞：→目的：→使酵母菌從休眠狀態(tài)恢復(fù)到正常生活狀態(tài)。 ①操作：→將1克干酵母和10ml蒸餾水放在50ml燒杯中混合并攪拌均勻，放置1小時(shí)。 ②注意事項(xiàng)：→容器要大一些，以防活化液溢出；混合后要進(jìn)行攪拌。 （2）配制0.05mol/L的CaCL2 溶液： ①操作：→將0.83克無(wú)水CaCL2和150mL蒸餾水，放在200ml燒杯中使其充分溶解。 ②★CaCL2溶液的作用：→（起凝膠聚沉作用）促使凝膠珠的形成。 （3）配制海藻酸鈉溶液（最關(guān)鍵）： ①操作：→將0.7g海藻酸鈉和10ml蒸餾水加入50ml小燒杯中，小火間斷加熱至 完全溶化，加蒸餾水定容至10ml。 ②注意事項(xiàng)：→★應(yīng)采用小火間斷加熱，以防焦糊；海藻酸鈉濃度不宜過(guò)高過(guò)低。 ③★海藻酸鈉溶液濃度過(guò)高時(shí)：→難以形成凝膠珠或凝膠珠形態(tài)異常。 ④★海藻酸鈉濃度過(guò)低時(shí)：→凝膠珠中包埋的細(xì)胞數(shù)量少，凝膠珠色淺呈白色。 （4）海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞混合： ★應(yīng)將海藻酸鈉溶液冷卻至室溫后，再加入已活化的酵母細(xì)胞；并充分?jǐn)嚢杈鶆颉? （5）固定化酵母細(xì)胞： ①操作：→用注射器吸取混合液，以恒定的速度緩慢地滴加到CaCL2溶液中，并不 斷攪拌（磁力攪拌器攪拌），將凝膠珠在CaCL2溶液中浸泡30分鐘。 ②注意事項(xiàng)：→注射器距液面距離不能太近、凝膠珠浸泡時(shí)間不能過(guò)短。 ③★注射器距液面距離過(guò)近時(shí)：→凝膠珠會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。 ④★凝膠珠浸泡時(shí)間過(guò)短時(shí)：→凝膠珠不能形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，容易裂開(kāi)。 （6）沖洗：→取出凝膠珠后，要用蒸餾水沖洗2～3次。 ★沖洗的目的：→洗去凝膠珠表面的氯化鈣溶液和雜菌。 （7）發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：→將10%的葡萄糖溶液150ml加入200ml的錐形瓶中，加入固定化酵母 細(xì)胞在25℃下發(fā)酵24h。觀察氣泡產(chǎn)生（CO2）和聞酒味，并用重鉻酸鉀檢測(cè)酒精。 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：——酵母細(xì)胞凝膠珠質(zhì)量檢測(cè)。 （1）合格凝膠珠的標(biāo)準(zhǔn)： ①乳白色，圓形或橢圓形。②摔打容易彈起。③擠壓不易破裂、無(wú)液體流出。 （2）凝膠珠異常的原因： ①色淺呈白色：→海藻酸鈉溶液濃度偏低，此種凝膠珠中包埋的酵母細(xì)胞數(shù)量少。 ②不呈圓形或橢圓形：→海藻酸鈉溶液濃度偏高。 ★此種凝膠珠為制作失敗，不能使用；需要重新制作。 ③拖尾現(xiàn)象：→混合液濃度低，或注射器距氯化鈣溶液液面距離太近。 ④凝膠珠漂浮：→混合溶液中含氣泡。 ⑤★凝膠珠容易裂開(kāi)：→凝膠珠在氯化鈣溶液中浸泡時(shí)間過(guò)短。 選修1—2：《生物技術(shù)在食品加工中的應(yīng)用》 一、發(fā)酵食品加工的基本方法【A】 （一）傳統(tǒng)發(fā)酵中所利用的微生物的比較： 酵母菌 醋酸菌 毛霉 乳酸菌 生物類型 真核生物 原核生物 真核生物 原核生物 代謝類型 異養(yǎng)兼性厭氧型 異養(yǎng)需氧型 異養(yǎng)需氧型 異養(yǎng)厭氧型 適宜生長(zhǎng)溫度 18℃～25℃ 30℃～35℃ 15℃～18℃ 室溫 主要用途 釀酒、發(fā)面 釀醋 制作腐乳 制酸奶、泡菜 （二）各類發(fā)酵食品的制作原理及方法： 1. 制作果酒原理：→以果汁為原料，利用酵母菌在無(wú)氧條件下（酒精發(fā)酵）產(chǎn)生酒精。 （1）自然發(fā)酵：→利用附著在葡萄皮上的野生型酵母菌進(jìn)行酒精發(fā)酵。 （2）工業(yè)生產(chǎn)上：→用人工培養(yǎng)的純種酵母菌進(jìn)行酒精發(fā)酵。 （3）紅葡萄酒是用帶皮葡萄釀制而成，白葡萄酒是用去皮葡萄釀制而成。 （4）果膠酶可用于酒的陳釀化；蛋白酶可使酒體清澈透明。 2. 制作果醋原理：→以果汁或果酒為原料，利用醋酸菌在有氧條件下產(chǎn)生醋酸。 3. 制作腐乳的原理： →利用毛霉等微生物分泌的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶將豆腐中的 蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉分解為多種氨基酸、有機(jī)酸等；使腐乳鮮香可口，易消化吸收。 （1）在腐乳制作中，多種微生物參與了豆腐的發(fā)酵，但起主要作用的是毛霉。 ①毛霉是絲狀真菌，其代謝類型屬于異養(yǎng)需氧型；適宜生長(zhǎng)溫度：15℃～18℃。 ②毛霉孢子分布廣泛，空氣中含有大量毛霉孢子。 （2）家庭和實(shí)驗(yàn)制作腐乳時(shí)，將豆腐坯暴露在空氣中接種毛霉孢子。 （3）工業(yè)生產(chǎn)腐乳時(shí)，在嚴(yán)格無(wú)菌條件下接種優(yōu)良毛霉菌種孢子?！锔槠焚|(zhì)好。 ①工業(yè)上生產(chǎn)腐乳步驟：→①接種孢子。→②培養(yǎng)和晾花?！蹓号髋c裝壇 ②“晾花”的目的：→增強(qiáng)酶的作用，散失霉味。 （4）醉方（添加黃酒制成）、紅方（添加紅曲制成）、青方（不加調(diào)料制成）。 4. 酸奶和泡菜制作原理：→利用乳酸菌在無(wú)氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。 （1）泡菜中亞硝酸鹽含量變化規(guī)律：→先增加再下降至原含量水平。 （2）泡菜制作要求：→①壓實(shí)和嚴(yán)格密封。②加鹽量不宜過(guò)多過(guò)少，控制在5%。 （3）食用時(shí)間：→腌制10～11天以后?！锸欠衲苁秤?，需要檢測(cè)亞硝酸鹽含量。 ①比色法檢測(cè)：→將樣品液顯色情況與亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)顯色液比較估測(cè)出其含量。 ②不同濃度的顯色液呈不同程度的玫瑰紅色。 二、果酒和果醋的制作【B】 （一）果酒制作：→果酒中酒精含量應(yīng)控制在10%～20%。 1. 果酒制作方法步驟（及注意事項(xiàng)）： （1）對(duì)發(fā)酵瓶、紗布、榨汁機(jī)等進(jìn)行清洗和消毒： ★發(fā)酵瓶要用溫水反復(fù)清洗后，再用75%酒精擦拭消毒，晾干。 （2）取葡萄500克，先沖洗干凈，再去除枝梗和腐爛籽粒，再次沖洗。 ①?zèng)_洗目的：→去除葡萄表面污物雜物?！锊荒芟热ブＴ?zèng)_洗。 ②不能反復(fù)沖洗，否則會(huì)沖洗掉附著在葡萄表面的野生型酵母菌。 （3）用榨汁機(jī)榨取葡萄汁，之后將葡萄汁裝入發(fā)酵瓶中，并蓋好瓶蓋： 【注意】→果汁不能裝滿（裝入量不超過(guò)發(fā)酵瓶總體積的2/3）。★目的是： ①讓酵母菌有氧呼吸大量繁殖，保證發(fā)酵時(shí)有較大起始數(shù)量。 ②防止發(fā)酵時(shí)發(fā)酵液溢出。 （4）將發(fā)酵瓶放置在18℃～25℃條件下發(fā)酵10～12天： （5）每天定期排氣1～2次（排CO2），以防瓶爆裂。 ①為了防止發(fā)酵瓶爆裂，最好選用塑料瓶。 ②排氣時(shí)要防止雜菌污染，常擰松瓶蓋排氣，不能打開(kāi)瓶蓋。 ③★右圖發(fā)酵裝置中排氣管設(shè)計(jì)成長(zhǎng)而彎曲狀，既能排氣，又能防止雜菌污染。 （6）取樣檢測(cè)酒精（10天后）：→用酸化重鉻酸鉀檢測(cè)；也可聞酒味、鏡檢酵母菌。 【檢測(cè)方法】→①取兩支試管編號(hào)1、2，分別裝入2mL酒精、2mL發(fā)酵液。 ②向兩試管中分別滴加3滴3mol/L的硫酸溶液，并振蕩混勻。 ③再向兩試管中各加入飽和重鉻酸鉀溶液3滴，振蕩后觀察溶液顏色變化。 2.★制作果酒和果醋中防止雜菌污染的措施： （1）對(duì)用具清洗并用酒精消毒。 （2）葡萄先清洗后除枝梗。 （3）排氣管設(shè)計(jì)為長(zhǎng)而彎曲狀。 （4）無(wú)菌操作。 （二）果醋制作： 1. 利用葡萄汁等果汁制作果醋： （1）要向果汁中接種醋酸菌，并置于30℃～35℃條件下進(jìn)行有氧發(fā)酵。 酶 （2）發(fā)酵時(shí)需要不斷通入無(wú)菌空氣，同時(shí)也需要定期排氣（排CO2）。 （3）反應(yīng)式：C6H12O6 ＋2O2 2 CH3 COOH ＋2CO2＋2 H2O＋能量 2. 利用果酒制作果醋的方法步驟： （1）將醋酸菌（醋曲或醋酸菌膜）接種到制作好的果酒中，并通入無(wú)菌空氣。 （2）將發(fā)酵裝置放在30℃～35℃環(huán)境中，不斷通入無(wú)菌空氣進(jìn)行有氧發(fā)酵7～8天。 （3）檢測(cè)果醋是否制作成功，并對(duì)發(fā)酵液（果醋）進(jìn)行過(guò)濾、滅菌： 【檢測(cè)方法】→①pH測(cè)定、②觀察醋酸菌膜形成、③聞酸味、品嘗、鏡檢等。 【提醒】→①變酸的果酒表面白色菌膜是由醋酸菌形成的。 酶 ②泡菜壇內(nèi)表面白色菌膜是由酵母菌形成的。 （4）果酒制果醋反應(yīng)式： C2H5OH ＋O2 CH3 COOH ＋ H2O ＋能量 （三）★果酒制作與果醋制作的比較： 果酒制作 果醋制作 發(fā)酵菌種 酵母菌 醋酸菌 最適發(fā)酵溫度 18℃～25℃ 30℃～35℃ 對(duì)氧氣需求 前期需氧，后期不需氧 一直需要氧 pH 4.0～5.8 5.4～6.3 發(fā)酵時(shí)間 10～12天 7～8天 方法與流程 挑選葡萄→沖洗→榨汁→酒精發(fā)酵（果酒）→醋酸發(fā)酵（果醋） 三、腐乳的制作【A】 1. 腐乳制作的基本流程：→見(jiàn)下圖： 讓豆腐上長(zhǎng)出毛霉 ◆直接接種或利用空氣中 毛霉孢子，15℃～18℃培養(yǎng)。 加鹽腌制 ◆逐層加鹽，隨層數(shù)增高而增加鹽量；近瓶口處鋪厚些。 加鹵湯裝瓶 ◆鹵湯由酒和 香辛料配成。 密封腌制 ◆用酒精燈對(duì)瓶口 滅菌后密封。 （1）讓豆腐上長(zhǎng)出毛霉： ①將豆腐切成小塊（4cm4cm1.5cm），用沸水消毒后微微晾干，制成腐乳坯。 在晾干過(guò)程中空氣中毛霉孢子落到腐乳坯上，完成接種過(guò)程。 ★所用豆腐含水量應(yīng)控制在70%左右，含水過(guò)多腐乳不成形。 ②將腐乳坯豎立放在清潔容器內(nèi)彼此間隔1cm，將溫度控制在15～18℃，并保持 一定濕度讓毛霉生長(zhǎng)；當(dāng)菌絲變成淡黃色，有大量灰褐色孢子形成時(shí)停止發(fā)酵。 ★若某些豆腐上長(zhǎng)出青霉，應(yīng)剔除這種豆腐或重新制作。 （2）加鹽腌制：→將長(zhǎng)滿毛霉的豆腐塊用食鹽水清洗后整齊地?cái)[放在瓶中，用食鹽腌制10天。 ①★加鹽方法：→逐層加鹽，加鹽量逐層遞增，接近瓶口的表面鹽要鋪厚一些。②鹽量：腐乳坯量= 5 ：1。★加鹽過(guò)多會(huì)影響繼續(xù)發(fā)酵，過(guò)少豆腐會(huì)腐敗變質(zhì)。 【加鹽目的】→①析出豆腐中水分，使豆腐變硬，防止過(guò)早酥爛。 ②抑制微生物生長(zhǎng)，防止豆腐腐敗變質(zhì)。 ③調(diào)節(jié)口味。 （3）配制鹵湯：→用食鹽、水和料酒及各種香辛料等進(jìn)行配制。 ①鹵湯中酒含量控制在12%左右。 ◆酒的作用：→抑制微生物的生長(zhǎng)，并使腐乳具有獨(dú)特酒香味。 ★酒用量過(guò)多會(huì)抑制蛋白酶活性和影響腐乳風(fēng)味；酒用量過(guò)少豆腐會(huì)腐敗。 ②香辛料的作用：→調(diào)味、防腐殺菌。 （4）加鹵湯裝瓶，密封腌制：→將配制好的鹵湯加入瓶中，將瓶口通過(guò)酒精燈火焰，再用膠帶密封瓶口，密封腌制6個(gè)月。 ★裝瓶時(shí)要迅速，瓶口要通過(guò)酒精燈的火焰，再密封。 2. 腐乳品質(zhì)鑒定及有關(guān)提醒： （1）評(píng)價(jià)腐乳品質(zhì)：→應(yīng)從形狀、色、香、味、質(zhì)地等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。 （2）影響腐乳品質(zhì)的因素：→鹽、酒、香辛料和發(fā)酵溫度。 ◆前期發(fā)酵溫度為：15℃～18℃；后期發(fā)酵溫度（腌制時(shí)）為常溫或30℃。 ★在腌制過(guò)程中，毛霉等微生物（酶的作用）仍可繼續(xù)發(fā)酵一段時(shí)間。 （3）腐乳外表的皮是附著在豆腐上的毛霉菌絲形成的，可使腐乳成形。 （4）用于腌制的玻璃瓶洗刷干凈后要用沸水消毒，裝瓶、密封等環(huán)節(jié)要無(wú)菌操作。 選修1—3：《微生物的利用》 一、微生物的分離和培養(yǎng)【A】 （一）微生物與培養(yǎng)基： 1. 微生物：→是指除動(dòng)物界和植物界以外的所有生物，包括病毒、原核生物、真菌和原生生物等 2.培養(yǎng)基：→是指為人工培養(yǎng)微生物而制備的，適合微生物生長(zhǎng)、繁殖或積累代謝產(chǎn)物 的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。 3.培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分：→一般都含有水、碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽等，有的還含生長(zhǎng)因子。 （1）碳源：→如：無(wú)機(jī)碳（含碳無(wú)機(jī)物）、有機(jī)碳（糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等）。 ①無(wú)機(jī)碳：→能為自養(yǎng)微生物提供碳素營(yíng)養(yǎng)?！餆o(wú)機(jī)碳是自養(yǎng)微生物的碳源。 ②有機(jī)碳：→能為異養(yǎng)微生物提供碳素營(yíng)養(yǎng)和能源。 （2）氮源：→如：無(wú)機(jī)氮（含氮無(wú)機(jī)物）、有機(jī)氮（蛋白胨、尿素、氨基酸等）。 ①為微生物提供氮素營(yíng)養(yǎng)。 ②★氮?dú)猓∟2）是固氮微生物的氮源， （3）水和無(wú)機(jī)鹽：→分別為微生物提供水、無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)。 （4）生長(zhǎng)因子：→如：維生素、必需氨基酸、堿基等，滿足異養(yǎng)微生物合成酶和核酸。 【提醒】→①含C、H、O、N的有機(jī)化合物既是碳源，又是氮源和能源。 ②蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、麥芽汁等既含碳源又含氮源、生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)。 4. 培養(yǎng)基的種類及其用途： （1）按物理狀態(tài)可將培養(yǎng)基分為：液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。 ①液體培養(yǎng)基：→未加凝固劑（瓊脂）?！糁饕糜诠I(yè)生產(chǎn)。 ②半固體培養(yǎng)基：→加入瓊脂0.2～0.5%。用于觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、分類和鑒定。 ③固體培養(yǎng)基：→加入瓊脂1.5～2%?！镉糜谖⑸锏姆蛛x、純化、計(jì)數(shù)和鑒定。 ★瓊脂是最常用凝固劑，熔點(diǎn)：96℃，凝固點(diǎn)：40℃，微生物一般不能利用瓊脂。 （2）按化學(xué)成分可將培養(yǎng)基分為：合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。 ①合成培養(yǎng)基：→化學(xué)成分明確。 ★用于微生物的分類和鑒定。 ②天然培養(yǎng)基：→化學(xué)成分不明確?！粲糜诠I(yè)生產(chǎn)。 （3）按用途（或功能）可將培養(yǎng)基分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。 制備方法 主要用途 實(shí)例 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 含微生物生長(zhǎng)所需要的基本物質(zhì) 選擇培養(yǎng)基 添加或缺少某種 化學(xué)物質(zhì) 從眾多微生物中 分離出 所需微生物 ◆加入青霉素分離酵母菌、霉菌等。 ★加高濃度食鹽分離金黃色葡萄球菌 ★無(wú)氮培養(yǎng)基分離固氮菌。 ★不含有機(jī)碳培養(yǎng)基分離自養(yǎng)微生物 鑒別培養(yǎng)基 加入某種指示劑或化學(xué)藥品 鑒別不同種類 的微生物 伊紅—美藍(lán)培養(yǎng)基可使大腸桿菌的菌落 呈深紫色，可以鑒別大腸桿菌。 5. 培養(yǎng)不同微生物所需要的溫度、pH和時(shí)間： 細(xì)菌 放線菌 霉菌 培養(yǎng)溫度 30～37℃ 30～37℃ 25～28℃ 培養(yǎng)基pH 6.5～7.5 7.5～8.5 5.0～6.0 培養(yǎng)天數(shù) 1～2d 5～7d 3～4d （二）微生物培養(yǎng)中的無(wú)菌操作技術(shù)： 1.無(wú)菌操作：→是指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。 ★獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵：→防止外來(lái)雜菌入侵（污染）。 2.消毒與滅菌的區(qū)別： 條件 效果與目的 常用方法 消毒 較溫和的物理 或理化方法 殺死物體上大部分有害微生物 部分滅菌，不包括殺滅芽孢和孢子。 煮沸消毒法、巴氏消毒法、 紫外線或化學(xué)藥劑消毒法等 滅菌 強(qiáng)烈的 理化因素 殺死物體內(nèi)外所有微生物， 包括芽孢和孢子 灼燒滅菌、干熱滅菌、 高壓蒸汽滅菌。 3.常用消毒方法： （1）煮沸消毒法：→100℃煮沸5～6min。◆常用于罐裝食品、日常食品的消毒。 （2）巴氏消毒法：→70～75℃下煮30min或80℃下煮15min?！粲糜谂Ｄ?、果汁消毒。 （3）化學(xué)藥劑消毒法：→①70～75%酒精、碘酒、新潔爾滅等可用于皮膚、傷口等處消毒。 ②氯氣用于水源消毒。 （4）紫外線消毒：→30W紫外線燈照射30min?！镉糜趯?duì)接種室的空氣進(jìn)行消毒。 4.常用滅菌方法及其應(yīng)用： 主要方法（及器械） ★適用范圍 灼燒滅菌 用酒精燈火焰（外焰）灼燒 接種環(huán)、接種針、試管口、三角瓶口。 干熱滅菌 置于干熱滅菌箱中， 160～170℃加熱1～2h。 ①培養(yǎng)皿、試管等玻璃器皿， ②不適合其他方法滅菌的金屬用具等 高壓蒸氣滅菌 （濕熱滅菌） 置于高壓滅菌鍋中 100 kPa、121℃、15～30 min 培養(yǎng)基、無(wú)菌水及多種器材、物品。 5.無(wú)菌技術(shù)具體做法： （1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清洗和消毒。 （2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。 （3）為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近（旁）進(jìn)行。 （4）實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。 6.（高壓滅菌鍋）高壓蒸汽滅菌的操作方法： （1）加水： →裝水量要沒(méi)入電熱管， 以防干燒爆裂，加水后 放入滅菌桶。 （2）裝鍋：→將所要滅菌的材料裝入鍋內(nèi)。 （不要裝得太滿）， （3）密封：→蓋上鍋蓋，兩兩對(duì)稱地?cái)Q緊螺栓。 （4）加熱排氣：→打開(kāi)排氣閥，接通電源加熱； 約2分鐘后有氣體排出，排氣約 5分鐘后關(guān)閉排氣閥。 【注意】→★一定要將冷空氣排盡，否則達(dá)不到滅菌效果。 （5）保溫保壓：→當(dāng)壓力上升至100kPa（0.1MPa）或溫度達(dá)121℃時(shí),維持20～30 分鐘；然后關(guān)掉電源。 （6）出鍋：→待壓力表指針回到零，溫度下降至60℃以下，打開(kāi)排氣閥，開(kāi)蓋取出 鍋內(nèi)物品。 ★一定要等到壓力表指針回到零時(shí)，才能排氣開(kāi)蓋。否則壓力過(guò)大會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基 等內(nèi)容物沖出，造成污染。 ★滅菌完成后要將鍋內(nèi)余水倒出，保持內(nèi)壁內(nèi)膽干燥。 （三）培養(yǎng)基的配制、滅菌和倒平板。 1. 培養(yǎng)基的配制原則：→①目標(biāo)要明確。②營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)。③pH要適宜。 2. 細(xì)菌培養(yǎng)基的配制：——牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制過(guò)程： 1000mL牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方 成分 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 瓊脂 含量 5.0g 10.0g 5.0g 20.0g 將上述物質(zhì)溶解后，添加蒸餾水定容至1000mL （1）計(jì)算和稱量：→根據(jù)表中配方計(jì)算培養(yǎng)基各成分用量，并逐一稱取。 【注意】→①牛肉膏和蛋白胨容易吸潮，稱取時(shí)動(dòng)作要迅速。 ②牛肉膏粘稠度較大稱取時(shí)要細(xì)心。 （2）溶化：→將稱取的各成分與水混合后進(jìn)行加熱溶化。 ①★應(yīng)將稱量好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯；待溶化干凈后取出。 ②★在加熱溶化過(guò)程中要用玻璃棒不斷攪拌，以防止糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。 （3）調(diào)節(jié)pH：→用pH試紙測(cè)pH，通過(guò)滴加3%HCI或NaOH將pH調(diào)到7.0～7.5。 （4）分裝：→將培養(yǎng)基分裝到試管或三角燒瓶中，分裝好后用棉塞塞緊管口或瓶口。 ①培養(yǎng)基分裝量：→試管：為其高度的1/5。三角燒瓶：不超過(guò)瓶容積的1/2。 ②分裝時(shí)培養(yǎng)基不能污染試管口或瓶口?！飳?duì)試管或三角燒瓶要標(biāo)記和編號(hào)。 （5）包扎：→①試管：3～5支扎成一捆，外包一層牛皮紙（防污染），用線扎好。 ②三角燒瓶：用牛皮紙包扎好，以防水蒸汽污染。 （6）滅菌：→將包扎好的試管或三角燒瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。 ★培養(yǎng)皿用舊報(bào)紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，160～170℃下滅菌1～2h后備用。 （7）倒平板：→待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右（剛剛不燙手）在酒精燈火焰附近倒平板。 ①將滅菌過(guò)的培養(yǎng)皿放在酒精燈火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶， 左手撥出棉塞。 ②右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過(guò)火焰2-3次，以防瓶口附近微生物污染培養(yǎng)基。 ③用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開(kāi)一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的 培養(yǎng)基約10～20mL倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。 ④等待平板冷卻凝固，約需要5～10 min；然后將平板倒過(guò)來(lái)放置。 ★平板冷凝后要倒置的原因：→防止皿蓋上冷凝水落入培養(yǎng)基，造成污染。 ★倒平板操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行，以防雜菌污染。 ★倒平板時(shí)，培養(yǎng)基不能濺在皿蓋與皿底之間的部位，也不能濺在皿蓋與皿壁上。 ★若是裝入試管的培養(yǎng)基，滅菌后要擱置斜面，斜面長(zhǎng)度不超試管長(zhǎng)度的1/2。 （8）無(wú)菌檢查：→檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底，方法是：→將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃ 的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h，觀察有無(wú)菌落形成。 （四）微生物接種技術(shù)： 1.接種器具：→包括：接種環(huán)（劃線接種）、接種針（穿刺接種）、玻璃刮鏟（涂布用）。 2.接種方法：→包括：平板劃線法、涂布平板法、穿刺接種法、斜面接種法等。 ★微生物分離純化的最常用接種方法：→平板劃線法和稀釋涂布平板法。 3. 平板劃線法：→◆特點(diǎn)：→操作簡(jiǎn)單，但單菌落不易分離。 （1）原理：→通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作,將聚集的菌種逐步 稀釋分散到培養(yǎng)基的表面?！镌跀?shù)次劃線后, 可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁 殖而來(lái)的肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體,這就是菌落. （2）操作方法： ①將接種環(huán)放在火焰上灼燒，至接種環(huán)燒紅；在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開(kāi)棉塞。 ②將試管口通過(guò)火焰數(shù)次，將已經(jīng)冷卻的接種環(huán)伸入菌液，沾取一環(huán)菌液。 ③將試管口通過(guò)火焰數(shù)次，并塞上棉塞。 ④左手將培養(yǎng)皿蓋打開(kāi)一條縫隙，右手將接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃3～5條 平行線，蓋上培養(yǎng)皿蓋。【注意】→★不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。 ⑤燒灼接種環(huán)，待接種環(huán)冷卻后；從第一區(qū)域劃線的末端開(kāi)始往第二區(qū)域劃線。⑥重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線?！镒詈髤^(qū)域不能與第一區(qū)域相連。 ⑦將平板倒置，放入恒溫箱中培養(yǎng)。 （3）【提醒注意】 ①接種全過(guò)程都需要在酒精燈火焰旁進(jìn)行，每次劃線前后都要灼燒接種環(huán)。 ★第一次劃線前灼燒接種環(huán)的目的：→燒掉接種環(huán)上被污染的雜菌。 ★第二次及其之后劃線前后灼燒接種環(huán)的目的：→燒掉接種環(huán)上殘留的菌種。 ②每次劃線接種時(shí)都需要將灼燒的接種環(huán)冷卻后才能劃線，以防燙死菌種。 ③接種劃線時(shí)不能劃破培養(yǎng)基，最后區(qū)域所劃線不能與第一區(qū)域的相連 4. 稀釋涂布平板法：→◆特點(diǎn)：操作復(fù)雜，但單菌落容易分離。 （1）原理：→將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋（常為10倍梯度），然后將不同稀釋度 的菌液分別涂布到瓊脂平板表面，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，在稀釋度足夠高的菌液里， 聚集在一起的微生物將分散成單個(gè)細(xì)胞，在培養(yǎng)皿表面形成單個(gè)菌落。 （2）操作方法： ①取合適稀釋度的少量菌液（0.5mL）在酒精燈火焰附近滴加到平板表面。 ②從酒精溶液中取出涂布器，把涂布器上粘附的酒精在酒精火焰上燃盡滅菌。 ③在酒精燈火焰附近，用冷卻后的涂布器（即玻璃刮鏟）把菌液涂布均勻。 ④把用涂布接種的培養(yǎng)皿放在恒溫箱中（37℃恒溫）培養(yǎng)1～2天取出。 ★稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)目比活菌的實(shí)際數(shù)目少。 原因：→當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是1個(gè)菌落。 （五）菌種保藏方法： 1. 臨時(shí)保藏：→接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4℃冰箱保存。 2. 長(zhǎng)期保存：→甘油冷凍管藏法（即：甘油管藏法。－20℃保存）。 二、微生物的分離和培養(yǎng)（實(shí)踐）【B】 （一）分離純化大腸桿菌： 1. 配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：→包括：計(jì)算→稱量→溶化（含調(diào)pH）→滅菌→倒平板。 2. 分離純化大腸桿菌的接種方法：→劃線平板法和稀釋涂布平板法。 3. 接種后的培養(yǎng)基的培養(yǎng)：→置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)1～2d。 4. 挑取大腸桿菌菌落多次進(jìn)行接種培養(yǎng)可以純化大腸桿菌菌種。 5. 菌種保存方法：→臨時(shí)保藏（4℃保存）和長(zhǎng)期保存（甘油管藏：－20℃保存）. （二）土壤中分解尿素的微生物的分離與計(jì)數(shù)： 1.篩選原理及方法： （1）原理：→尿素分解菌能合成脲酶，能利用脲酶分解尿素，因此可以尿素為氮源。（2）篩選方法：→用以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)土壤微生物進(jìn)行篩選。 2. 實(shí)驗(yàn)方法步驟：→本實(shí)驗(yàn)采用稀釋涂布平板法和活菌計(jì)數(shù)法。 （1）土壤取樣：→從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。 【注意】→取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的信封在使用前都要滅菌。 （2）制備培養(yǎng)基：→按下列配方制備以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基。 KH2PO4 Na2HPO4 MgSO47H2O 葡萄糖 尿素 瓊脂 pH調(diào)至7.0～7.2， 加蒸餾水定容至1000ml 1.4g 2.1g 0.2g 10.0g 1.0g 15.0g ★需要設(shè)置無(wú)尿素培養(yǎng)基作空白對(duì)照，即：表中尿素用等量的無(wú)菌水替換。 （3）土壤樣品稀釋：→制備不同稀釋度的土壤懸液。方法如下： ①稱取0.5g土壤，倒入盛有50mL無(wú)菌水的錐形瓶，振蕩20min，充分打散土壤， 制成10－2g/mL的土壤懸液。 ②用無(wú)菌移液管吸取0.5mL（10－2g/mL）的土壤懸液注入盛有4.5mL無(wú)菌水的 1號(hào)試管，配制成10－3g/mL的土壤懸液。 ③取另一支無(wú)菌移液管吹吸1號(hào)管3次，使懸液均勻，再吸取0.5mL注入盛有 4.5mL無(wú)菌水的2號(hào)試管，配制成10－4g/mL的土壤懸液.。依此類推，配制 10－5、10－6、10－7、10－8g/mL的等濃度的土壤懸液。 ★每次吸取土壤懸液前都要用移液管吹吸懸液3次的目的：→使土壤懸液均勻。 ④分離不同的微生物采用不同稀釋度（因不同微生物在土壤中含量不同）。見(jiàn)下表： 細(xì)菌 放線菌 霉菌 稀釋度 104、105、106 103、104、105 102、103、104 目的 保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計(jì)數(shù)的平板 【提醒】→人教版是配制10mL不同濃度的土壤懸液，其方法與上述方法相同。 （4）接種：→采用（稀釋）涂布平板法?！艟唧w操作如下： →從最低濃度（10－8g/mL）土壤溶液開(kāi)始，分別用無(wú)菌移液管吸取1mL（人教版 為0.1mL）加入到相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度設(shè)置至少3個(gè)重復(fù)（三個(gè)平板），再用涂布器（玻璃刮鏟）涂布均勻。 ①每次吸取土壤懸液前都要將土壤懸液充分振蕩，混合均勻；每一步都應(yīng)做到 無(wú)菌操作。★操作時(shí)，移液管和試管口應(yīng)在離火焰1～2cm處。 ②實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。 （5）培養(yǎng)與觀察：→將已標(biāo)明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期和樣品稀釋度的培養(yǎng)皿，倒置放在37℃的恒溫箱培養(yǎng)1～2d，觀察細(xì)菌菌落。 （6）計(jì)數(shù)菌落：→每隔24h統(tǒng)計(jì)菌落一次，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的數(shù)據(jù)作結(jié)果，以防 止培養(yǎng)時(shí)間不足而遺漏某些菌落。 ①★計(jì)算時(shí)應(yīng)選擇菌落數(shù)為30～300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)，要計(jì)算平均數(shù)。 ②★每克樣品菌落數(shù)（用液1mL）＝某一稀釋度重復(fù)培養(yǎng)菌落平均數(shù)稀釋倍數(shù)。 ③★統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)比活菌的實(shí)際數(shù)目少。 原因是：→當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是1個(gè)菌落。 4. 結(jié)果分析與評(píng)價(jià)：→ ★同一土樣的重復(fù)組統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)相近。 （1）若未接種的培養(yǎng)基中沒(méi)有菌落，說(shuō)明培養(yǎng)基未被雜菌污染，反之，則被污染。 （2）若空白對(duì)照組培養(yǎng)基上有菌落生長(zhǎng)，原因可能是被固氮微生物污染或培養(yǎng)基中混入了其他氮源。 （3）若實(shí)驗(yàn)中得到2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)在30～300的平板，表明稀釋操作成功，可以進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。 （4）若同一稀釋度的3個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差懸殊，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。 【知識(shí)拓展】 1．土壤中微生物數(shù)目的統(tǒng)計(jì)方法：→包括：直接計(jì)數(shù)法和間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）。 （1）直接計(jì)數(shù)法：→用血球計(jì)數(shù)板制片后在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。 ①取樣計(jì)數(shù)方法與培養(yǎng)液中酵母菌計(jì)數(shù)方法類似。 ②土壤微生物的稀釋要求：→以達(dá)到每小格內(nèi)有5～10個(gè)菌體為宜。 ③經(jīng)稀釋的土壤樣品應(yīng)重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取其平均值。 ④★1mL土壤懸液中菌體總數(shù) = 4106每小格中的菌體數(shù)土壤懸液稀釋倍數(shù)。 （2）間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）→采用稀釋涂布平板法，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。 ①要設(shè)置對(duì)照和重復(fù)，每個(gè)稀釋度土壤懸液至少設(shè)置3個(gè)重復(fù)。 ②選擇菌落數(shù)為30～300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算平均數(shù)。 ③每克土壤樣品中菌落數(shù)＝菌落數(shù) 稀釋倍數(shù) 涂布體積。 2. 鑒定能分解尿素的微生物的方法：→脲酶檢測(cè)法。 （1）原理：→尿素經(jīng)脲酶分解后形成氨，使pH升高，會(huì)使酚紅指示劑變紅。 （2）方法：→在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅，若酚紅指示劑變紅，則 說(shuō)明該微生物能分解尿素。 （三）分離土壤中能分解纖維素的微生物： 1.基礎(chǔ)知識(shí)和原理： （1）能分解纖維素的微生物都能分泌纖維素酶，該類微生物能以纖維素為唯一碳源。 （2）纖維素酶：→是一種復(fù)合酶，包括：C1酶（外切酶）、CX酶（內(nèi)切酶）和葡萄糖苷酶。 纖維素 纖維二糖 葡萄糖 C1酶、CX酶 葡萄糖苷酶 （3）剛果紅：→能與纖維素形成紅色復(fù)合物，不能與纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。 ★在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí)，能分解纖維素的微生物形成的菌落 周圍由于纖維素被分解，因此不呈紅色，而是形成透明圈。 2.操作步驟： （1）土壤取樣：→應(yīng)從富含纖維素的環(huán)境中進(jìn)行土壤取樣。如：樹(shù)林中多年落葉形成 的腐殖土等?！粽也坏胶线m的環(huán)境，可將濾紙埋在土壤中（深10cm）再取樣。 （2）選擇培養(yǎng)：→★目的：→增加纖維素分解菌的濃度（即：濃縮所需要微生物）。 ①按下表配方制備液體選擇培養(yǎng)基： 纖維素粉 5g Na2HPO47H2O 1.2g 溶解后加蒸餾水定容至1000mL NaNO3 1g KH2PO4 0.9g KCL 0.5g 酵母膏 0.5g MgSO47H2O 0.5g 水解酪素 0.5g 【提醒】→該培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，屬于選擇培養(yǎng)基。 ★原因是：→該培養(yǎng)基中 雖然含有其他碳源（酵母膏），但含量很少，培養(yǎng)基中的主要碳源還是 纖維素；在此種培養(yǎng)基中只有能分解纖維素的微生物才能大量繁殖。 ★水解酪素：→提供氮源和生長(zhǎng)因子。 ②設(shè)計(jì)對(duì)照組培養(yǎng)基時(shí)，用葡萄糖代替該配方中纖維素粉。 【操作】→稱取20g土樣加入裝有30mL選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下（30℃），振蕩培養(yǎng)1～2天，直至培養(yǎng)液變渾濁。 （3）梯度稀釋：→將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等梯度稀釋101～107倍。 （4）將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上： ①制備鑒別培養(yǎng)基：→按下表配方制備鑒別培養(yǎng)基。 CMC—Na （水溶性羧甲基纖維素鈉） 酵母膏 KH2PO4 土豆汁 瓊脂 溶解后加蒸餾水 定容至1000ml 5～10g 1g 0.25g 100mL 15g ②涂布平板：→將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上， 30℃倒置培養(yǎng)。 （5）剛果紅染色法：→★目的：→挑選產(chǎn)生透明圈的菌落（篩選出纖維素分解菌）。 ①方法一：→先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。 ②方法二：→在倒平板時(shí)就加入剛果紅。 ★方法一中要使用NaCl溶液，其作用是：→漂洗作用。 即：洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，使透明圈更清晰。 ★透明圈越大的菌落，產(chǎn)纖維素酶能力越強(qiáng)，分解纖維素的能力越強(qiáng)。 ③兩種染色鑒定方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較： 染色法 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 方法一 顏色反應(yīng)基本上是 纖維素分解菌的作用 操作繁瑣，剛果紅會(huì)使菌落之間發(fā)生混雜。 方法二 操作簡(jiǎn)便， 不存在菌落混雜問(wèn)題 ◆產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈 ◆有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。 （6）純化培養(yǎng)： →在產(chǎn)生明顯透明圈的菌落中，挑取并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在30℃～37℃培養(yǎng)，可獲得純化培養(yǎng)。 3. 確定纖維素分解菌：→進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶實(shí)驗(yàn)： （1）纖維素酶的發(fā)酵方法：→包括：液體發(fā)酵和固體發(fā)酵。 （2）纖維素酶測(cè)定方法：→對(duì)纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的葡萄糖含量測(cè)定。