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變性梯度凝膠電泳 從實驗到分析 2011年9月X日 變性梯度凝膠電泳 denaturedgradientgelelectrophoresis DGGE 最初是Lerman等人于20世紀80年代初期發(fā)明的 起初主要用來檢測DNA片段中的點突變 Muyzer等人在1993年首次將其應用于微生物群落結構研究 后來又發(fā)展出其衍生技術 溫度梯度凝膠電泳 temperaturegradientgelelectrophoresis TGGE 此后十年間 該技術被廣泛用于微生物分子生態(tài)學研究的各個領域 目前已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結構的主要分子生物學方法之一 變性梯度凝膠電泳 DGGE 變性梯度凝膠電泳 DGGE 一種分離相似大小DNA片段的電泳方法 即雙鏈DNA在變性劑 如尿素或甲酰胺 濃度或溫度梯度增高的凝膠中電泳 隨變性劑濃度升高 由于Tm值不同 DNA的某些區(qū)域解鏈 降低其電泳泳動性 導致遷移率下降 從而達到分離不同片段的目的 由于各類微生物 如細菌和古細菌 的16sRNA基因序列中可變區(qū)的堿基順序有很大的差異 其中不同土壤微生物的16sRNA基因的V3區(qū)擴增的DNA片斷在DGGE中的應用最為廣泛 根據(jù)電泳條帶的多寡和條帶的位置可以初步辨別出樣品中微生物的種類多少 粗略分析土壤樣品中微生物的多樣性 變性梯度凝膠電泳 DGGE 環(huán)境樣品基因組DNA的提取 目標片段的PCR擴增 DGGE圖譜的分析 圖像的采集和條帶的回收 DGGE分析 電泳前準備工作 電泳分析 剝膠 染色 DGGE條帶測序 DGGE分析微生物群落的主要步驟 總DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基礎 適合的DNA提取方法對環(huán)境樣品微生物群落結構分析非常重要 適合DNA提取方法的考量 DNA的得率 能否進行PCR擴增以及擴增的重復性 制備DNA花費時間的長短 關于DNA提取的建議 優(yōu)先考慮基于原位裂解的方法 根據(jù)實際情況采用酶解 酚氯仿抽提法 或者DNA提取試劑盒 建議購買Qiagen公司相關產(chǎn)品 環(huán)境樣品基因組DNA的提取 選擇適合的目標片段 設計合適的引物 注意有GC夾子情況下引物二聚體的行程 環(huán)境樣品目標片段的擴增最好采用TouchdownPCR 注意PCR的環(huán)境 V3區(qū)產(chǎn)物擴增極易污染 目標片段的PCR擴增 細節(jié)決定成敗 DGGE分析 從這一步開始 帶上手套 配置試劑時一定要用去離子水 可以配置不同梯度的變性溶液備用 注意變形溶液中大顆粒的過濾及脫氣 制膠洗膜時用的各個容器要用去離子水洗滌干凈 以防止氯離子污染 灌膠前準備好所有需要的東西 試劑 槍頭 甚至物品擺放的位置 制膠是實驗的關鍵 在往玻璃板中灌膠時要勻速地轉動滑輪 將凝膠液勻速地灌入玻璃板 灌膠后立刻清洗注射器 以防丙烯酰胺凝固 堵塞管子 DGGE前的準備工作 DGGE制膠主體部件 上樣的膠孔要用去離子水沖洗干凈并吸干 PAGE膠裝入電泳支架時注意用去離子水潤滑橡膠墊 裝入后在膠孔中加入緩沖液 上樣時上樣器要深入膠孔底部 盡量在同一個膠上比較所有樣品 每一個膠上要有markerlane 將膠放入電泳槽中時注意正負極 建議低電壓電泳一段時間 在樣品完全進入膠中之后再升電壓 電泳 停止電泳后注意把電泳儀調零之后在關閉電源剝膠需要細致 用好去離子水和保鮮膜 染色前做好膠樣品順序的標記 銀染 EB染色和SYBRGreen染色 剝膠與染色 垂直電泳 凝膠變性梯度的確定 關于PCR產(chǎn)物的純化和定量 關于DGGEmarker的制作 獲得高質量的DGGE圖譜 DGGE條帶的回收 注意紫外條件下操作的安全 盡量減少DNA在紫外下的照射時間 不同長度目標片段從切膠條帶中的回收 測序注意要點 回收條帶的DNA在PCR擴增后 一定要克隆 確認克隆與母條帶可以跑到同一個位置后 再送去測序 每個條帶至少測3個克隆 圖像的采集和條帶的回收 DGGE圖譜的聚類分析 相似性分析 DGGE圖譜的分析 DGGE圖譜的主成分分析 DGGE圖譜的數(shù)字化 Quantityone DGGE圖譜的數(shù)字化后的主成分分析 用QuantityOne Bio Rad USA 軟件對DGGE圖譜進行數(shù)字化處理 按照如下公式計算多樣性指數(shù) Shannon Wienerindex 其中 s代表每泳道中的條帶數(shù)量 Pi為泳道中第i條帶灰度 heightofthepeak 占該泳道總灰度的比例 菌群均勻度 evenness E E H H max H max lnS 多樣性指數(shù)的計算 Quantityone的應用問題和討論