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實(shí)驗(yàn)六PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測 常祖明 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理2 學(xué)會(huì)瓊脂糖凝膠的制作和進(jìn)行電泳的方法 實(shí)驗(yàn)原理 1 DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理 瓊脂糖是一種線性多糖聚合物 天然聚合長鏈狀分子 在沸水中溶解 45 開始形成多孔性剛性濾孔 凝膠孔徑的大小取決于瓊脂糖的濃度 濃度越高 孔隙越小 其分辨能力就越強(qiáng) DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng) 實(shí)驗(yàn)原理 1 電荷效應(yīng)DNA分子在PH值高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷 在電泳時(shí)向陽極移動(dòng) 2 分子篩效益在一定的電場強(qiáng)度下 DNA分子的遷移速度主要取決于分子篩效益 即DNA分子本身的大小和構(gòu)象 共價(jià)閉環(huán)DNA 線狀DNA 開環(huán)DNA 而且其遷移速度與其相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比 所以不用相對分子質(zhì)量的DNA分子可以在瓊脂糖凝膠電泳中分離 2 DNA分子進(jìn)行染色的原理 以溴化乙錠為例 觀察瓊脂糖凝膠中DNA最常用的方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色 溴化乙錠是一種高度靈敏的熒光染色劑 用于觀察瓊脂糖凝膠中的DNA分子 溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光 當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中從負(fù)極向正極泳動(dòng)時(shí) 溴化乙錠從正極向負(fù)極移動(dòng) 這樣溴化乙錠分子就會(huì)嵌入到DNA分子中的堿基對之間形成絡(luò)合物 這種絡(luò)合物在紫外光下發(fā)射的熒光要比單純的DNA分子要強(qiáng)的多 便于DNA的檢測 實(shí)驗(yàn)儀器 材料 試劑 實(shí)驗(yàn)儀器及用具電泳儀 移液槍 電磁爐 錐形瓶 容量瓶 紫外分析儀實(shí)驗(yàn)材料及試劑實(shí)驗(yàn)材料 雞血DNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNAMarker GoldView核酸染色劑 瓊脂糖 三羥甲基氨基甲烷 Tris 硼酸 乙二胺四乙酸二鈉 6 DNALodingBuffer實(shí)驗(yàn)試劑 0 5 TBE PH8 0 緩沖液 1 0 瓊脂糖溶液 實(shí)驗(yàn)步驟 瓊脂糖凝膠的配制 1g瓊脂糖 100mlTBE緩沖液 5 lGoldView 冷卻到60 1 將適量的DNAMarker用移液槍加入凝膠的第一個(gè)孔中 2 在PCR產(chǎn)物中加入6 DNALodingBuffer 每5ul產(chǎn)物加入1ul 混勻后 用移液槍加入到樣品孔內(nèi) 每孔加2ul 點(diǎn)樣 肉眼可見指示劑泳至距制膠板前端約2 3cm處即可停止電泳 切斷電源 取出凝膠 置于紫外線透射儀上觀察電泳結(jié)果 或用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照保存 電泳 觀察 注意事項(xiàng) 1 瓊脂糖融化時(shí) 檔位不宜太高 2 制膠和加樣過程中要防治氣泡的產(chǎn)生 3 操作過程必須戴手套操作 嚴(yán)格注意防護(hù) 4 加樣時(shí) Tip頭不宜插入樣品孔太深 也不要穿破膠孔壁 否則樣品滲漏或DNA帶型不整齊 5 電源接通時(shí) 應(yīng)核實(shí)凝膠的方向是否正確 6 電泳儀有電壓顯示 并不一定標(biāo)志電泳槽已接通 應(yīng)觀察電極氣泡出現(xiàn)情況 負(fù)極的氣泡比正極多一倍 表示電泳已開始 將兩者混勻后加入點(diǎn)樣孔 注意槍頭盡量往下 同時(shí)防止氣泡產(chǎn)生 討論 影響DNA遷移速率的因素有哪些