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DNA重組技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù),生物體外,基因,DNA分子水平,人類需要的新的生物類型或生物產(chǎn)品,基因重組,一、基因工程的概念,優(yōu)點(diǎn)：,克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙,定向改造生物的遺傳性狀,與雜交育種相比,與誘變育種相比,1,1．基因拼接的理論基礎(chǔ)（從結(jié)構(gòu)上分析，為什么不同生物的DNA能夠重組?） (1)DNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸。 (2)雙鏈DNA分子都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。,一、基因工程誕生的理論基礎(chǔ),2．外源基因在受體內(nèi)表達(dá)的理論基礎(chǔ) (1)基因是控制生物性狀的獨(dú)立遺傳單位。 (2)遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。 (3)生物界共用一套遺傳密碼。（遺傳密碼破譯）,2,識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。(6個(gè),4、5、8個(gè)),（2）作用：,（4）結(jié)果：,形成兩種末端,1、限制酶——“分子手術(shù)刀”（小結(jié)）,切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性核酸內(nèi)切酶。,磷酸二酯鍵,大本 考向?qū)?（2）書(shū)寫(xiě),3,限制酶存在于原核生物中的作用是什么?,思考,原核生物容易受到外源DNA的入侵 限制酶的作用:切割外源DNA,使之失效,限制酶為什么不會(huì)剪切原核生物本身的DNA?,思考,防御機(jī)制,1.原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列,2.識(shí)別序列被修飾，讓限制酶不能切割 如在甲基化酶 的作用下把甲基轉(zhuǎn)移到堿基上,,4,要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？,提問(wèn),要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。,如果把限制酶來(lái)切割的黏性末端能相連，那么這兩種酶必須滿足的條件是？,這兩種酶切割的片段會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端，,雙酶切指用兩種限制酶分別切割切割目的基因和載體，這樣做的優(yōu)點(diǎn)是？,防止目的基因和載體的自身環(huán)化，并防止目的基因的反向連接，從而確保目的基因定向插入到特定位置,5,2.“分子縫合針”————DNA連接酶,(2)分類 注意書(shū)寫(xiě),,E.Coli DNA連接酶,T4 DNA連接酶,想一想:DNA連接酶與DNA聚合酶功能的異同？,(1)來(lái)源： (2)作用：,(1)來(lái)源： (2)作用：,(1)作用：,恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。,大腸桿菌 “縫合”黏性末端,T4噬菌體 “縫合”黏性末端和平末端,6,DNA連接酶與DNA聚合酶功能的異同,,將單個(gè)核苷酸連接到 已有的核酸片段上。,形成磷酸二酯鍵,以一條DNA鏈為模板。,將兩個(gè)雙鏈DNA片段之間的切口連接起來(lái)。,不需要模板。,7,為什么要用載體？,3. “分子運(yùn)輸車(chē)” —基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體：,1、無(wú)法復(fù)制（原因） 2、無(wú)法表達(dá)（原因） 3、目的基因是否進(jìn)入到受體細(xì)胞需要借助于載體上的標(biāo)記基因簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)出來(lái)。 4、基因直接進(jìn)入細(xì)胞的概率很低；,8,作為載體必須具備哪些條件,1）能夠在受體細(xì)胞中復(fù)制，使目的基因穩(wěn)定存在。 2）具一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便外源基因插入。 3）具有某些標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。,9,天然的DNA分子可以直接作為載體嗎？為什么？ 1、載體DNA必須具備自我復(fù)制能力 2、載體DNA必須具備一到多個(gè)合適的酶切位點(diǎn)供目的基因插入。 3、載體DNA必須帶有標(biāo)記基因。 4、載體DNA必須安全并大小合適。 實(shí)際上天然的DNA并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造。,10,一.目的基因的獲取,1、目的基因主要是指 ____________________也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,3、常用方法：,,人工合成法,,反轉(zhuǎn)錄法,化學(xué)合成法,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,從基因文庫(kù)中獲取,2、獲得途徑,,從自然界已有物種中分離,人工方法合成,11,基因文庫(kù),,基因組文庫(kù),部分基因文庫(kù) （如:cDNA文庫(kù)）,基因文庫(kù)？,(1) 從基因文庫(kù)中獲取目的基因,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù),12,基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較P10表,小,大,有,無(wú),有,無(wú),某種生物的全部基因,某種生物的部分基因,部分基因可以,可以,13,（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,1、定義：PCR——多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一項(xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。 通過(guò)此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。,DNA復(fù)制,2、原理：,3、條件：,4、過(guò)程：,一段已知目的基因的核苷酸序列,一對(duì)引物；模板DNA；dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；,6、儀器：,PCR擴(kuò)增儀,根據(jù)這一序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物,為什么？,14,PCR反應(yīng)過(guò)程,PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。 退火溫度過(guò)高會(huì)破壞_________的堿基配對(duì)。退火溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)， 長(zhǎng)度相同但____________的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。,引物與模板 GC含量高,15,（3）人工合成 原理 （2條？）,反轉(zhuǎn)錄法：,目的基因的mRNA,雜交雙鏈 (單鏈RNA/單鏈DNA),單鏈DNA,逆轉(zhuǎn)錄酶,,,,DNA聚合酶,雙鏈DNA (cDNA),根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的脫氧核苷酸序列,推測(cè),推測(cè),,,目的基因,化學(xué)合成,,16,3.基因表達(dá)載體的組成：,a、目的基因,b、啟動(dòng)子,c、終止子,d、標(biāo)記基因 為什么不能將基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞？,,位于基因的首端,是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)。,位于基因的尾端,終止轉(zhuǎn)錄。,鑒別并篩選含有目的基因的受體細(xì)胞。,2、基因表達(dá)載體的作用,,a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代,b、同時(shí)使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用,17,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,目的基因進(jìn)入_____ ____內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_ ___和___ __的過(guò)程。,轉(zhuǎn)化:,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),1、導(dǎo)入植物細(xì)胞:,2、導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞:,3、導(dǎo)入微生物細(xì)胞:,常用方法：,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細(xì)胞法（或Ca2+轉(zhuǎn)化法）,18,1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,特點(diǎn):,,能感染雙子葉植物和祼子植物,對(duì)單子葉植物無(wú)感染能力,Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體DNA上,,轉(zhuǎn)化過(guò)程:,Ti質(zhì)粒 目的基因,構(gòu)建,表達(dá)載體,植物細(xì)胞,植物細(xì)胞染色DNA,新性狀,農(nóng)桿菌,農(nóng)桿菌的作用？,19,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,常用法：,常用受體細(xì)胞：大腸桿菌,微生物作受體細(xì)胞原因： 繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少,過(guò)程：,Ca2+處理大腸桿菌,,感受態(tài)細(xì)胞,,表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合,,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA,（用Ca2+處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性）,,感受態(tài)細(xì)胞法（或Ca2+轉(zhuǎn)化法）,為什么把大腸桿菌處理成 感受態(tài)細(xì)胞？,20,(1)________________→目的基因的有無(wú)， 。。關(guān)鍵 (2)分子雜交技術(shù)→_________________ 是否發(fā)揮作用的第一步 (3)_______________→目的基因是否翻譯 (4)生物性狀的表達(dá)與否 抗蟲(chóng)抗病接種實(shí)驗(yàn)抗逆實(shí)驗(yàn)，蛋白質(zhì)功能活性的比較(個(gè)體水平),DNA分子雜交技術(shù),目的基因是否轉(zhuǎn)錄,抗原—抗體雜交,,分子水平,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定 每項(xiàng)技術(shù)原理是什么？,21,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,1、導(dǎo)入檢測(cè),目的：,方法：,DNA分子雜交技術(shù),過(guò)程：,①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA ②.將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針。 ③使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,22,從轉(zhuǎn)基因生物中提取的基因組DNA,探針：,雜交的對(duì)象：,用放射性同位素標(biāo)記的含目的基因的DNA片段,15N,15N,14N,探針,轉(zhuǎn)基因生 物的DNA,變性,變性,,,,,,,14N,,,,23,2、轉(zhuǎn)錄檢測(cè),目的：,檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,方法：,分子雜交技術(shù),用放射性同位素標(biāo)記的含目的基因的 DNA片段,探針：,雜交的對(duì)象：,從轉(zhuǎn)基因生物中提取的mRNA.,24,3、翻譯檢測(cè),目的：,檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),方法:,抗原抗體雜交技術(shù),從轉(zhuǎn)基因生物中提取的蛋白質(zhì),抗原：,抗體：,將目的基因編碼的蛋白質(zhì)注射進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行免疫產(chǎn)生的相應(yīng)抗體,4、個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定,25,課本24 用于基因治療的基因種類 ①正?；颍簭慕】等梭w上分離得到的功能正常的基因，用以取代病變基因，或依靠其表達(dá)產(chǎn)物。 ②反義基因。即通過(guò)產(chǎn)生的mRNA分子，與病變基因產(chǎn)生的mRNA 進(jìn)行互補(bǔ)，來(lái)阻斷非正常蛋白質(zhì)的合成。 ③自殺基因：即編碼可以殺死癌變細(xì)胞的蛋白酶基因。,26,(4)對(duì)天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，應(yīng)該直接對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行操作，還是通過(guò)對(duì)基因的操作來(lái)實(shí)現(xiàn)？______________________。 原因是：________________________________。,應(yīng)該通過(guò)對(duì)基因的操作來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)天然蛋白質(zhì)的改造,首先，天然蛋白質(zhì)都是由基因編碼的，改造了基因也就是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行了改造，而且改造過(guò)的蛋白質(zhì)可以通過(guò)改造過(guò)的基因遺傳下去。 如果對(duì)蛋白質(zhì)直接改造，一方面蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，改造困難，即使改造成功，被改造過(guò)的蛋白質(zhì)分子也無(wú)法遺傳；其次，對(duì)基因進(jìn)行改造比對(duì)蛋白質(zhì)直接進(jìn)行改造要容易操作，難度要小得多。,27,①獲取目的基因（例如血清白蛋白基因） ②構(gòu)建基因表達(dá)載體（在血清白蛋白基因前加特異表達(dá)的啟動(dòng)子） ③顯微注射導(dǎo)入哺乳動(dòng)物受精卵中 ④形成胚胎 ⑤將胚胎送入母體動(dòng)物 ⑥發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（只有在產(chǎn)下的雌性個(gè)體中，轉(zhuǎn)入的基因才能表達(dá)）。,思考:用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)人類血清白蛋白的操作過(guò)程是怎樣的？,乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)：①產(chǎn)量高；②質(zhì)量好； ③成本低；④易提取。,,28,