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分子生物學(xué)實驗報告 實驗名稱：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 班級：生工xxx 姓名：xxx 同組人：xxx 學(xué)號：xxxx 日期：xxxx SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 引言 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）是目前分離蛋白質(zhì)亞基并測定其分子量的常用方法，為檢測電泳后凝膠中的蛋白質(zhì)，一般使用考馬斯亮藍(lán)（CBB）染色[1]。本次實驗的目的在于學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質(zhì)的操作技術(shù)。 2 材料和方法 2.1 實驗原理 2.1.1 聚丙烯酰胺凝膠的性能及制備原理 2.1.1.1 性能 聚丙烯酰胺凝膠的機(jī)械性能好，有彈性，透明，相對地化學(xué)穩(wěn)定，對pH和溫度變化比較穩(wěn)定，在很多溶劑中不溶，是非離子型的，沒有吸附和電滲作用。通過改變濃度和交聯(lián)度，可以控制孔徑在廣泛的范圍內(nèi)變動，并且制備凝膠的重復(fù)性好。由于純度高和不溶性，因此還適于少量樣品的制備，不致污染樣品。 2.1.1.2 制備原理 聚丙烯酰胺凝膠是用丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化系統(tǒng)有化學(xué)聚合和光聚合兩種。本實驗是用化學(xué)聚合。化學(xué)聚合的催化劑通常多采用過硫酸銨（AP）或過硫酸鉀，此外還需要一種脂肪族叔胺作加速劑，最有效的加速劑是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。在叔胺的催化下，由過硫酸銨形成氧的自由基，后者又使單體形成自由基，從而引發(fā)聚合反應(yīng)。叔胺要處于自由堿基狀態(tài)下才有效，所以在低pH時，常會延長聚合時間；分子氧阻止鏈的延長，妨礙聚合作用；一些金屬也能抑制聚合；冷卻可以使聚合速度變慢。通?？刂七@些因素使聚合在1小時內(nèi)完成，以便使凝膠的性質(zhì)穩(wěn)定。 聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳有兩種系統(tǒng)，即只有分離膠的連續(xù)系統(tǒng)和有濃縮膠與分離膠的不連續(xù)系統(tǒng)，不連續(xù)系統(tǒng)中最典型、國內(nèi)外均廣泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH堿性不連續(xù)系統(tǒng)，其濃縮膠丙烯酰胺濃度為4％，pH = 6.8，分離膠的丙烯酰胺濃度為12.5％，pH = 8.8。電極緩沖液的pH = 8.3，用Tris、SDS和甘氨酸配制。配膠的緩沖液用Tris、SDS和HCl配制。 樣品在電泳過程中首先通過濃縮膠，在進(jìn)入分離膠前由于等速電泳現(xiàn)象而被濃縮。這是由于在電泳緩沖液中主要存在三種陰離子，Cl－、甘氨酸陰離子以及蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物，在濃縮膠的pH值下，甘氨酸只有少量的電離，所以其電泳遷移率最小，而Cl－的電泳遷移率最大。在電場的作用下，Cl－最初的遷移速度最快，這樣在Cl－后面形成低離子濃度區(qū)域，即低電導(dǎo)區(qū)，而低電導(dǎo)區(qū)會產(chǎn)生較高的電場強(qiáng)度，因此Cl－后面的離子在較高的電場強(qiáng)度作用下會加速移動。達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，Cl－和甘氨酸之間形成穩(wěn)定移動的界面。而蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物由于相對量較少，聚集在甘氨酸和Cl－的界面附近而被濃縮成很窄的區(qū)帶（可以被濃縮三百倍），所以在濃縮膠中Cl－是快離子（前導(dǎo)離子），甘氨酸是慢離子（尾隨離子）。 當(dāng)甘氨酸到達(dá)分離膠后，由于分離膠的pH值（通常pH = 8.8）較大，甘氨酸離解度加大，電泳遷移速度變大超過蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物，甘氨酸和Cl－的界面很快超過蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物。這時蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物在分離膠中以本身的電泳遷移速度進(jìn)行電泳，向正極移動。由于蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物在單位長度上帶有相等的電荷，所以它們以相等的遷移速度從濃縮膠進(jìn)入分離膠，進(jìn)入分離膠后，由于聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質(zhì)可以容易的通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質(zhì)則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質(zhì)在電泳過程中就會根據(jù)其各自分子量的大小而被分離。溴酚藍(lán)指示劑是一個較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置。當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時，停止電泳，從平板中取出凝膠。在適當(dāng)?shù)娜旧褐校ㄈ缤ǔＪ褂玫目捡R斯亮藍(lán)）染色幾個小時，而后過夜脫色。脫色液去除凝膠中未與蛋白結(jié)合的背底染料，這時就可以清晰地觀察到凝膠中被染色的蛋白質(zhì)區(qū)帶。通常凝膠制備需要1～1.5小時，電泳在25～30mA下通常需要3小時，染色2～3小時，過夜脫色。通常使用的垂直平板電泳可以同時進(jìn)行多個樣品的電泳[2]。 2.1.1.3 凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑的關(guān)系 凝膠濃度根據(jù)被分離的物質(zhì)的分子量大小確定。當(dāng)分析一個未知樣品時，常先用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)凝膠或用4~10%的凝膠梯度來試測，而后選出適宜的凝膠濃度。凝膠的機(jī)械性能、彈性是否適中很重要，膠太軟易斷裂，；太硬則脆，也易折斷。 2.1.2 SDS-凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)分子量的原理 蛋白質(zhì)分子在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于所帶凈電荷及分子的大小和形狀等因素。如果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS和巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。 在蛋白質(zhì)溶液中加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原；SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合帶來兩個后果：第一，使各種蛋白質(zhì)的SDS-復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，使所有的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時都以同樣的電荷／蛋白質(zhì)比向正極移動；第二，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。這兩個原因使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。 選擇一系列不同分子量的球形或基本呈球形的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)物，使其形成SDS復(fù)合物。把這些復(fù)合物在相同條件下進(jìn)行電泳分離，分子量小的物質(zhì)泳動距離大，分子量大的物質(zhì)泳動距離小。測定出相對泳動率，用相對泳動率對蛋白質(zhì)的分子量的對數(shù)作圖，它們在一定范圍內(nèi)呈直線關(guān)系。因此可作為標(biāo)準(zhǔn)曲線來檢測樣品蛋白質(zhì)的分子量。 2.1.3染色原理 常用的染料主要有氨基黑10B、考馬斯亮藍(lán)R250、考馬斯亮藍(lán)G250、1-苯胺基-8-萘磺酸，各有優(yōu)缺點(diǎn)，本實驗選用考馬斯亮藍(lán)R250，它的染色靈敏度比氨基黑高5倍，尤其適用于SDS電泳微量蛋白質(zhì)染色。 2.2 實驗材料 2.2.1 試劑 所用試劑有10%SDS、30%凝膠貯液（29%ACr-1%Bis）、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、10%過硫酸銨、TEMED、pH8.3Tris-Gly電極緩沖液、上樣緩沖液、蛋白質(zhì)Maker、0.25%考馬斯亮蘭R250染色液、甲醇：醋酸脫色液、異丙醇、tris-HCl（PH6.8）緩沖液、二硫蘇糖醇、去離子水等。 2.2.2 器材 所用器材有垂直板電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、脫色搖床、50ml小燒杯、移液槍、槍頭、玻璃棒、濾紙、表面皿、手套等。 2.2 實驗方法 2.2.1 SDS聚丙烯酰胺的灌制 按說明安裝玻璃板，橡膠條放在兩玻璃板之間，確定不漏液，玻璃板放入電泳槽時，有凹槽的一側(cè)向里，時刻保持玻璃片間的壓力。 根據(jù)表1制備分離膠溶液，加入TEMED后迅速旋轉(zhuǎn)混合物，用1ml移液槍將其注入兩塊玻璃板之間的間隙中（灌制紅色板的上邊緣）。用槍在聚丙烯酰胺溶液上小心的覆蓋一層異丙醇。將凝膠垂直放于室溫下。（丙烯酰胺有神經(jīng)毒性，故操作時應(yīng)注意不要吸入其粉末，實驗時應(yīng)戴手套，剩余的聚丙烯酰胺溶液不要亂扔，待聚合后再處理） 待聚合后（40min），倒掉覆蓋層，用去離子水清洗凝膠頂部，盡可能倒掉凝膠上的液體，用濾紙吸干水分。 按表1配置濃縮膠，加完TEMED后迅速旋轉(zhuǎn)混合，注滿玻璃板間隙，插入梳子（寫有1.5mm的一側(cè)向里，先插入一側(cè)，在從一側(cè)向另一側(cè)壓著插入，以排除氣泡）將膠垂直放置于室溫下。約30min聚合完成，拔出梳子（平行拔出），用去離子水沖洗膠孔，再用濾紙吸干水。取出玻璃板，取下橡膠條。 表1分離膠與濃縮膠配制 組分 10%分離膠（ml） 5%濃縮膠（ml） H20 4.0 2.7 30%丙烯酰胺 3.3 0.67 1.5mol/LTris（PH8.8） 2.5 - 1mol/LTris(PH6.8) - 0.5 10%SDS 0.1 0.04 10%APS 0.1 0.04 TEMED(最后加) 5μl 3μl 總體積 10 4 2.2.2 電泳 樣品處理：將未加IPTG誘導(dǎo)的菌液37攝氏度搖至OD600=0.6-0.8左右，離心部分菌液分裝，分別加入適量不含DTT與含DTT的上樣緩沖液， 其余菌液加至0.5mM 濃度的IPTG 20攝氏度進(jìn)行誘導(dǎo)10h，分裝菌液離心后分別加入適量不含DTT與含DTT的上樣緩沖液。 電泳槽中加入300ml電泳緩沖液，所有樣品均需煮沸10min,然后用20μl加樣槍依次加入IPTG誘導(dǎo)前的蛋白樣品（20ul）、誘導(dǎo)前加DTT的（20ul）、誘導(dǎo)后樣品（20ul）和誘導(dǎo)后加DTT的（20ul）、蛋白Maker，其余空加入等量的上樣緩沖液。 蓋好蓋子連接電源（紅接紅，黑接黑），慢慢調(diào)節(jié)電壓至90V，進(jìn)行電泳，待指示劑達(dá)到分離膠，把電壓加到150V，至指示劑的紅色條帶移除膠體，停止電泳。 2.2.3 染色、脫色 將膠取出，并在右上角切個角，以標(biāo)記順序，放入培養(yǎng)皿中加入約40ml染色劑，放在搖床上染色1h，倒掉染色劑，先用清水洗幾次，倒掉清水，再把膠放入脫色液中，脫色一天，每隔3h換一次脫色液,最后把膠取出來瀝干水，拍照。 3 結(jié)果 凝膠經(jīng)脫色后觀察結(jié)果，拍照得到的電泳條帶如圖2所示。其中5、6、7、8條帶為本組樣品條帶，所對應(yīng)的樣品分別為：IPTG誘導(dǎo)前的蛋白質(zhì)樣品、誘導(dǎo)前加DTT的蛋白質(zhì)樣品、誘導(dǎo)后的蛋白質(zhì)樣品和誘導(dǎo)后加DTT的蛋白質(zhì)樣品。最左端的電泳條帶所對應(yīng)的樣品為蛋白質(zhì)Maker，條帶9所對應(yīng)的樣品為緩沖液。圖1為蛋白質(zhì)Marker的電泳條帶圖示。 圖1蛋白質(zhì)Maker電泳條帶圖示 圖2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果 Maker 1 2 3 4 5 6 7 8 9 4 討論 4.1 對實驗結(jié)果的分析及結(jié)論 7、8條帶和5、6條帶相比，7、8條帶的顏色更深。說明IPTG對蛋白質(zhì)有誘導(dǎo)作用，能使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化，從而更易被染色。 6、8條帶和5、7條帶相比,6、8條帶中最上方的那條帶顏色很淺，幾乎沒有。因為DTT可以將蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，用于阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵。從而將大的蛋白質(zhì)分子打斷為若干小的蛋白質(zhì)分子。所以最上方的條帶顏色很淺，也間接證明了這條帶中的蛋白質(zhì)富含半胱氨酸等能形成二硫鍵的氨基酸。 對比蛋白質(zhì)Maker電泳條帶圖示，從蛋白質(zhì)電泳條帶的整體來看，樣品中大部分蛋白質(zhì)的分子量在18.4-116kDa之間。 本次實驗的電泳條帶比較清晰，各條帶對比明顯，比較成功。 4.2 影響電泳分離的主要因素[2] 4.2.1 待分離生物大分子的性質(zhì) 待分離生物大分子所帶的電荷、分子大小和性質(zhì)都會對電泳有明顯影響。一般來說，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。 4.2.2 電場強(qiáng)度 電場強(qiáng)度（V/cm）是每厘米的電位降，也稱電位梯度。電場強(qiáng)度越大，電泳速度越快。但增大電場強(qiáng)度會引起通過介質(zhì)的電流強(qiáng)度增大，而造成電泳過程產(chǎn)生的熱量增大。電流在介質(zhì)中所做的功絕大部分都轉(zhuǎn)換為熱，因而引起介質(zhì)溫度升高，這會造成以下影響：①樣品和緩沖離子擴(kuò)散速度增加，引起樣品分離帶的加寬；②產(chǎn)生對流，引起待分離物的混合；③如果樣品對熱敏感，會引起蛋白變性；④引起介質(zhì)粘度降低、電阻下降等等。電泳中產(chǎn)生的熱通常是由中心向外周散發(fā)的，所以介質(zhì)中心溫度一般要高于外周，尤其是管狀電泳，由此引起中央部分介質(zhì)相對于外周部分粘度下降，摩擦系數(shù)減小，電泳遷移速度增大，由于中央部分的電泳速度比邊緣快，所以電泳分離帶通常呈弓型。降低電流強(qiáng)度，可以減小生熱，但會延長電泳時間，引起待分離生物大分子擴(kuò)散的增加而影響分離效果。所以電泳實驗中要選擇適當(dāng)?shù)碾妶鰪?qiáng)度，同時可以適當(dāng)冷卻降低溫度以獲得較好的分離效果。 4.2.3 緩沖液的性質(zhì) 緩沖液的pH值會影響待分離生物大分子的解離程度，從而對其帶電性質(zhì)產(chǎn)生影響溶液pH值距離其等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大，尤其對于蛋白質(zhì)等兩性分子，緩沖液pH還會影響到其電泳方向，當(dāng)緩沖液pH大于蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，其電泳的方向是指向正極。為了保持電泳過程中待分離生物大分子的電荷以及緩沖液pH值的穩(wěn)定性，緩沖液通常要保持一定的離子強(qiáng)度，一般在0.02-0.2，離子強(qiáng)度過低，則緩沖能力差，但如果離子強(qiáng)度過高，會在待分離分子周圍形成較強(qiáng)的帶相反電荷的離子擴(kuò)散層（即離子氛），由于離子氛與待分離分子的移動方向相反，它們之間產(chǎn)生了靜電引力，因而引起電泳速度降低。另外緩沖液的粘度也會對電泳速度產(chǎn)生影響。 4.2.4 電滲 液體在電場中，對于固體支持介質(zhì)的相對移動，稱為電滲現(xiàn)象。由于支持介質(zhì)表面可能會存在一些帶電基團(tuán)，如濾紙表面通常有一些羧基，瓊脂可能會含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基團(tuán)等等。這些基團(tuán)電離后會使支持介質(zhì)表面帶電，吸附一些帶相反電荷的離子，在電場的作用下向電極方向移動，形成介質(zhì)表面溶液的流動，這種現(xiàn)象就是電滲。在pH值高于3時，玻璃表面帶負(fù)電，吸附溶液中的正電離子，引起玻璃表面附近溶液層帶正電，在電場的作用下，向負(fù)極遷移，帶動電極液產(chǎn)生向負(fù)極的電滲流。如果電滲方向與待分離分子電泳方向相同，則加快電泳速度；如果相反，則降低電泳速度。 4.2.5 支持介質(zhì)的篩孔 支持介質(zhì)的篩孔大小對待分離生物大分子的電泳遷移速度有明顯的影響。在篩孔大的介質(zhì)中泳動速度快，反之，則泳動速度慢。 4.3 凝膠電泳蛋白質(zhì)染色的其他方法 除了本次實驗用的考馬斯亮蘭染色法之外，實驗室常用的凝膠電泳蛋白質(zhì)染色的其他方法還有以下幾種： 4.3.1 銀染法[3] 銀染是迄今為止靈敏度最高的一種染色法。是對SDS - PAGE 凝膠中的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色時最常用的方法,其基本原理是銀離子與蛋白質(zhì)分子上的酸基(COO-)結(jié)合,然后銀離子被還原為自由的銀 ,可使蛋白質(zhì)條帶呈現(xiàn)深棕至黑色。銀染基本上可以分為酸性和堿性2 種方法。堿性方法非常敏感,但是需要較長的步驟。酸性方法快速但是靈敏度較低。銀染的優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高,其缺點(diǎn)在于:可能造成很高的背景,特別在水不夠純的情況下；費(fèi)時費(fèi)力(需要8～16h)；費(fèi)用昂貴；需要接觸有毒的甲醛,而且核酸、脂多糖、脂類、醣脂類化合物常會對銀染染色的結(jié)果進(jìn)行干擾。 4.3.2 熒光法[3] 針對考馬斯亮蘭染色雖然快速但是靈敏度不夠,銀染法雖然靈敏度高但是背景較高,結(jié)果容易受到核酸污染等缺點(diǎn),人們嘗試用熒光染料對凝膠中的蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行染色。這些熒光染料有Fluorescein isothiocyanate, dansyl chloride, rhodamine isothiocyanate等。這些熒光染色方法需要在電泳之前熒光染料與一定的功能基團(tuán)相結(jié)合。共價結(jié)合的熒光標(biāo)簽在蛋白質(zhì)檢測方面非常敏感,超過了考馬斯亮蘭。 4.3.3 負(fù)染法[3] 負(fù)染的原理主要是有選擇的將金屬離子沉淀在膠上,蛋白質(zhì)條帶不能被染色,因此,它們所處的位置是透明的。這種方法非常簡單快速。但是,這種方法的重復(fù)性依賴于許多物理化學(xué)因素(例如染色液的pH ,膠中陰離子的濃度、溫度等)。所以,它不能作為一種通常運(yùn)用的方法。但是,與其他方法相比,該方法允許蛋白質(zhì)保持完整并有效回收以做進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)分析。特別是在運(yùn)用咪唑鋅進(jìn)行負(fù)染時,凝膠中鋅介導(dǎo)的蛋白質(zhì)固定是完全可以逆轉(zhuǎn)的,洗脫后的蛋白質(zhì)沒有受到化學(xué)修飾,也沒有受到有機(jī)物的污染,咪唑鋅或者改進(jìn)后的咪唑- SDS - 鋅染色法靈敏度接近于銀染（1-10ng）, 重復(fù)性優(yōu)于用銅或者鋅進(jìn)行的負(fù)染。 4.4 注意事項 制備凝膠應(yīng)選用高純度的試劑，否則會影響凝膠聚合與電泳效果。 由于與凝膠聚合有關(guān)的硅橡膠條、玻璃板表面不光滑潔凈，在電泳時會造成凝膠板與玻璃板或硅橡膠條剝離，產(chǎn)生氣泡或滑膠；撥膠時凝膠板易斷裂，為防止此現(xiàn)象，所用器材均應(yīng)嚴(yán)格的清洗。 安裝電泳槽和鑲有長、短玻璃板的硅橡膠框時，位置要端正，均勻用力或用一旋緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏。樣品槽模板梳齒應(yīng)平整光滑。 用瓊脂封底及灌凝膠時不能有氣泡，以免影響電泳時電流的通過。 凝膠完全聚合后，必須放置30min 至1h，使其充分老化后才能輕輕取出樣品模槽板，切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳后區(qū)帶扭曲。 為防止電泳后區(qū)帶拖尾，樣品中鹽離子強(qiáng)度應(yīng)盡量低，含鹽量高的樣品可用透析法或凝膠過濾法脫鹽。最大加樣量不得超過100μg蛋白／100℃μL。 在不連續(xù)電泳體系中，預(yù)電泳只能在分離膠聚合后進(jìn)行，洗凈膠面后才能制備濃縮膠。濃縮膠制備后，不能進(jìn)行預(yù)電泳，以充分利用濃縮膠的濃縮效應(yīng)。 電泳時，電泳儀與電泳槽間正、負(fù)極不能接錯，以免樣品反方向泳動，電泳時應(yīng)選用合適的電流、電壓，過高或者過低都會影響電泳效果。 電泳后，應(yīng)分別收集上下貯槽的電泳緩沖液，在冰箱貯存，可用2－3次。為保證電泳結(jié)果滿意，最好使用新稀釋的緩沖液[2]。 5 參考文獻(xiàn) [1]李文蓉,許鍵,喻梅輝.幾種SDS-PAGE蛋白質(zhì)染色方法的比較[J].八一農(nóng)學(xué)院學(xué)報,1993,16(3):32-35. 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